鉴定特定感觉神经元群体以研究其表达的离子通道

摘要

传入感觉神经元将感觉信息从外周传递至中枢神经系统。鉴定特定的传入感觉神经元将有助于理解其生理特性。本文介绍一种逆行标记方法，用于鉴定传入神经元，并结合膜片钳电生理技术和免疫细胞化学技术研究这些神经元中的电压门控离子通道。

摘要

感觉神经元将来自身体各个部位的信号传递至中枢神经系统。这些神经元的胞体位于沿脊柱排列的背根神经节中。了解这些感觉传入神经元所表达的受体和通道，可能为疾病治疗带来新的疗法。第一步是确定感兴趣的特定感觉神经元亚群。本文介绍一种通过逆行标记法使用荧光染料DiI（1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）来鉴定支配肌肉的传入神经元的方法。了解离子通道在肌肉传入神经兴奋性中的作用，有助于更好地控制由某些疾病状态（如外周血管疾病或心力衰竭）引起的过度兴奋性。我们采用两种方法鉴定这些神经元表达的电压依赖性离子通道：膜片钳电生理记录和免疫细胞化学。虽然电生理结合药理阻断剂可识别功能性离子通道类型，但我们使用免疫细胞化学来鉴定那些缺乏特异性阻断剂的离子通道，并更深入地了解该细胞群体中离子通道的分布模式。这些技术可应用于神经系统其他区域，以研究特定的神经元群体。

引言

背根神经节（DRG）由支配身体不同部位的传入神经元胞体组成，通过研究支配不同靶区的感觉神经元，可获得重要的科学认识。¹. 采用多种间接或侵入性方法来分离和鉴定传入神经元 例如 使用荧光金等标记物对神经进行注射¹通过手术方法向肌肉内注射染料²在已成功用于标记神经元及神经纤维束的不同染料中，荧光染料如DiI因其能被神经末梢快速摄取、在神经元中长期保留且不会在神经元之间转移，而被广泛应用于神经解剖学示踪。³用DiI标记的传入神经元可通过荧光显微镜轻松观察，便于进行详细研究。然而，一个局限性在于，在进行针对细胞内表位的免疫细胞化学染色所需的细胞通透化处理过程中，DiI等标记物可能会从细胞中丢失。⁴在此，我们介绍一种通过向骨骼肌注射DiI以标记背根神经节（DRG）中肌感传神经元的方法。同时描述一种细胞通透化技术，该技术可在保留神经元内DiI荧光的同时，允许抗体进入细胞并结合胞内抗原表位。我们展示了如何结合膜片钳电生理记录与免疫细胞化学方法研究这些被标记的神经元，并比较了两种技术在研究调控神经元兴奋性的电压门控离子通道时各自的优势。最后，我们讨论了可能影响电生理数据解读的潜在问题。我们已应用这些方法鉴定出肌源性和皮肤来源的感传神经元，并确定了这些神经元中表达的电压门控钠（NaV）通道类型。⁸然而，这些方法可适用于多种制备方式，用于研究支配特定靶组织或脑核的已鉴定神经元亚群。

方案

注意：所有动物实验必须根据机构和动物护理指南进行。

1. 动物准备与标记

1. 麻醉大鼠：通过腹腔注射给予大鼠（通常为150–400 g）混合麻醉剂，包括氯胺酮（50 mg/kg体重）、赛拉嗪（5 mg/kg）和乙酰丙嗪（1 mg/kg）。通过夹捏足部检查反射，直至无反应为止。由于不同动物对麻醉剂的反应存在差异，最好通过测试痛觉反射来确定麻醉效果。
2. DiI溶液配制：称取DiI粉末，溶于无菌的100% DMSO中，配制成1.5%的溶液（15 mg/ml）。将溶液在干燥环境中室温保存，直至使用。
3. DiI注射：使用电动剃须刀剃除麻醉后大鼠双侧小腿区域的毛发。
   1. 取1 ml无菌注射器（1¼ in 27 G针头），吸入200 µl 1.5% DiI溶液。将针头沿每侧腓肠肌长轴平行方向缓慢插入，并在缓慢退出针头的同时（约10秒），将100 µl DiI注入肌肉内，但针头不完全拔出肌肉。
   2. 在将针头从肌肉中完全拔出前，回抽注射器活塞，确认染料不再从针尖流出，等待10秒，然后将针头从肌肉中拔出。此步骤可防止DiI沿针道泄漏至皮肤，避免标记皮肤传入神经纤维。
   3. 对另一条腿重复上述操作。
   4. 给予4–5天时间，使DiI从肌肉运输至背根神经节（DRG）。

2. 解剖与神经元分离

1. 溶液：
   1. 根据制造商说明配制 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）和 Earle’s 平衡盐溶液（EBSS），过滤除菌后于 4 °C 保存。
   2. 培养基（MEM Plus）：将 89 ml 最低必需培养基（MEM）、10 ml 胎牛血清（FBS）和 1 ml 青霉素-链霉素溶液混合，过滤除菌后于 4 °C 保存。
   3. 多聚赖氨酸溶液：将多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐粉末（10 mg/100 ml）溶于 pH 8.4 的 0.1 M 硼酸钠溶液中，过滤除菌后分装并储存在 -20 °C。
2. 包被盖玻片
   1. 将玻璃盖玻片（12 mm 圆形）在 70% 乙醇中清洗 3–4 小时，然后在无菌培养罩中风干。
   2. 将干燥的盖玻片置于多聚赖氨酸溶液中过夜（O/N）。
   3. 从多聚赖氨酸溶液中取出，用无菌蒸馏水洗涤两次，每次 5 分钟，以去除多余的多聚赖氨酸。
   4. 将盖玻片分开，在培养罩中干燥，并于 4 ^oC 保存。
3. 解剖前准备
   1. 将装有 10 ml HBSS 的烧杯、一个 35 mm 培养皿和一个 100 mm 培养皿置于冰上。
   2. 称取酶：7 mg 胶原酶、1 mg DNA酶和 10 mg 胰蛋白酶。
   3. 预热摇床水浴至 37 ^oC，并将含有 10 ml EBSS 的 15 ml 离心管放入水浴中预热。
4. 解剖：
   1. 根据 IACUC 批准的方案处死大鼠。 C使用二氧化碳对大鼠实施安乐死。
   2. 迅速切开背部皮肤，剥离背部组织，清除脊柱周围的结缔组织和肌肉以充分暴露，取出腰椎段脊柱（从胸椎末端至髂骨；图 1）。
   3. 将分离出的脊柱放入 100 mm 培养皿中，并使用无菌巴斯德移液管滴加冷 HBSS 溶液，以保持组织湿润和低温。
   4. 从脊柱两侧切下肌肉组织。使用咬骨钳或剪刀进行背侧椎板切除术，轻柔地移除包裹背根神经节（DRG）所在隐窝的骨组织。
   5. 在此过程中反复滴加冰冻 HBSS（约 1 ml）。
   6. 切断周围神经和中枢神经以分离 DRG（保留 1–2 mm 神经以便于操作神经节）。
   7. 将分离出的 DRG 放入含有冰冻 HBSS 缓冲液的 35 mm 培养皿中。
   8. 重复操作，直至所有 L-4 和 L-5 节段的 DRG 均被分离。胸段 DRG 可单独分离并作为 DiI 标记的阴性对照。
   9. 将含有分离 DRG 的培养皿置于解剖显微镜下，使用显微剪刀和镊子去除多余的神经和血管。
   10. 切开 DRG 以增加酶的接触面积，但不要完全剥离 DRG 的被膜。
5. DRG 神经元的解离：
   1. 将酶加入已预热的 EBSS 培养基中（置于水浴中保温）。短暂震荡使其溶解，然后过滤除菌。
   2. 使用无菌巴斯德移液管将所有 DRG 转移至酶溶液中。尽量减少随 DRG 加入的 HBSS 体积，以免稀释酶混合液。  在盖紧瓶盖前，向瓶内通入 95% O₂ 和 5% CO₂ 气体 60 秒。
   3. 将瓶子置于设定为 37 °C、240 rpm 的摇床水浴中孵育 60 分钟。
   4. 孵育结束后，剧烈震荡瓶子 50 次以解离 DRG⁵。
   5. 在无菌条件下，向瓶中加入 5 ml MEM Plus 培养基以终止酶反应。
   6. 将瓶内液体转移至无菌 15 ml 离心管中，以 16 × g 离心 6 分钟。
   7. 弃去上清液，向沉淀中加入 5 ml MEM Plus 培养基。用移液器轻轻吹打以打散沉淀。
   8. 重复离心步骤，弃去上清液后加入 500 µl MEM Plus 培养基。使用 1 ml 移液器枪头轻轻吹打，制成单细胞悬液。
   9. 将一片多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片放入一个洁净的无菌 35 mm 培养皿中。在盖玻片中央滴加一滴细胞悬液（约 50 µl）。
   10. 重复操作，直至细胞悬液用完。
   11. 将 35 mm 培养皿放入 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 1 小时，使神经元贴附于盖玻片上。
   12. 向每个培养皿中额外加入 2 ml 培养基，然后放回培养箱继续培养。

3. 膜片钳记录

1. 记录用溶液：这些溶液用于记录 NaV 电流。不同成分的溶液示例如参考文献^5-7所示。
   1. 外部溶液（单位 mM）：45 NaCl，100 N-甲基-D-葡萄糖胺（NMG）•Cl，4 MnCl₂，10 Na•HEPES 和 10 葡萄糖，pH = 7.4，渗透压 = 320 mOsm。
   2. 内部溶液（单位 mM）：104 NMG•Cl，14 肌酸•PO₄，6 MgCl₂，10 NMG•HEPES，5 Tris•ATP，10 NMG₂•EGTA 和 0.3 Tris₂•GTP，pH 7.4，渗透压 = 300 mOsm。
2. 离子电流的测量：
   1. 使用电极拉制仪从玻璃毛细管中拉制记录电极，并使用微熔炉对尖端进行热抛光。电极电阻通常为 2–3 MΩ。
   2. 使用带有落射荧光和 TRITC 滤光片的显微镜识别 DiI 标记的背根神经节（DRG）神经元。DiI 的激发波长为 550 nm，发射波长为 570 nm。
   3. 用内部溶液填充玻璃电极（仅填充电极尖端约 1 cm），轻轻敲击以去除任何被困住的气泡。将电极放入电极夹持器中，并使用微操纵器移至细胞附近。
   4. 当电极接触细胞后，通过吸管施加轻微负压，直至形成紧密封接（通过电极电阻的增加来判断）。
   5. 将膜电压钳制在所需的保持电位（通常为 -60 至 -120 mV）。
   6. 通过施加更强的负压以去除电极尖端处的膜片，获得全细胞膜片钳构型。向全细胞构型的转变在电信号上表现为电容性电流的增加^8-10。
   7. 使用膜片钳放大器的补偿电路对串联电阻进行补偿（至少补偿 80%）^8,10。

4. 免疫细胞化学

1. 用 4% 多聚甲醛将盖玻片上的神经元固定 1 小时，然后用含 2% Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBS）透化处理 10 分钟。
2. 将固定后的细胞在封闭液（正常血清或牛血清白蛋白）中与一抗共同孵育过夜（O/N），该一抗可特异性结合目标抗原。
3. 将一组对照神经元在不含一抗的封闭液中同样孵育过夜（O/N）。
4. 用 PBS 缓冲液洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟，随后用含 1% Tween 20 的 PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟，以去除未结合的一抗。
5. 将实验组和对照组的盖玻片与相应的荧光标记二抗孵育，该二抗可结合一抗，从而实现信号可视化。
6. 用 PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟，以去除未结合的过量二抗。
7. 使用封片介质将盖玻片封固于洁净的载玻片上。
8. 在盖玻片边缘涂抹透明指甲油以固定其位置。待指甲油干燥后，使用荧光显微镜配套软件观察神经元并采集图像。
   注意：本研究中使用的是 Nikon 显微镜，配套 NIS-elements BR 3.2 软件。曝光时间经过优化，并在对照组和实验组玻片间保持一致。
9. 使用 ImageJ 等图像分析软件（rsbweb.nih.gov/ij/index.html）测量单个神经元的荧光强度和细胞大小。

结果

利用本文所述方法，我们鉴定出了背根神经节（DRG）中的肌肉传入神经元，并进一步确定了这些神经元所表达的电压门控钠通道（NaV）。DiI标记的肌肉传入神经元（图1C）仅占DRG中神经元总数的一小部分，平均为16%（1047个神经元中有167个被标记）。定量分析首先通过ImageJ测量荧光强度，并对强度数据绘制直方图，以确定阳性标记神经元的阈值。该阈值通过将未标记神经元的大峰拟合为高斯分布获得，从而得到平均荧光强度和标准差（SD）（图1D）。阈值设定为平均强度加2倍标准差（2×SD），因此任何荧光强度>阈值的神经元均被标记为阳性^11,12。

电生理学：

进行膜片钳记录时，我们选择那些荧光标记明亮、孤立且无明显神经突起（神经元突起）的神经元。神经突起会引起空间钳制问题，导致神经元难以甚至无法进行有效的电压钳制，因为神经突起中的离子通道距离电流注入电极已有多个空间常数的距离。因此，注入电流在这些远端位置的衰减过大，无法有效控制膜电位。其他可能削弱...

讨论

起源于腓肠肌复合体（例如腓肠肌）的肌梭传入神经纤维已被多项研究用于探究运动加压反射（EPR）¹³。鉴于对介导EPR的感觉神经元的研究兴趣，本实验选择腓肠肌作为染料注射部位。选用DiI的原因在于其具有脂溶性，且不会通过完整的质膜扩散而从神经元中丢失^3,14。以该方法为指导，可将染料注射至任何目标器官，以识别支配该器官的传入神经元。通过文献检索可获得确定最佳注射位点以及需分离的背根神经节（DRG）所需的信息^13,15,16。

DiI 的注射需谨慎操作，以确保仅注入目标组织。同时，必须保证染料在组织内充分扩散。我们通过沿肌肉纵轴方向注射的方式优化了染料在肌肉中的分布。将针头插入肌肉后，在缓慢退出针头的过程中进行注射。在将针头从肌肉中拔出前，轻轻回抽注射器活塞，可防止染料渗漏至皮肤。若不慎导致皮肤标记，我们将排除这些大鼠，不用于后续记录。作为进一步的防范措施，覆盖注射区域的皮肤节段主要为 L6 和 S1¹⁷，因此 DiI 意外渗漏至 L4 和 L5 皮肤传入神经而未被察觉的可能性较低。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 和 1.9	Alamone Labs, 耶路撒冷, 以色列	ASC- 001/ 009 /008 /017
Alexa Fluor 二抗	Invitrogen
正常山羊血清
Fluoro-Gel	Electron Microscopy Sciences	17985