Method Article

发展多深的圆形横截面微内皮化的一个芯片的程序

DOI:

10.3791/50771

⸱

October 21st, 2013

 ,  ,  , 
1Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, University of California at Riverside

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Â微通道上的一个芯片平台开发回流焊的光致抗蚀剂光刻技术，软光刻技术和微流体的结合。模拟的三维（3D）的几何形状在体内微血管内皮化的微通道平台，控制连续灌注流量下运行，允许高品质和实时成像，并可以应用对微血管研究。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

努力一直专注于发 ​​展在体外实验研究微血管，因为动物体内研究更费时，昂贵，观察和量化是非常具有挑战性的。然而，传统的在体外微血管检测体内微血管代表相对于三维（3D）的几何形状，并提供连续的流体流动的限制。使用回流焊的光致抗蚀剂光刻技术，软光刻技术，以及微流控芯片的组合，我们已经制定了多深的圆形横截面内皮化微的芯片，它模仿3D几何体内微血管和运行控制连续灌注下流程。使用了一个正的回流的光致抗蚀剂，制作母模的半圆形横截面的微通道网络。由对准和粘接的聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微通道REPL从主模具icated，的圆柱形微通道网络已创建。微通道的直径可以得到很好的控制。此外，原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）表明，在芯片内接种细胞排列的微通道的内表面上为4天至2周之间的时间周期根据控制灌注持久。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微血管，作为流通体系的一部分，调解血液和组织之间的相互作用，支持新陈代谢活动，定义组织微环境，在许多健康和病理条件下发挥了关键作用。再演在体外的功能微血管提供了一个平台，为研究复杂的血管现象。然而，传统的在体外微血管检测，如内皮细胞迁移测定，内皮细胞管腔形成的测定中，大鼠和小鼠的主动脉环测定，无法重新创建的三维（3D）的几何形状和连续的流量控制相对于体内微血管1-8。微血管的研究使用的动物模型中和在体内测定，如角膜血管生成法，鸡胚尿囊膜血管生成实验，Matrigel栓实验，是更费时，成本高，相对于观察和量化挑战，并引发伦理问题1，9-13。

显微制造和微流控芯片技术的进展已启用了各种各样的见解，到生物医学科学在削减高的实验与动物体内研究，如容易和严格控制的生物条件和动态流体环境中，不会有相关的成本和复杂性的同时一直未能与传统的大容量的技术。

在这里，我们提出了一种方法来构建内皮化微通道上的单芯片模拟3D几何体内微血管和控制的连续灌流采用回流焊的光致抗蚀剂光刻技术，软光刻技术和微流体的结合下运行。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。光致抗蚀剂光刻制作模具师傅

以下协议显示制程制作的微通道直径在30-60微米之间。为了得到一个更小的直径（小于30微米），一个单一的光致抗蚀剂的旋涂的微通道是必要的。

  1. 转移从冰箱中在4℃下回流的光致抗蚀剂的洁净室在使用前24小时，并允许其升温至室温。
  2. 清洁硅片上并烘烤1小时，在150℃下使其脱水。脱水将协助光致抗蚀剂的硅衬底的粘附性。
  3. 旋涂第一层的光致抗蚀剂中使用下述配方:
步骤 时间（秒） 转速（rpm） 促进
1 2 300 最高
2 10 0
3 3 300 最高
4 60 600 最高
5 10 500 最高
6 10 600 最高
  1. 然后，在加热板上的温度为110℃，持续90秒烘烤晶片。软后烘烤的光致抗蚀剂的厚度是20-30微米。
  2. 旋涂光致抗蚀剂后，使用相同的配方，用于第一层的第二层。
  3. 软烤晶片，再通过将其放置在加热板上，在110℃的温度下，持续90秒。在此之后软烘焙光致抗蚀剂的厚度是40-60微米。
  4. 产生正面主图案露出photorESIST 14500兆焦耳/厘米2的曝光量，通过UV光的膜掩模。
  5. 稀释用的去离子（DI）水（1:2（体积/体积））的显影剂。重复冲洗晶片，在溶液中，直至图案被充分发展。然后用去离子水清洗晶圆，使用氮气和干燥。
  6. 回流焊:晶片放置在加热板上，用温度为120℃，4分钟和盖的玻璃培养皿中，以防止溶剂蒸发。从加热板上取下晶片，并使其冷却至室温。回流焊后的光致抗蚀剂的厚度为50-60微米。

2。软光刻技术制作PDMS微通道网络

  1. 准备按重量比为10:1（基料:固化剂）和聚二甲基硅氧烷（PDMS）的解决方案，彻底混合使用行星离心混合器。
  2. 到回流的光致抗蚀剂母模铸造的PDMS解决方案。在干燥器中15分钟进行脱气，将浇铸的硅橡胶。使用氮气，以去除任何剩余的气泡，如果必要的。
  3. 烤的PDMS在烘箱中在60℃的温度下3小时，以允许其固化。从主模，然后取出固化硅橡胶层。
  4. 使用削尖的打孔器，创建入口/出口孔打孔渠道网络。使用氮气清洁的PDMS表面。
  5. 30秒内的等离子清洗机在操作压力4.5×10 -2乇，氧流量为3.5英尺3 /分氧等离子体处理将两个PDMS层。然后，对准的PDMS表面，在光学显微镜下手动。使用一滴水，如果需要更好地控制对齐。
  6. 烘烤设备，在烘箱中在60℃下30分钟，以实现永久性粘接。

3。脐静脉内皮细胞的培养和幼苗在芯片

  1. 培养的人脐静脉内皮细胞与培养液中补充10％胎牛血清（FBS），L-谷氨酰胺的。日ê实验2和5之间的通道被使用。
  2. 一旦融合的人脐静脉内皮细胞，计数细胞，收获他们首先用HEPES缓冲盐溶液（HEPES-BSS）冲洗细胞，然后把细胞用胰蛋白酶/ EDTA和孵育在37℃下2-6分钟胰蛋白酶消化完成后，用胰蛋白酶中和溶液中的胰蛋白酶/ EDTA。离心，悬浮细胞培养基中的8％右旋糖酐收集它们。葡聚糖用于增加介质的粘度，以帮助更好的细胞播种和附件。
  3. 治疗设备5分钟，操作压力为4.5×10 -2乇和氧流速为3.5英尺3 /分钟的氧等离子体。然后加载装置与去离子水，并用UV光8小时在层的生物安全罩进行杀菌处理。
  4. 前一天细胞都准备好了，洗设备1X磷酸盐缓冲液（1X PBS），然后大衣，纤维连接蛋白（100微克/毫升，DILuted用1×PBS中），并在冰箱中在4℃过夜孵育。
  5. 纤连蛋白涂层后，用1×PBS中，然后用培养液加载洗设备。 15分钟，温度为37°C孵育设备。
  6. 负载HUVEC细胞在8％葡聚糖培养基中，细胞浓度为3-4×10 6细胞/ ml。细胞20μl的液滴放置在该设备的一个入口，并倾斜到微流体通道中引入细胞。 15-20分钟后，细胞就会开始附加到通道的侧壁。旋转的移动设备创建一个更均匀的分布，细胞每15分钟。如果有必要，可以进行额外的负荷。

4。长期灌注设定的

所附的人脐静脉内皮细胞静态培养5-6小时后，将开始完全摊开。设置使用远程控制的注射泵系统10微升/小时源源不断的灌注。灌注可以调整的F或更高的流速，并且可以持续4天至2周之间的时间周期。

5。细胞染色和显微镜表征

  1. 当细胞达到汇合里面的设备中，首先，洗涤装置用1x PBS彻底清除介质。稀释剂（4微升1毫升）稀释，用红色的染料，然后加载设备。加载染料的细胞装载过程相似。孵育的移动设备在黑暗中，在室温下5分钟，然后用培养液中洗设备停止染色。潜伏期长的染料可以导致细胞毒性和disadhesion。
  2. 蓝色染料用1×PBS稀释（每毫升含2滴），载入装置。在室温下在黑暗中孵育5分钟，然后彻底清洗装置，用1×PBS。
  3. 一个倒置的光学显微镜下检查细胞染色。如果染色还是不错的，与固定介质加载的微（3.5％多聚甲醛与1X PBS稀释），然后淹没固定介质的设备中，完全覆盖铝箔。将装置存放在冰箱中，在温度为4°C，以防止设备从干燥和漂白。是固定的移动设备现在已准备好用于共焦成像，这可以通过激光扫描共聚焦显微镜。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们的方法来制造微通道网络的多深度模仿体内微血管的复杂的三维几何形状，其中的微通道具有圆形横截面15。此外，父分支通道的女儿通道的直径近似服从默里定律保持在所需的水平的流体流动，使整体的流路阻力变低，流动速度更均匀的整个网络16-18。 电影1，图2，和电影 ，分别为一个半圆形的光致抗蚀剂制造模具师傅和圆形的横截面PDMS微通道网络的过程和结果进行了论证。 PDMS微通道网络的几何特征，其特征在于， 如图2所示。我们的研究结果表明，光刻胶回流技术，可以创建多深入的分支通道网络，我呐光刻胶回流技术，更方便的方式，让设计的微血管仿生系统近似服从穆雷的律师。

在许多体外模型，血管细胞通常培养在平面板，过滤器，或这些基材涂有凝胶。在这些条件下的微血管通过细胞自组装是随机生成的。此外，传统的检测实现不断流过血管内皮细胞的固有困难。长期的连续媒体流的缺乏阻止的能力，保持适当的屏障功能单层内皮细胞​​的稳定性。在我们...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。主模具制造

血管形态计量学的设计和指导原则之一是被称为穆雷的第16条，其中规定，受整个网络分布的血管直径最小能量代价。报告还指出，在分叉的父容器的直径的立方等于总和的女儿血管直径的立方（ figure-discussion-1 19）此外，泊肃叶定律已被用于估计在大多数的血管的剪切应力的大小，作为figure-discussion-2 。在其中1eq3.jpg"的src ="/ files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg"宽...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者宣称，他们有没有竞争经济利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

部分支持这项研究是由美国国家科学基金会（NSF 1227359），西弗吉尼亚的EPSCoR程序由美国国家科学基金会（EPS-1003907），西弗吉尼亚ADVANCE办公室主办，由美国国家科学基金会（1007978），和WVU PSCoR的分别。 WVU共享研究设施（无尘室设施）和微流控结合蜂窝片上实验室（芯片实验室）在西弗吉尼亚大学的研究工作是在微细。聚焦成像做在WVU显微镜成像设备。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
试剂/材料
回流光刻胶AZ 电子材料AZP4620
显AZ 电子材料AZ 400K
PDMS道康宁公司Sylgard 184
MCDB 131 培养基Invitrogen10372-019
NacBlue 细胞核染色InvitrogenH1399
PKH 红色染色SigmaMINI26 和 PKH26GL
纤连蛋白GibcoPHE0023
L-谷氨酰胺SigmaG7513
磷酸盐缓冲盐水Invitrogen14040-133
HEPES 缓冲盐水溶液LonzaCC-5024
胰蛋白酶/EDTAInvitrogen25300-062
胰蛋白酶中和溶液LonzaCC-5002
PDMS 固化剂道康宁公司Sylgard 184
原代人脐静脉内皮细胞LonzaCC-2517
胎牛血清Lonza14-501F
稀释剂 CSigmaCGLDIL
Hoechst33342Invitrogen， 分子探针R37605
葡聚糖Sigma95771
3.5% 多聚甲醛电子显微镜科学15710-S
设备
SpinnerLaurell Technologies CorporationWS-400BZ-6NPP/LITE
干燥器BelArt 产品999320237
倒置显微镜尼康Eclipse Ti
注射泵系统哈佛仪器PHD 超
层流生物安全罩Thermo Scientific1300 系列 A2
行星离心混合器ThinkyARE-310
Isotemp OvenFisher Scientific13-246-516GAQ
光学显微镜ZeissInvertoskop 40C
等离子清洗剂Harrick PlasmaPDC-32G
HotplateBarnstead/Thermolyne CimarecSP131635
激光扫描共聚焦显微镜ZeissLSM 510
影剂 剂

References

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