热诱导抗原修复：一种在成年海马神经发生过程中检测与鉴定前体细胞类型的高效方法

摘要

在成年海马神经发生过程中，当静息态神经干细胞依次进展并发育为在神经环路中功能整合的神经元时，会表达一组独特的遗传标记。通过热诱导抗原修复技术，可更有效地识别那些原本难以检测的前体细胞类型。

摘要

组织固定后的传统免疫组织化学（IHC）方法可用于可视化多种细胞类型。这些方法通常通过应用抗体结合抗原，识别具有特定生物学和发育特征的细胞。成年海马神经发生是一个连续过程，其中静息态的神经干细胞可被激活，并依次经历增殖、分化、成熟和功能整合等阶段。每个阶段均具有独特的形态学特征和特定基因的上调表达。识别这些阶段对于理解调控机制以及该过程中潜在的病理生理改变至关重要。我们采用的热诱导抗原修复方法增强了检测信号的强度，能够准确鉴定前体细胞类型。如本文所述，该方法尤其有助于克服当前在某些前体细胞类型检测中存在的问题。

引言

神经发生是指由神经干细胞生成新神经元的过程，现已证实这一过程在成年期仍持续存在于大脑的两个特化区域：嗅球的室下区（SVZ）以及海马体齿状回的颗粒下区（SGZ）。在过去十年中，成年海马体神经发生领域取得了大量重要进展。由于SGZ中的新生神经元有助于增强神经可塑性，从而维持特定的大脑功能^1-5，该区域引起了广泛关注。成年海马体神经发生被认为在情绪调节、再生以及学习与记忆过程中发挥重要作用。因此，科研人员正致力于系统阐明这一丰富神经发生微环境中神经元的发育及其调控机制。

研究成体海马神经发生时，一个不可避免且重要的方面是识别激活的神经干细胞在发育为完全功能性神经元过程中所经历的不同阶段。在此过程中，静息态的神经干细胞被激活，并依次经历一系列早期活跃和晚期活跃的前体细胞类型（图1）。这些不同的神经前体细胞群体可通过其形态特征以及分子标志物的表达来识别，例如 MCM2、nestin、Tbr2、Doublecortin（DCX）和 NeuN，这些标志物指导 RGL 细胞向各自对应的前体细胞类型转化。Nestin 是一种中间丝蛋白，在放射状胶质样细胞及部分早期前体细胞类型中均有表达。另一个标志物 Tbr2 特异性表达于扩增型前体细胞中。Tbr2 转基因的表达在 1 型细胞（放射状胶质样细胞）中最初处于关闭状态，在 2a 型、2ab 型和 2b 型前体细胞中开启，并在进一步分化的 3 型细胞及未成熟神经元中再次关闭（图1）。DCX 是一种神经元迁移标志物，在 2ab 型、2b 型和 3 型神经前体细胞中表达。利用这三种标志物的组合，我们可以标记出不同的神经前体细胞亚型，包括：1 型（MCM2+nestin+Tbr2−）、2a 型（MCM2+nestin+Tbr2+）、2ab 型（部分为 MCM2+nestin−Tbr2+ 和部分为 MCM2+Tbr2+DCX−）、2b 型（MCM2+Tbr2+DCX+）以及 3 型（MCM2+Tbr2−DCX+）。对于有丝分裂后的细胞，如未成熟神经元及功能上已整合的神经元，则可通过 DCX 与成熟神经元标志物 NeuN 进行识别。

传统的免疫组织化学（IHC）方法利用抗体根据特定细胞类型的基因表达来识别相应抗原。随后可通过高分辨率成像技术（如共聚焦显微镜）进行可视化，以实现细胞鉴定。然而，目前这些方法存在一些问题，导致难以有效识别放射状胶质样细胞及早期前体细胞类型。识别这些特定细胞类型较为困难的原因在于，所用抗体无法充分穿透并有效结合巢蛋白（nestin）。巢蛋白是一种中间丝蛋白，构成放射状胶质样细胞所延伸的放射状突起的主要成分。抗体与抗原结合效率低下可能由多种因素造成，包括固定时间、温度以及所采用的固定技术^6-7。为解决此类问题，我们开发了一种抗原修复（即“煮沸”）方法。除巢蛋白外，该抗原修复方法还可改善其他标记物的染色效果，如Ki67、BrdU、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、Tbr2和MCM2。本方法结合了化学与物理手段：首先使用多聚甲醛对组织进行化学固定，随后将薄层冠状海马切片置于含有变性剂和促变剂的缓冲液中进行高温煮沸处理。该过程可增强抗原对抗体的可及性，提高抗体特异性，从而实现对前体细胞类型的更佳识别。本方法操作简便，所需工具和试剂大多为实验室常规配备。我们已广泛采用该方法研究神经干细胞的发育过程，以及其受内在遗传因素或外在环境因素调控的机制⁸。

方案

1. 免疫组织化学前处理：灌注与组织学

1. 按照适用于小鼠的通用经心脏灌注方案灌注小鼠，并将脑组织取出后置于4%多聚甲醛（PFA）中⁹。
2. 将脑组织在PFA中于4 °C下放置过夜（例如，置于装满PFA的10 ml锥形管中）。完全固定需在PFA中保存至少12–24小时，但不得超过36小时。过夜固定后，倒出锥形管中的PFA，保留脑组织在管内。向管中加入30%蔗糖，短暂清洗5秒以去除残留的PFA。最后，再次用30%蔗糖充满含有脑组织的锥形管。将脑组织在4 °C下保存于蔗糖溶液中，直至脑组织沉降至管底。
3. 使用切片机切割40 μm厚的脑组织切片。参考小鼠脑图谱，从齿状回起始处开始收集切片，直至其末端。将切片保存于抗冻溶液中（一种简单配方为：500 ml 0.1 M PBS中含300 g蔗糖和300 ml乙二醇），直至进行免疫组织化学实验时取出使用。
4. 将切割的组织贴附于专为牢固黏附组织而设计的载玻片上。此类载玻片可在煮沸步骤中有效防止组织脱落。组织贴附后，让载玻片干燥10分钟或直至完全干燥。若将载玻片垂直放置，其底边接触纸巾，可加快干燥速度。若同时处理多个载玻片，其余载玻片可在该时间段内（1–2小时为宜）保持干燥状态，待后续步骤准备就绪后再继续操作。
5. 载玻片完全干燥后，用PBS洗涤三次，每次5分钟，随后再次干燥（PBS缓冲液 = 0.137 M NaCl，0.0027 M KCl，0.0119 M Na₂PO₄）。此步骤可充分去除先前的化学物质（如抗冻保存液中的甘油），避免影响组织与载玻片的黏附性。

2. 试剂与小型设备的准备

1. 配制溶液A（0.1 M 或 19.21 g/L 柠檬酸）和溶液B（0.1 M 或 24.9 g/L 三钠柠檬酸），用于煮沸组织切片。
2. 在量筒中混合9 ml溶液A和41 ml溶液B，向该混合液中加入450 ml ddH₂O。
3. 将此混合液倒入一个可微波加热的空容器（e.g. 空的移液枪头盒）中。

3. 热诱导抗原修复

1. 将步骤2中制备的溶液在标准微波炉设置下煮沸5分钟。溶液将在100 °C或更高温度下开始沸腾。
2. 煮沸完成后，小心地将容器从微波炉中取出，并将干燥的载玻片放入其中，确保带有海马体切片的一面朝下并完全暴露于液体中。如有可能，将载玻片倾斜靠在容器壁上，并将其他载玻片围绕其堆放。确保载玻片在容器内的"贴合"紧密，避免载玻片之间发生移动。
3. 将此混合物连同载玻片一起在标准微波炉设置下继续煮沸7分钟。在此期间，溶液将在100 °C或更高温度下沸腾。
4. 在煮沸过程中，准备两个冰桶，各装入半桶冰块。
5. 步骤3.3的煮沸完成后，将容器从微波炉中取出，并放入其中一个冰桶中。将另一个冰桶中的剩余冰块全部倒在容器周围，并完全覆盖容器。静置1小时。

4. 一抗与二抗染色

1. 1小时等待期结束后，将载玻片从容器中取出，用TBS-T缓冲液洗涤3次，每次5分钟。可使用任何设备进行这些基本洗涤步骤。（缓冲液TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl；TBS-T = 含0.05% Triton X-100的TBS缓冲液；TBS-TT = 含4%驴血清的TBS-T缓冲液）
2. 洗涤后，将载玻片置于避光处干燥（例如 在实验台抽屉内，将一张纸巾放入抽屉中，并将载玻片倾斜靠在纸巾上，静置5–10分钟，或直至载玻片完全干燥。在此期间，准备用于过夜一抗孵育的染色湿盒。简易染色湿盒可由一个具有较大表面积的容器构成，容器内加入ddH₂O₂O 和容器内的一个载物台，载物台上可放置载玻片，使其位于 ddH₂O 上方₂O.
3. 载玻片干燥后，使用疏水笔在组织切片周围画出轮廓。在步骤4.5中，该轮廓可作为屏障，防止抗体混合液溢出。
4. 在 TBS-TT 中配制一抗混合液。每张载玻片至少需要 500 μl 以完全覆盖，例如，若一抗储存浓度为 1:500，则将 1 μl 特定一抗加入 500 μl TBS-TT 中。所用一抗详见试剂表。
5. 将干燥的载玻片放置于染色缸的载物台上。缓慢加入500 μl一抗溶液，确保完全覆盖载玻片表面。盖好整个装置，并用铝箔纸包裹以避光。室温下孵育过夜。
6. 第二天，用 TBS-T 缓冲液将玻片洗涤三次，每次 5 分钟。按照步骤 4.2 中所述，在避光处自然干燥。
7. 参照试剂表中的二抗信息，配制二抗混合液，步骤与4.4类似。
8. 将干燥的载玻片按步骤4.2和4.5所述放入染色盒中。缓慢加入500 μl二抗，确保完全覆盖载玻片表面。用铝箔纸包裹染色盒，避免光照。室温下避光孵育至少2小时。
9. 二抗孵育结束后，用 TBS-T 缓冲液洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。将载玻片置于避光处自然晾干。干燥后，滴加封片液，并小心加盖盖玻片，避免产生气泡。将载玻片置于避光处静置至少 2 小时，再进行后续分析。
10. 对染色组织进行延时或共聚焦分析。

结果

成年海马神经发生是一个连续的过程，每个阶段的代表性前体细胞类型可通过多种标记物的组合来鉴定。精细的化学固定和抗原修复可提高原本难以检测的标记物的有效性和可及性。其中一种标记物是巢蛋白（nestin），它在放射状胶质样神经干细胞以及某些早期活跃的前体细胞类型中表达。巢蛋白在鉴定早期前体细胞类型时可能具有关键作用，因为当干细胞或前体细胞进一步分化为成熟神经元时，其表达会消失。

成年海马神经发生在SGZ中依次进行过程的示意图如图所示 图1A分为有丝分裂期和有丝分裂后阶段。图中显示了可用于识别各阶段细胞的遗传标记物的表达谱。放射状胶质样神经干细胞可通过其表达的GFAP和巢蛋白（nestin）进行鉴定，后者是一种构成放射状突起的中间丝蛋白。静息态和活跃分裂的放射状胶质样细胞可通过其表达的增殖标志物MCM2进行识别，该蛋白在有丝分裂期前体细胞类型中表达。中间前体细胞或称短暂扩增前体细胞表达多种可用于鉴定的标志物，包括在早期活跃前体细胞中短暂表达的Tbr2、神经元成熟标志物DCX以及成熟神经元标志物NeuN。利用这三种标志物的组合，我们标记出不同类型的短暂扩增细...

讨论

成功进行前体细胞类型抗原修复和染色最关键的步骤是：1）使用灌注良好且固定充分、厚度适宜的冠状组织切片；2）在抗原修复过程中保证足够的煮沸时间及随后的冷却时间；3）在封片时具备熟练的手工操作技巧，以正确安装固定的冠状切片并防止其受损。

在免疫组织化学（IHC）中，使用经过充分固定但未过度固定的灌注组织至关重要。一个主要难点可能是抗原对抗体的可及性受限。我们的方法旨在提高抗原的可及性。手术过程中对动物进行正确灌注以及后续的固定是至关重要的第一步。在本方案中，我们在取出脑组织前，确保4%多聚甲醛（PFA）灌注至少持续5分钟。随后，我们认为将取出的脑组织在4% PFA中继续固定至少12小时（过夜）至最多24–36小时是必要的。此为PFA固定的最佳时长，更长时间可能导致组织过度固定，从而引入更多的蛋白质交联。PFA固定后，脑组织可在蔗糖溶液中保存无限期，而不会影响组织活性。当准备进行组织学分析时，组织切片的厚度起着重要作用。 hippocampal 脑组织必须在切割前完全冷冻，以保持切片厚度的一致性和结构的完整性。我们采用40–60 μm厚度的切片用于IHC。选择该厚度主要基于两点原因：1）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SuperFrost Plus 载玻片	Fisherbrand	12-550-15	在煮沸过程中提供对海马组织的强效黏附
PVA/DABCO 封片介质	Sigma Aldrich	10981-100 ml
Nestin（鸡源）	Aves Lab	NES	神经干细胞标志物
GFAP（兔源）	Dako North America	Z033401-2	星形胶质细胞及神经干细胞标志物
MCM2（小鼠源）	BD Transduction Laboratory	610701	增殖标志物
DCX（山羊源）	Santa Cruz Biotechnology	SC8066	未成熟神经元标志物
Tbr2（兔源）	Abcam	Ab23345	扩增性前体细胞标志物
NeuN（小鼠源）	Millipore	MAB377	成熟神经元标志物
Cy2（抗兔）	Jackson Immunoresearch	111-226-047
Cy2（抗鸡）	Jackson Immunoresearch	303-165-006
Cy5（抗小鼠）	Jackson Immunoresearch	315-175-047
Cy5（抗山羊）	Jackson Immunoresearch	305-165-047
DAPI	Life Technologies Corporation	D1306
Dako 防水笔	S2002	Dako	防水笔