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方法文章

利用冷冻电子断层扫描技术观察处于冷冻水合状态神经突的原代神经元制备

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DOI：

10.3791/50783

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2014年2月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, University of California at San Diego, 4National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

为了保存神经元结构以进行超微结构分析，我们描述了一种将原代神经元接种于透射电镜载网后进行瞬时冷冻的实验方案，从而获得悬浮于玻璃态冰层中的样品。这些样品可用于冷冻电子显微镜观察，以在纳米尺度上可视化细胞结构。

摘要

神经突包括树突和轴突，是神经元的细胞突起，能够介导神经元之间电冲动的传导。明确神经突的结构对于理解这些突起如何运输物质和信号以支持突触通讯至关重要。传统上，透射电子显微镜（EM）被用于评估神经突内部的超微结构；然而，在脱水和树脂包埋过程中使用的有机溶剂可能引起结构变形。目前尚未满足的重要目标是建立不受此类人工假象影响的结构评估方法。 本文中，我们建立了一种详细且可重复的实验方案，用于在电子显微镜载网上培养不同原代神经元的完整神经突，并进行快速冷冻，随后通过冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）对其进行观察。该技术可实现对处于冷冻水合状态的神经突进行纳米级分辨率的三维可视化，有助于评估其形态学差异。本方案首次清晰呈现了背根神经节（DRG）神经突的结构，并实现了海马神经突近乎天然状态下的可视化。因此，这些方法为今后研究正常神经元以及受神经系统疾病影响的神经元的神经突奠定了基础。

引言

神经元通过延伸树突来接收信息，并通过轴突（通常相当长）与下游神经元进行通信，从而建立中枢和周围神经系统功能所必需的复杂神经环路。在胚胎发育过程中，神经突的生长发挥着基础性作用，而神经突的分化与维持对神经系统功能具有关键支持作用。神经突过程也显著参与神经元损伤与再生，以及神经系统疾病的发生发展。研究神经元结构对于理解正常和病变大脑均至关重要。幸运的是，目前已存在能够重现复杂且异质性细胞结构的、具有生理相关性的神经元细胞培养系统。在明确建立可靠的实验平台基础上，亟需有效的可视化策略，以实现对神经元形态的定性与定量分析。尤其需要一种详细的方法学，能够提供一个稳定可靠的平台，用于在纳米尺度上对轴突和树突等神经突进行可视化观察。

传统的电子显微镜技术在脱水和树脂包埋过程中需要使用有机溶剂，这可能导致样品偏离其真实状态而产生形变。迄今为止，大多数纳米尺度的结构表征均基于经过此类 harsh 化学处理的较大细胞或组织，从而限制了对研究结果的准确解读4,9,25。此外，为了实现电子束的穿透，对于厚度超过 1 µm 的生物体或细胞突起必须进行切片处理12。最终，切片或研磨所得的组织会产生离散的、特定于切片的数据集，使得对神经突等细长结构特征的完整界定变得困难。即使在冷冻电镜（cryo-EM）中，虽然可以对冷冻水合样品进行切片，但该方法仍会引入压缩伪影1。

近年来，研究人员已掌握了如何在电镜载网（EM grids）上直接培养海马体神经元，并将其在液态乙烷中进行快速冷冻，从而利用冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）对神经突起进行可视化观察8,10,18,23。然而，这些研究要么使用自制设备10,23，要么缺乏关于如何通过 blotting 步骤形成足够薄的玻璃态冰层以实现常规观察的详细信息8,18。例如，有研究建议将电镜载网的 blotting 时间设为 30–40 秒10；但该参数并非为通用条件优化，而是针对特定自制冷冻装置所设定。在样品进行浸入式冷冻前，若采用自制设备而非市售设备17来控制湿度环境，可能会对实验的广泛可重复性造成障碍。

尽管这些研究在利用冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）可视化神经突方面具有开创性意义，但我们更进一步，探索了cryo-ET在多种神经元样本（如海马神经元和背根神经节神经元）中的适用性。此外，我们还讨论了使用cryo-ET对这类样本进行观察时可能获得的最佳与非最佳结果，以及可能遇到的潜在假象。

定义一种在接近天然状态下以纳米级分辨率保存和可视化完整神经突的详细技术，将有助于更多研究人员开展超微结构研究。为此，我们描述了一种利用市售设备制备未经固定和染色的神经元以观察神经突的有效且详细的方案。这是详细解析健康神经突超微结构、并为理解神经系统疾病模型中存在的结构差异奠定基础的重要第一步。由于冷冻电子断层扫描（cryo-ET）能够在三维空间中以纳米级分辨率解析未经固定和染色的神经突特征，该方法将前所未有地实现对神经突结构的精确界定12。

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方案

1. 准备用于培养原代神经元的带电镜载网的培养皿

  1. 使用光学显微镜在至少25倍放大倍数下检查金质电镜载网上多孔碳膜的完整性。确保碳膜上的孔洞均匀分布且无破裂。 >98% 完整。
  2. 接种原代神经元时，使用本生灯对电镜载网进行灼烧灭菌，同时使其具有亲水性。用镊子夹取电镜载网的边缘，避免接触中央的网格区域。注意：点燃的本生灯不得无人看管，且操作过程中禁止佩戴手套或使用带塑料部件的镊子。
    1. 点燃本生灯前，将空气和燃气调节阀调至最小开启位置。
    2. 使用打火石或丁烷打火机点燃本生灯。
    3. 调节空气和燃气阀门，使火焰呈现较小的蓝色内焰，外围为较高的浅蓝色至紫罗兰色外焰。内焰的尖端是火焰温度最高的部分。燃烧器底部的旋钮用于调节进入燃烧管的燃气量，而燃烧器的筒体可旋转以调节进入的空气量。顺时针旋转空气调节装置会减少进气量（导致火焰呈紫色），逆时针旋转则增加空气量（导致火焰呈黄色）。
    4. 使用金属镊子（无塑料部件）夹住电镜载网，将碳膜面朝上快速通过火焰两次。碳膜面显得更哑光（光泽较弱），且比另一面更具灰白色调。
    5. 立即将载网（碳膜面朝上）转移至玻璃底培养皿的中央，培养皿应置于本生灯火焰10 cm范围内。每个培养皿使用一个透射电镜载网（图 1仅使用预灭菌的玻璃底培养皿， 即 通过γ射线辐照。
  3. 使用光学显微镜检查网格完整性（碳膜孔完整），同时保持透射电镜载网仍置于玻璃底培养皿内（以避免污染）。当向载网上施加任何物质或任何将与神经元接触的试剂时，应采用无菌操作技术及无菌吸头。
  4. 在组织培养罩内，采用无菌操作，将250 µl适当的包被物质缓慢而小心地滴加到培养皿中央的玻璃区域。确保包被物质完全覆盖电镜载网的整个区域。
    1. 对于海马神经元，使用聚-L-赖氨酸（PLL，1 mg/ml）作为包被物质，其配制方法如前所述。19注意每个培养皿中的每张电镜载网需要250 µl，因此请相应调整配制量。对于背根神经节（DRG）神经元，使用由Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物（参见材料与试剂表）作为包被物质，按如下方法制备。注意每个培养皿中的每张电镜载网需要250 µl，因此请相应调整配制量。
      1. 在4 °C下过夜解冻一瓶Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤细胞分泌的明胶状蛋白质混合物储备液。
      2. 保持 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 小鼠肉瘤细胞分泌的明胶状蛋白质混合物及其用于制备该溶液的所有组分处于低温状态， 即 保持在冰上。
      3. 冰上操作，用Neurobasal培养基将该胶状蛋白质混合物稀释至1:20（即 将500 µl胶状蛋白质混合物加入10 ml Neurobasal培养基中稀释。
      4. 将稀释后的凝胶状蛋白混合物分装为每份1 ml，立即将多余的分装样品于-20 °C保存。
      5. 按照第1.4节所述，每个EM载网每皿加入250 µl。
  5. 用培养皿盖盖好培养皿，并在组织培养操作台中于室温下孵育1小时（海马组织样本使用PLL，背根神经节组织样本使用明胶蛋白混合物）。
  6. 吸出培养皿中所有的PLL（用于海马组织样本）或胶状蛋白质混合物（用于DRG组织样本）。操作时使用组织培养罩内的真空系统，连接无菌的移液枪头与真空管进行吸取。注意避免移液头直接接触电镜载网。
  7. 使用可调式空气置换移液器，小心地向每个培养皿中央玻璃区域的电镜载网上加入 250 µl 无菌 PBS（磷酸盐缓冲液），使电镜载网完全被 PBS 覆盖。然后吸出各培养皿中的 PBS。重复此步骤 3 次。
  8. 将带有EM载网的培养皿置于组织培养罩内干燥15分钟。在组织培养室的光学显微镜下检查，确保载网完全干燥，且载网上无水分气泡。如有水分残留，应在载网旁小心抽吸以去除多余水分。涂覆后的载网应立即用于神经元接种。

2. 在电镜载网上制备和接种原代神经元

  1. 接种原代神经元时，首先分离组织，使用2.5%胰蛋白酶消化，并通过吹打将海马体（或18天大鼠胚胎的背根神经节）解离为单个细胞，具体步骤如前所述19。
    1. “吹打”是神经生物学家常用术语，指将细胞团块解离为单个细胞，通常使用尖端经火焰抛光的玻璃移液管完成。操作时需缓慢反复吸取和释放细胞，通过移液管上下移动约30次，以实现充分解离。
  2. 按照先前描述的背根神经节（DRG）分离与细胞提取步骤进行操作24，注意使用0.25%胰蛋白酶（溶于HBSS中）来分离大鼠DRG神经元，而非使用文中建议的其他酶（如木瓜蛋白酶、胶原酶/分散酶），后者更适用于小鼠DRG神经元的分离。
  3. 计算所获得的神经元数量（即使用血细胞计数板），并据此计算每皿应接种的细胞体积，以达到每皿50,000个细胞/ml的浓度。每皿最大加样体积为250 µl。请注意，该体积仅覆盖培养皿中央的玻片区域，而非整个培养皿。
  4. 将培养皿置于37 °C、含CO2的培养箱中孵育30分钟，使细胞恢复并贴附。
  5. 缓慢向每皿中加入1.5 ml预热的培养基，注意避免扰动电镜载网。培养基类型取决于所用细胞种类（海马神经元或DRG神经元）。
    1. 配制适用于海马神经元19或背根神经节神经元24的培养基，并在使用前于37 °C水浴中预热。将培养皿在CO2培养箱中过夜孵育。
    2. 对于海马神经元，次日更换培养基；之后每两天更换一半培养基，持续14天。使用前需将培养基在37 °C水浴中预热。
    3. 对于DRG神经元，在分离/接种后的第二天，配制含抗有丝分裂试剂的新鲜培养基（尿苷和5'-氟-2'-脱氧尿苷）， 分别配制成10 mM的储备液；使用时终浓度为每种10 µM。移除一半DRG培养基（875 µl），加入875 µl含抗有丝分裂试剂的新鲜培养基。
      1. 对于DRG神经元，在第一周内每两天交替更换一次培养基：一次使用含抗有丝分裂试剂的培养基，下一次使用标准DRG培养基。第二周起，每两天更换一次标准DRG培养基。

3. 在电镜载网上玻璃化神经元

  1. 准备用于在低温下冷冻和储存金质透射电镜（EM）载网的设备及所有材料：配备湿度室的玻璃化装置17、适用于玻璃化装置的尖头专用镊子、长柄平头镊子、液氮（LN2）杜瓦瓶、冷却剂容器、EM载网储存盒、无钙滤纸。
  2. 启动玻璃化装置，将湿度设为100%，温度设为32 °C。在“控制台”部分，将 blot 时间设为零秒，以便通过玻璃化装置湿度室的侧窗进行手动去液操作。
  3. 佩戴手套操作无钙滤纸，将其叠放成三层。将叠好的滤纸切成约2 cm长、0.5 cm宽的条状。将其弯折成90°角，使其中一侧形成0.5 cm × 0.5 cm的接触面（图 2）。使用镊子取出中间一层滤纸，并将其放置在另一张无钙滤纸上备用。
  4. 将载网储存按钮放入玻璃化室内的按钮支架中。向冷却剂容器的内腔注入液氮，等待其完全蒸发。向冷却剂容器的外腔注入液氮，直至达到稳定温度，方可进行下一步操作。向内腔中充入高纯度气态乙烷，使其在冷却的腔体内冷凝为液态。
  5. 若培养皿不在附近，将其从培养箱转移至一个较大的100 mm聚苯乙烯培养皿中，以便运送至玻璃化制样室。使用专用的玻璃化镊子小心地从培养皿中夹取EM载网。注意记录神经元生长在EM载网的哪一侧，该方向信息对下一步操作至关重要。使用镊子上的黑色滑动锁扣将镊子牢固固定在EM载网上。
  6. 将镊子插入玻璃化装置，使神经元附着的一侧朝向左侧，远离玻璃化装置的侧向开口。将专用镊子完全缩回玻璃化装置内部。
  7. 将冷却剂容器放置于玻璃化装置的相应支架上，确保其已装入足量的LN2和液态乙烷。通过玻璃化装置的相应屏幕指令，将冷却腔向上提升，直至其与湿度室底部齐平。
  8. 使用平头镊子夹住滤纸的一边，使较短的一侧（即0.5 cm × 0.5 cm的接触面）与镊子方向垂直。该接触面将直接与EM载网接触以进行去液操作（图 2B）。小心地将滤纸从玻璃化装置湿度室的侧孔插入（图 2A），稳定地将滤纸压在EM载网（远离样品的一侧）上持续10秒。随后丢弃滤纸，并立即使用玻璃化装置的自动化程序将样品在液态乙烷中进行快速冷冻。
  9. 小心地将冷冻水合状态的EM载网转移至载网储存按钮的插槽中。对培养皿中的其他EM载网重复上述操作。本实验所用的载网储存按钮可同时存放多个冷冻水合的EM载网。

4. 图像采集、处理与标注

  1. 在低剂量条件下，使用冷冻电子显微镜采集神经突的二维电子显微图像和/或三维倾转系列5。二维图像用于评估载网样品冰层厚度以及可用于三维倾转系列的潜在区域质量。
    1. 本实验中，所有图像均使用配备单倾液氮冷冻转移台的200 kV电子显微镜，结合4k × 4k CCD相机，在20k 显微镜放大倍数、目标欠焦值7 µm、采样率为4.4 Å/像素的条件下采集。
    2. 为获得样品的三维断层像，需在透射电子显微镜（TEM）中沿一个轴逐步倾斜样品，并在此过程中采集一系列投影图像。根据倾转角度及其他实验参数，可使用多种不同软件自动采集倾转系列图像5。此处展示的三维倾转系列在相同显微镜上采用半自动倾转系列采集软件26，以-60°至60°范围、5°步长、总电子剂量约60 e/Å2的条件采集。
  2. 使用图像处理软件21对神经突的倾转系列进行重构，具体方法如先前对其他样品所描述5,29。
  3. 对神经突的三维结构特征进行彩色标注：首先对断层像进行分割，然后使用三维图像处理软件生成表面模型，方法如前所述5。

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结果

在通过冷冻电子断层扫描（cryo-ET）进行冷冻和成像之前，应先对培养神经元的电镜载网进行光学显微镜成像。神经突应清晰可见，且彼此之间无明显重叠。在图3A中，彩色方框标示的区域被放大显示于图3B，其中可见神经突跨越载网的格栅结构延伸。每个网格单元均由带孔的碳膜构成，用于支撑神经元及其神经突。这些孔洞在4k倍率下拍摄的低剂量冷冻电镜图像中清晰可见，图像中神经元胞体表现为相对较大、较暗且电子密度较高的结构（图3C），神经突由此向外延伸。

在图3C中，选择位于碳膜孔洞上方的一段静息状态的神经突，用彩色方框标出，并在图3D中以更高放大倍数（20k）进行放大显示。在此放大倍数下，应能清晰观察到包括微管、囊泡和线粒体在内的明显内部细胞结构（图3D），尤其是在按照本方案制备的最优厚度冰层中。图像中央的深黑色结构（图3D）为六方晶系冰颗粒，被视为污染，通常应避免；...

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讨论

我们证明，大鼠胚胎神经元（背根神经节和海马神经元）可以在金质透射电镜（EM）载网上培养，并速冻形成足够薄的玻璃态冰层，从而能够利用二维冷冻电镜（cryo-EM）和三维冷冻电子断层成像（cryo-ET）对其神经突进行成像。尽管已有研究利用冷冻电子断层成像技术对海马神经突进行了成像8,10,18,23，但此前一直缺乏足够详尽、可借助市售设备成功重复操作的实验方案。此外，尽管前人研究开创性地将冷冻电子断层成像技术应用于海马神经突的可视化，我们的研究则进一步探索了该技术在多种类型神经元样本中的适用性。

本文详细描述了一种制备海马神经元和背根神经节（DRG）神经元电镜载网的实验方案，通过滤纸吸取使冰层达到理想厚度，并进行玻璃化冷冻，以用于冷冻电子断层扫描（cryo-ET）成像。最佳的滤纸吸取时间应确保冰层既不会过厚而阻碍电子束穿透，也不会过薄而导致在多孔碳膜边缘与孔洞中心区域之间的玻璃态冰出现明显不同的梯度。此外，使用玻璃化冷冻仪17获得理想厚度的冰层在不同项目中可能略有差异，熟练掌握该仪器以实现稳定可靠的冷冻效果需要一定的学习过程。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（PN2EY016525 和 P41GM103832）的支持。S.H.S. 获得了墨西哥湾沿岸联盟 W. M. Keck 交叉学科生物科学训练中心纳米生物学交叉学科研究生培训项目（NIH 基金编号 T32EB009379）提供的奖学金支持。

S.H.S. 解剖、培养并玻璃化保存了背根神经节和海马细胞；收集了背根神经节和海马轴突的冷冻电镜和冷冻电子断层扫描数据；对倾斜系列图像进行了重构和颜色标注。M.R.G. 在 M.N.R. 实验室中解剖并提供了海马细胞。S.C. 协助完成倾斜系列图像的标注工作。C.W. 指导 S.H.S. 学习神经元的解剖与培养技术。S.H.S.、W.C.M. 和 W.C. 共同设计了实验。S.H.S. 在其他作者的建议下完成了手稿撰写。

本视频拍摄于巴塞尔大学生物中心的细胞成像与纳米分析中心（C-CINA）。C-CINA 隶属于瑞士苏黎世联邦理工学院（ETH Zürich）位于巴塞尔的生物系统科学与工程系（D-BSSE）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dumont #7 镊子Electron Microscopy Sciences72803-01用于操作电镜载网
玻璃底培养皿MatTek Corp.P35G-1.5-10C用于样品培养
电子显微镜载网QuantifoilHoley Carbon, Au 200, R 2/2用于样品培养
无钙滤纸Whatman1541-055用于样品吸液
大号平头长镊Excelta CorporationE003-000590, 25-SA用于样品吸液 
玻璃化冷冻装置及镊子FEIVitrobot Mark III用于样品冷冻
小型载网储存盒Ted Pella, Inc.160-40用于储存电镜载网
冷冻转移 holderGatan626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder用于样品成像
半自动倾转系列采集软件SerialEMhttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/用于样品成像
图像处理软件IMOD eTomohttp://bio3d.colorado.edu/imod/用于图像处理
用于冷冻电镜的透射电子显微镜JEOL, Tokyo200-kV JEM2100 LaB6 电子显微镜用于样品成像
4k × 4k CCD 相机GatanN/A用于样品成像
三维标注软件Visage Imaging GmbHAmira/Avizo用于处理三维数据
用于数字拼接二维图像的软件AdobeAdobe Photoshop用于处理二维数据
DMEM 高糖培养基Invitrogen11965-118用于海马神经元培养
硼酸Sigma AldrichB-0252用于海马神经元培养
四硼酸钠Sigma AldrichB-9876用于海马神经元培养
Poly-L-lysine Sigma AldrichP2636-500MG用于海马神经元培养
过滤系统Corning430758用于海马神经元培养
Neurobasal 培养基Invitrogen21103-049用于背根神经节（DRG）培养
B-27 添加剂Invitrogen17504-044用于背根神经节（DRG）培养
青霉素/链霉素Invitrogen15140-122用于背根神经节（DRG）培养
GlutaMAXInvitrogen35050-061用于背根神经节（DRG）培养
重组大鼠 b-NGFR&D Systems556-NG用于背根神经节（DRG）培养
尿苷SigmaU3003-5G用于背根神经节（DRG）培养
5'-氟-2'-脱氧尿苷SigmaF0503-100MG用于背根神经节（DRG）培养
MatrigelBD Biosciences356234用于背根神经节（DRG）培养

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利用冷冻电子断层扫描技术观察处于冷冻水合状态神经突的原代神经元制备
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