热诱导抗原修复：一种在成年海马神经发生过程中检测与鉴定前体细胞类型的高效方法

摘要

在成年海马神经发生过程中，当静息态神经干细胞依次进展并发育为在神经环路中功能整合的神经元时，会表达一组独特的遗传标记。通过热诱导抗原修复技术，可更有效地识别那些原本难以检测的前体细胞类型。

摘要

组织固定后的传统免疫组织化学（IHC）方法可用于可视化多种细胞类型。这些方法通常通过应用抗体结合抗原，识别具有特定生物学和发育特征的细胞。成年海马神经发生是一个连续过程，其中静息态的神经干细胞可被激活，并依次经历增殖、分化、成熟和功能整合等阶段。每个阶段均具有独特的形态学特征和特定基因的上调表达。识别这些阶段对于理解调控机制以及该过程中潜在的病理生理改变至关重要。我们采用的热诱导抗原修复方法增强了检测信号的强度，能够准确鉴定前体细胞类型。如本文所述，该方法尤其有助于克服当前在某些前体细胞类型检测中存在的问题。

引言

神经发生是指由神经干细胞生成新神经元的过程，现已证实这一过程在成年期仍持续存在于大脑的两个特化区域：嗅球的室下区（SVZ）以及海马体齿状回的颗粒下区（SGZ）。在过去十年中，成年海马体神经发生领域取得了大量重要进展。由于SGZ中的新生神经元有助于增强神经可塑性，从而维持特定的大脑功能^1-5，该区域引起了广泛关注。成年海马体神经发生被认为在情绪调节、再生以及学习与记忆过程中发挥重要作用。因此，科研人员正致力于系统阐明这一丰富神经发生微环境中神经元的发育及其调控机制。

研究成体海马神经发生时，一个不可避免且重要的方面是识别激活的神经干细胞在发育为完全功能性神经元过程中所经历的不同阶段。在此过程中，静息态的神经干细胞被激活，并依次经历一系列早期活跃和晚期活跃的前体细胞类型（图1）。这些不同的神经前体细胞群体可通过其形态特征以及分子标志物的表达来识别，例如 MCM2、nestin、Tbr2、Doublecortin（DCX）和 NeuN，这些标志物指导 RGL 细胞向各自对应的前体细胞类型转化。Nestin 是一种中间丝蛋白，在放射状胶质样细胞及部分早期前体细胞类型中均有表达。另一个标志物 Tbr2 特异性表达于扩增型前体细胞中。Tbr2 转基因的表达在 1 型细胞（放射状胶质样细胞）中最初处于关闭状态，在 2a 型、2ab 型和 2b 型前体细胞中开启，并在进一步分化的 3 型细胞及未成熟神经元中再次关闭（图1....

方案

1. 免疫组织化学前处理：灌注与组织学

1. 按照适用于小鼠的通用经心脏灌注方案灌注小鼠，并将脑组织取出后置于4%多聚甲醛（PFA）中⁹。
2. 将脑组织在PFA中于4 °C下放置过夜（例如，置于装满PFA的10 ml锥形管中）。完全固定需在PFA中保存至少12–24小时，但不得超过36小时。过夜固定后，倒出锥形管中的PFA，保留脑组织在管内。向管中加入30%蔗糖，短暂清洗5秒以去除残留的PFA。最后，再次用30%蔗糖充满含有脑组织的锥形管。将脑组织在4 °C下保存于蔗糖溶液中，直至脑组织沉降至管底。
3. 使用切片机切割40 μm厚的脑组织切片。参考小鼠脑图谱，从齿状回起始处开始收集切片，直至其末端。将切片保存于抗冻溶液中（一种简单配方为：500 ml 0.1 M PBS中含300 g蔗糖和300 ml乙二醇），直至进行免疫组织化学实验时取出使用。
4. 将切割的组织贴附于专为牢固黏附组织而设计的载玻片上。此类载玻片可在煮沸步骤中有效防止组织脱落。组织贴附后，让载玻片干燥10分钟或直至完全干燥。若将载玻片垂直放置，其底边接触纸巾，可加快干燥速度。若同时处理多个载玻片，其余载玻片可在该时间段内（1–2小时为宜）保持干燥状态，待后续步骤准备就绪后再继续操作。
5. 载玻片完全干燥后，用PBS洗涤三次，每次5分钟，随后再次干燥（PBS缓冲液 = 0.137 M NaCl，0.0027 M KCl，0.0119 M Na

结果

成年海马神经发生是一个连续的过程，每个阶段的代表性前体细胞类型可通过多种标记物的组合来鉴定。精细的化学固定和抗原修复可提高原本难以检测的标记物的有效性和可及性。其中一种标记物是巢蛋白（nestin），它在放射状胶质样神经干细胞以及某些早期活跃的前体细胞类型中表达。巢蛋白在鉴定早期前体细胞类型时可能具有关键作用，因为当干细胞或前体细胞进一步分化为成熟神经元时，其表达会消失。

成年海马神经发生在SGZ中依次进行过程的示意图如图所示 图1A分为有丝分裂期和有丝分裂后阶段。图中显示了可用于识别各阶段细胞的遗传标记物的表达谱。放射状胶质样神经干细胞可通过其表达的GFAP和巢蛋白（nestin）进行鉴定，后者是一种构成放射状突起的中间丝蛋白。静息态和活跃分裂的放射状胶质样细胞可通过其表达的增殖标志物MCM2进行识别，该蛋白在有丝分裂期前体细胞类型中表达。中间前体细胞或称短暂扩增前体细胞表达多种可用于鉴定的标志物，包括在早期活跃前体细胞中短暂表达的Tbr2、神经元成熟标志物DCX以及成熟神经元标志物NeuN。利用这三种标志物的组合，我们标记出不同类型的短暂扩增细.......

讨论

成功进行前体细胞类型抗原修复和染色最关键的步骤是：1）使用灌注良好且固定充分、厚度适宜的冠状组织切片；2）在抗原修复过程中保证足够的煮沸时间及随后的冷却时间；3）在封片时具备熟练的手工操作技巧，以正确安装固定的冠状切片并防止其受损。

在免疫组织化学（IHC）中，使用经过充分固定但未过度固定的灌注组织至关重要。一个主要难点可能是抗原对抗体的可及性受限。我们的方法旨在提高抗原的可及性。手术过程中对动物进行正确灌注以及后续的固定是至关重要的第一步。在本方案中，我们在取出脑组织前，确保4%多聚甲醛（PFA）灌注至少持续5分钟。随后，我们认为将取出的脑组织在4% PFA中继续固定至少12小时（过夜）至最多24–36小时是必要的。此为PFA固定的最佳时长，更长时间可能导致组织过度固定，从而引入更多的蛋白质交联。PFA固定后，脑组织可在蔗糖溶液中保存无限期，而不会影响组织活性。当准备进行组织学分析时，组织切片的厚度起着重要作用。 hippocampal 脑组织必须在切割前完全冷冻，以保持切片厚度的一致性和结构的完整性。我们采用40–60 μm厚度的切片用于IHC。选择该厚度主要基于两点原因：1）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SuperFrost Plus 载玻片	Fisherbrand	12-550-15	在煮沸过程中提供对海马组织的强效黏附
PVA/DABCO 封片介质	Sigma Aldrich	10981-100 ml
Nestin（鸡源）	Aves Lab	NES	神经干细胞标志物
GFAP（兔源）	Dako North America	Z033401-2	星形胶质细胞及神经干细胞标志物
MCM2（小鼠源）	BD Transduction Laboratory	610701	增殖标志物
DCX（山羊源）	Santa Cruz Biotechnology	SC8066	未成熟神经元标志物
Tbr2（兔源）	Abcam	Ab23345	扩增性前体细胞标志物
NeuN（小鼠源）	Millipore	MAB377	成熟神经元标志物
Cy2（抗兔）	Jackson Immunoresearch	111-226-047
Cy2（抗鸡）	Jackson Immunoresearch	303-165-006
Cy5（抗小鼠）	Jackson Immunoresearch	315-175-047
Cy5（抗山羊）	Jackson Immunoresearch	305-165-047
DAPI	Life Technologies Corporation	D1306
Dako 防水笔	S2002	Dako	防水笔