鉴定特定感觉神经元群体以研究其表达的离子通道

摘要

传入感觉神经元将感觉信息从外周传递至中枢神经系统。鉴定特定的传入感觉神经元将有助于理解其生理特性。本文介绍一种逆行标记方法，用于鉴定传入神经元，并结合膜片钳电生理技术和免疫细胞化学技术研究这些神经元中的电压门控离子通道。

摘要

感觉神经元将来自身体各个部位的信号传递至中枢神经系统。这些神经元的胞体位于沿脊柱排列的背根神经节中。了解这些感觉传入神经元所表达的受体和通道，可能为疾病治疗带来新的疗法。第一步是确定感兴趣的特定感觉神经元亚群。本文介绍一种通过逆行标记法使用荧光染料DiI（1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）来鉴定支配肌肉的传入神经元的方法。了解离子通道在肌肉传入神经兴奋性中的作用，有助于更好地控制由某些疾病状态（如外周血管疾病或心力衰竭）引起的过度兴奋性。我们采用两种方法鉴定这些神经元表达的电压依赖性离子通道：膜片钳电生理记录和免疫细胞化学。虽然电生理结合药理阻断剂可识别功能性离子通道类型，但我们使用免疫细胞化学来鉴定那些缺乏特异性阻断剂的离子通道，并更深入地了解该细胞群体中离子通道的分布模式。这些技术可应用于神经系统其他区域，以研究特定的神经元群体。

引言

背根神经节（DRG）由支配身体不同部位的传入神经元胞体组成，通过研究支配不同靶区的感觉神经元，可获得重要的科学认识。¹. 采用多种间接或侵入性方法来分离和鉴定传入神经元 例如 使用荧光金等标记物对神经进行注射¹通过手术方法向肌肉内注射染料²在已成功用于标记神经元及神经纤维束的不同染料中，荧光染料如DiI因其能被神经末梢快速摄取、在神经元中长期保留且不会在神经元之间转移，而被广泛应用于神经解剖学示踪。³用DiI标记的传入神经元可通过荧光显微镜轻松观察，便于进行详细研究。然而，一个局限性在于，在进行针对细胞内表位的免疫细胞化学染色所需的细胞通透化处理过程中，DiI等标记物可能会从细胞中丢失。⁴在此，我们介绍一种通过向骨骼肌注射DiI以标记背根神经节（DRG）中肌感传神经元的方法。同时描述一种细胞通透化技术，该技术可在保留神经元内DiI荧光的同时，允许抗体进入细胞并结合胞内抗原表位。我们展示了如何结合膜片钳电生理记录与免疫细胞化学方法研究这些被标记的神经元，并比较了两种技术在研究调控神经元兴奋性的电压门控离子通道时各自的优势。最后，我们讨论了可能影响电生理数据解读的潜在问题。我们已应用这些方法鉴定出肌源性和皮肤来源的感传神经元，并确定了这些神经元中表达的电压门控钠（NaV）通道类型。⁸然而，这些方法可适用于多种制备方式，用于研究支配特定靶组织或脑核的已鉴定神经元亚群。

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方案

注意：所有动物实验必须根据机构和动物护理指南进行。

1. 动物准备与标记

1. 麻醉大鼠：通过腹腔注射给予大鼠（通常为150–400 g）混合麻醉剂，包括氯胺酮（50 mg/kg体重）、赛拉嗪（5 mg/kg）和乙酰丙嗪（1 mg/kg）。通过夹捏足部检查反射，直至无反应为止。由于不同动物对麻醉剂的反应存在差异，最好通过测试痛觉反射来确定麻醉效果。
2. DiI溶液配制：称取DiI粉末，溶于无菌的100% DMSO中，配制成1.5%的溶液（15 mg/ml）。将溶液在干燥环境中室温保存，直至使用。
3. DiI注射：使用电动剃须刀剃除麻醉后大鼠双侧小腿区域的毛发。
   1. 取1 ml无菌注射器（1¼ in 27 G针头），吸入200 µl 1.5% DiI溶液。将针头沿每侧腓肠肌长轴平行方向缓慢插入，并在缓慢退出针头的同时（约10秒），将100 µl DiI注入肌肉内，但针头不完全拔出肌肉。
   2. 在将针头从肌肉中完全拔出前，回抽注射器活塞，确认染料不再从针尖流出，等待10秒，然后将针头从肌肉中拔出。此步骤可防止DiI沿针道泄漏至皮肤，避免标记皮肤传入神经纤维。
   3. 对另一条腿重复上述操作。
   4. 给予4–5天时间，使DiI从肌肉运输至背根神经节（DRG）。

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结果

使用本文所述方法，我们鉴定了背根神经节（DRG）中的肌肉传入神经元，并进一步确定了这些神经元表达的电压门控钠通道（NaV）。DiI标记的肌肉传入神经元（图1C) 仅占背根神经节（DRG）神经元总群体的一小部分，平均有16%的神经元被标记（167/1047）。定量分析首先使用ImageJ测量荧光强度，并绘制强度数据的直方图，以确定阳性标记神经元的阈值。该阈值通过将高斯分布拟合至未标记神经元形成的主要峰来确定，从而获得平均荧光强度和标准差（SD）图1D）。阈值水平设定为平均强度加上2倍标准差，以便筛选出强度高于此阈值的任何神经元 > 阈值被标记为已标记^11,12 .

电生理学：

进行膜片钳记录时，我们选择那些荧光明亮、孤立且无明显神经突起（神经元突起）的神经元。神经突起会引起空间钳制问题，导致神经元难以甚至无法进行有效的电压钳制，因为神经突起中的离子通道距离电流传递电极已有多个空间常数的距离。因此，注入电流在这些远端位置的衰减过大，无法有效控.......

讨论

起源于腓肠肌复合体（例如腓肠肌）的肌梭传入神经纤维已被多项研究用于探究运动加压反射（EPR）¹³。鉴于对介导EPR的感觉神经元的研究兴趣，本实验选择腓肠肌作为染料注射部位。选用DiI的原因在于其具有脂溶性，且不会通过完整的质膜扩散而从神经元中丢失^3,14。以该方法为指导，可将染料注射至任何目标器官，以识别支配该器官的传入神经元。通过文献检索可获得确定最佳注射位点以及需分离的背根神经节（DRG）所需的信息^13,15,16。

DiI 的注射需谨慎操作，以确保仅注入目标组织。同时，必须保证染料在组织内充分扩散。我们通过沿肌肉纵轴方向注射的方式优化了染料在肌肉中的分布。将针头插入肌肉后，在缓慢退出针头的过程中进行注射。在将针头从肌肉中拔出前，轻轻回抽注射器活塞，可防止染料渗漏至皮肤。若不慎导致皮肤标记，我们将排除这些大鼠，不用于后续记录。作为进一步的防范措施，覆盖注射区域的皮肤节段主要为 L6 和 S1¹⁷，因此 DiI 意外渗漏至 L4 和 L5 皮肤传入神经而未被察觉的可能性较低。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 和 1.9	Alamone Labs, 耶路撒冷, 以色列	ASC- 001/ 009 /008 /017
Alexa Fluor 二抗	Invitrogen
正常山羊血清
Fluoro-Gel	Electron Microscopy Sciences	17985