利用冷冻电子断层扫描技术观察处于冷冻水合状态神经突的原代神经元制备

摘要

为了保存神经元结构以进行超微结构分析，我们描述了一种将原代神经元接种于透射电镜载网后进行瞬时冷冻的实验方案，从而获得悬浮于玻璃态冰层中的样品。这些样品可用于冷冻电子显微镜观察，以在纳米尺度上可视化细胞结构。

摘要

神经突包括树突和轴突，是神经元的细胞突起，能够介导神经元之间电冲动的传导。明确神经突的结构对于理解这些突起如何运输物质和信号以支持突触通讯至关重要。传统上，透射电子显微镜（EM）被用于评估神经突内部的超微结构；然而，在脱水和树脂包埋过程中使用的有机溶剂可能引起结构变形。目前尚未满足的重要目标是建立不受此类人工假象影响的结构评估方法。 本文中，我们建立了一种详细且可重复的实验方案，用于在电子显微镜载网上培养不同原代神经元的完整神经突，并进行快速冷冻，随后通过冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）对其进行观察。该技术可实现对处于冷冻水合状态的神经突进行纳米级分辨率的三维可视化，有助于评估其形态学差异。本方案首次清晰呈现了背根神经节（DRG）神经突的结构，并实现了海马神经突近乎天然状态下的可视化。因此，这些方法为今后研究正常神经元以及受神经系统疾病影响的神经元的神经突奠定了基础。

引言

神经元通过延伸树突来接收信息，并通过轴突（通常相当长）与下游神经元进行通信，从而建立中枢和周围神经系统功能所必需的复杂神经环路。在胚胎发育过程中，神经突的生长发挥着基础性作用，而神经突的分化与维持对神经系统功能具有关键支持作用。神经突过程也显著参与神经元损伤与再生，以及神经系统疾病的发生发展。研究神经元结构对于理解正常和病变大脑均至关重要。幸运的是，目前已存在能够重现复杂且异质性细胞结构的、具有生理相关性的神经元细胞培养系统。在明确建立可靠的实验平台基础上，亟需有效的可视化策略，以实现对神经元形态的定性与定量分析。尤其需要一种详细的方法学，能够提供一个稳定可靠的平台，用于在纳米尺度上对轴突和树突等神经突进行可视化观察。

传统的电子显微镜技术在脱水和树脂包埋过程中需要使用有机溶剂，这可能导致样品偏离其真实状态而产生形变。迄今为止，大多数纳米尺度的结构表征均基于经过此类 harsh 化学处理的较大细胞或组织，从而限制了对研究结果的准确解读^4,9,25。此外，为了实现电子束的穿透，对于厚度超过 1 µm 的生物体或细胞突起必须进行切片处理¹²。最终，切片或研磨所得的组织会产生离散的、特定于切片的数据集，使得对神经突等细长结构特征的完整界定变得困难。即使在冷冻电镜（cryo-EM）中，虽然可以对冷冻水合样品进行切片，但该方法仍会引入压缩伪影¹。

近年来，研究人员已....

方案

1. 准备用于培养原代神经元的带电镜载网的培养皿

1. 使用光学显微镜在至少25倍放大倍数下检查金质电镜载网上多孔碳膜的完整性。确保碳膜上的孔洞均匀分布且无破裂。 >98% 完整。
2. 接种原代神经元时，使用本生灯对电镜载网进行灼烧灭菌，同时使其具有亲水性。用镊子夹取电镜载网的边缘，避免接触中央的网格区域。注意：点燃的本生灯不得无人看管，且操作过程中禁止佩戴手套或使用带塑料部件的镊子。
   1. 点燃本生灯前，将空气和燃气调节阀调至最小开启位置。
   2. 使用打火石或丁烷打火机点燃本生灯。
   3. 调节空气和燃气阀门，使火焰呈现较小的蓝色内焰，外围为较高的浅蓝色至紫罗兰色外焰。内焰的尖端是火焰温度最高的部分。燃烧器底部的旋钮用于调节进入燃烧管的燃气量，而燃烧器的筒体可旋转以调节进入的空气量。顺时针旋转空气调节装置会减少进气量（导致火焰呈紫色），逆时针旋转则增加空气量（导致火焰呈黄色）。
   4. 使用金属镊子（无塑料部件）夹住电镜载网，将碳膜面朝上快速通过火焰两次。碳膜面显得更哑光（光泽较弱），且比另一面更具灰白色调。
   5. 立即将载网（碳膜面朝上）转移至玻璃底培养皿的中央，培养皿应置于本生灯火焰10 cm范围内。每个培养皿使用一个透射电镜载网（图 1仅使用预灭菌的玻璃底培养皿， 即 通过γ射线辐照。
3. 使用光学显....

结果

在通过冷冻电子断层扫描（cryo-ET）进行冷冻和成像之前，应先对培养神经元的电镜载网进行光学显微镜成像。神经突应清晰可见，且彼此之间无明显重叠。在图3A中，彩色方框标示的区域被放大显示于图3B，其中可见神经突跨越载网的格栅结构延伸。每个网格单元均由带孔的碳膜构成，用于支撑神经元及其神经突。这些孔洞在4k倍率下拍摄的低剂量冷冻电镜图像中清晰可见，图像中神经元胞体表现为相对较大、较暗且电子密度较高的结构（图3C），神经突由此向外延伸。

在图3C中，选择位于碳膜孔洞上方的一段静息状态的神经突，用彩色方框标出，并在图3D中以更高放大倍数（20k）进行放大显示。在此放大倍数下，应能清晰观察到包括微管、囊泡和线粒体在内的明显内部细胞结构（图3D），尤其是在按照本方案制备的最优厚度冰层中。图像中央的深黑色结构（图3D）为六方晶系冰颗粒，被视为污染，通常应避免；.......

讨论

我们证明，大鼠胚胎神经元（背根神经节和海马神经元）可以在金质透射电镜（EM）载网上培养，并速冻形成足够薄的玻璃态冰层，从而能够利用二维冷冻电镜（cryo-EM）和三维冷冻电子断层成像（cryo-ET）对其神经突进行成像。尽管已有研究利用冷冻电子断层成像技术对海马神经突进行了成像^8,10,18,23，但此前一直缺乏足够详尽、可借助市售设备成功重复操作的实验方案。此外，尽管前人研究开创性地将冷冻电子断层成像技术应用于海马神经突的可视化，我们的研究则进一步探索了该技术在多种类型神经元样本中的适用性。

本文详细描述了一种制备海马神经元和背根神经节（DRG）神经元电镜载网的实验方案，通过滤纸吸取使冰层达到理想厚度，并进行玻璃化冷冻，以用于冷冻电子断层扫描（cryo-ET）成像。最佳的滤纸吸取时间应确保冰层既不会过厚而阻碍电子束穿透，也不会过薄而导致在多孔碳膜边缘与孔洞中心区域之间的玻璃态冰出现明显不同的梯度。此外，使用玻璃化冷冻仪¹⁷获得理想厚度的冰层在不同项目中可能略有差异，熟练掌握该仪器以实现稳定可靠的冷冻效果需要一定的学习过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dumont #7 镊子	Electron Microscopy Sciences	72803-01	用于操作电镜载网
玻璃底培养皿	MatTek Corp.	P35G-1.5-10C	用于样品培养
电子显微镜载网	Quantifoil	Holey Carbon, Au 200, R 2/2	用于样品培养
无钙滤纸	Whatman	1541-055	用于样品吸液
大号平头长镊	Excelta Corporation	E003-000590, 25-SA	用于样品吸液
玻璃化冷冻装置及镊子	FEI	Vitrobot Mark III	用于样品冷冻
小型载网储存盒	Ted Pella, Inc.	160-40	用于储存电镜载网
冷冻转移 holder	Gatan	626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder	用于样品成像
半自动倾转系列采集软件	SerialEM	http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/	用于样品成像
图像处理软件	IMOD eTomo	http://bio3d.colorado.edu/imod/	用于图像处理
用于冷冻电镜的透射电子显微镜	JEOL, Tokyo	200-kV JEM2100 LaB6 电子显微镜	用于样品成像
4k × 4k CCD 相机	Gatan	N/A	用于样品成像
三维标注软件	Visage Imaging GmbH	Amira/Avizo	用于处理三维数据
用于数字拼接二维图像的软件	Adobe	Adobe Photoshop	用于处理二维数据
DMEM 高糖培养基	Invitrogen	11965-118	用于海马神经元培养
硼酸	Sigma Aldrich	B-0252	用于海马神经元培养
四硼酸钠	Sigma Aldrich	B-9876	用于海马神经元培养
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P2636-500MG	用于海马神经元培养
过滤系统	Corning	430758	用于海马神经元培养
Neurobasal 培养基	Invitrogen	21103-049	用于背根神经节（DRG）培养
B-27 添加剂	Invitrogen	17504-044	用于背根神经节（DRG）培养
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122	用于背根神经节（DRG）培养
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061	用于背根神经节（DRG）培养
重组大鼠 b-NGF	R&D Systems	556-NG	用于背根神经节（DRG）培养
尿苷	Sigma	U3003-5G	用于背根神经节（DRG）培养
5'-氟-2'-脱氧尿苷	Sigma	F0503-100MG	用于背根神经节（DRG）培养
Matrigel	BD Biosciences	356234	用于背根神经节（DRG）培养