本文描述了一种 原位 适用于福尔马林固定肾组织切片中microRNA表达比色检测的杂交实验方案优化
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摘要
摘要
本文介绍了一种通过地高辛标记的 microRNA 探针进行原位杂交，从而在肾脏组织中实现 miRNA 比色检测的方法。in situ 杂交最初由 Kloosterman 及其同事建立，广泛适用于 Exiqon miRNA 探针1，本文对该方法进行了改进，以克服在肾脏组织中进行 miRNA 分析时固有的技术难题，包括组织结构识别困难以及探针和抗体残留难以彻底去除等问题。采用相对较薄（5 mm 厚）的组织切片，可在保留细胞内强探针信号的同时，实现肾脏结构的清晰可视化。此外，优化了探针浓度和孵育条件，以在背景信号和非特异性信号较低的情况下，有效显示 microRNA 的表达水平。本文详细描述了该优化后的实验流程，涵盖从组织采集与制备到最终载玻片封片的全部步骤。本方案的基本组分可根据需要调整，适用于其他组织及细胞培养模型的研究。
引言
microRNA 是一类小的非编码 RNA（约 22 个核苷酸长），在细胞内源性产生。它们通常通过翻译抑制或 mRNA 降解来抑制蛋白质表达。miRNA 与 mRNA 靶标结合时互补性不完全，因此单个 miRNA 可能抑制多个靶标。
了解哪些细胞类型和结构表达miRNA，是理解miRNA表达改变如何影响细胞和组织表型机制的重要部分。虽然miRNA测序、qPCR和Northern blotting等方法可用于检测整体组织中的miRNA，但这些方法无法确定miRNA具体来源于组织内的哪一类特定细胞。在使用这些方法前对细胞和结构组分进行分离非常困难，且实现有效分离所需的条件可能导致基因表达改变或RNA降解。microRNA原位杂交是一种用于可视化miRNA在组织中定位及其表达水平的技术。该技术在由异质性结构组成的组织（如肾脏）中尤为有价值。
MicroRNAs 已被证实对肾脏发育具有调控作用2,3 生理学4微小RNA表达改变也已被证实参与肾脏病理过程，例如纤维化5-10糖尿病肾病7，肾细胞癌11,12，以及急性肾损伤13在我们的研究中，我们发现优化微小RNA 原位 肾组织的原位杂交对于确定miRNA在健康和疾病状态下的确切结构定位具有重要价值14确定不同microRNA在肾小管及细胞中的表达至关重要，因为其对靶基因的调控可能依赖于细胞功能。在疾病状态下，明确miRNA表达改变如何影响功能也具有重要意义。
本方法旨在基于Kloosterman等15、其他研究者16,17以及Exiqon1所建立的原位杂交（ISH）技术，并针对福尔马林固定肾脏组织进行优化。我们已成功应用该方法，在单侧输尿管梗阻模型中鉴定出肾脏微小RNA（miR-382）表达存在明显的区域差异18。该技术也可适用于其他组织，但需进一步优化。
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方案
1. 肾脏组织切片
- 使用 Microm HM 355 S 将经10%甲醛固定、石蜡包埋的肾脏组织切片切成5 mm厚的切片，并置于显微镜载玻片上。这些载玻片可在分析前储存数月。
2. 溶液配制
- 在可高压灭菌的螺旋盖瓶中，用 1 L 去离子水（ddH2O）配制 1× PBS 溶液。另取一个瓶子加入 1 L 去离子水（ddH2O）。向每个瓶中加入 1 ml DEPC，盖紧后剧烈摇晃。室温下静置过夜，以灭活 RNase，随后进行高压灭菌。向 1 L 1× PBS 中加入 400 ml Tween-20，配制成 PBS-T 缓冲液。
- 配制蛋白酶 K 缓冲液（含 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 1 mM CaCl2，溶于经 DEPC 处理的水中）。
- 用 PBS-T 配制 0.2% 甘氨酸溶液。
3. 组织制备
- 制备大量杂交缓冲液（50–100 ml），其中包含50%甲酰胺、5× SSC、0.1% Tween、9.2 mM柠檬酸（用于调节pH至6）、50 µg/ml肝素和500 µg/ml酵母RNA，溶于DEPC处理的ddH2O中。分装为1 ml等份，于-80 ºC保存。
- 用新鲜二甲苯洗涤组织3次，每次5分钟，以去除石蜡。
- 将组织切片依次在ddH2O中不同浓度的乙醇（100%、75%、50%和25%）中孵育5分钟，进行梯度水化。
- 加入足量DEPC溶液完全覆盖组织切片（约0.4–0.5 ml），处理1分钟。确保组织不干燥。
- 用DEPC处理的PBS-T溶液漂洗切片两次，每次5分钟，并将含DEPC的废液收集后妥善处理。自此步骤起，所有试剂均应经DEPC处理，以消除RNase污染。
- 预热蛋白酶K缓冲液，加入蛋白酶K至终浓度为10 μg/ml。用蛋白酶K溶液覆盖组织切片，在37 ºC孵育5分钟。
- 迅速吸去蛋白酶K溶液，加入PBS-T中的0.2%甘氨酸溶液，孵育30秒。
- 用DEPC处理的PBS-T溶液漂洗切片两次，每次30秒。
- 用新鲜配制的4%多聚甲醛固定切片10分钟。
4. 杂交
- 每个组织切片加入 50 µl 杂交缓冲液（50% 甲酰胺、5x SSC、0.1% Tween、9.2 mM 柠檬酸用于调节 pH 至 6、50 µg/ml 肝素、500 µg/ml 酵母 RNA），并用略大于组织切片的无 RNA 酶 HybriSlip 覆盖。
- 将切片置于湿度控制的杂交炉中，在针对 3’ 地高辛标记探针确定的杂交温度下预杂交 2 小时（通常为探针 DNA 熔解温度 Tm 减去 21 °C，即 miR-382 探针为 54 °C，其 DNA Tm = 75 °C），使用浸有 50% 甲酰胺/50% 5x SSC 的组织实验擦拭巾保持杂交室湿润。
- 用杂交缓冲液将 miRNA 探针、阳性对照（U6，小核 RNA）和阴性对照（随机序列）稀释至 40 nM（每张切片需 75 µl 缓冲液）。
- 将探针与杂交缓冲液混合物在 65 ºC 加热 5 分钟。
- 从杂交炉中取出载玻片，移除盖玻片及预杂交残留的多余杂交缓冲液。
- 每张组织切片直接加入 75 µl 含探针的缓冲液，覆盖组织区域；使用大小刚好能覆盖组织切片的 HybriSlip 覆盖。
- 保持载玻片架水平，放回杂交炉中，在步骤 4.2 确定的温度下过夜孵育（约 16 小时）。
5. 严谨性洗涤
- 加入 200 µl 预热至杂交温度的 2x SSC 缓冲液，置于盖玻片的一侧边缘下方，以帮助盖玻片从组织上脱落。通过倾斜载玻片移除盖玻片。
- 在杂交温度下，用 200 µl 含 50% 甲酰胺和 50% 2x SSC 的溶液洗涤载玻片，每次 30 分钟，共洗涤 3 次。
- 在室温下，于低速旋转摇床上用 PBS-T 溶液冲洗载玻片，每次 5 分钟，共冲洗 5 次。
6. 检测
- 将载玻片置于封闭缓冲液（含2%山羊或马血清、2 mg/ml BSA的PBS-T）中，在室温下于低速旋转摇床上孵育1小时。
- 用封闭缓冲液按1:100稀释抗DIG-AP Fab片段，每张组织切片加入100 µl，并用略大于切片面积的HybriSlip覆盖。
- 在湿润密闭容器中，4 °C条件下孵育抗体过夜（约16小时）。
- 在PBS-T中于低速旋转摇床上清洗载玻片，每次5分钟，共洗7次。
- 在AP缓冲液（100 mM TrisHCl pH 9.5，50 mM MgCl2，100 mM NaCl，0.1% Tween 20）中清洗载玻片3次，每次5分钟。
- 向AP缓冲液中加入NBT/BCIP溶液（200 µl/10 ml缓冲液）。
- 每张载玻片加入400–500 ml稀释后的NBT/BCIP溶液，完全覆盖所有组织切片，在避光、水平、湿润密闭容器中显色4–5小时。
7. 装片
- 将切片依次放入浓度递增的乙醇（25%、50%、75%、100%）中脱水，每种浓度各5分钟。
- 将切片置于二甲苯中孵育5次，以清除残留物。
- 用Permount封片介质封片，并在室温下干燥过夜。
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结果
在杂交、孵育或洗涤步骤中，组织切片中发生干燥的区域通常会在NBT/BCIP显色过程中出现更深的染色。图1显示了一张肾组织切片的部分区域，其中HybriSlip从组织边缘滑脱，导致该区域部分脱水。尽管在后续步骤中进行了再水化和覆盖，脱水区域的信号仍人为增强。
控制NBT-BCIP显色时间的重要性如图2A和图2B所示。显色时间超过4-5小时会导致在肾组织中，scrambled-miR对照探针出现明显的非特异性着色（图2A）。对于高丰度靶标（如U6小核RNA对照）的探针检测，孵育时间超过4-5小时并不能改善信号强度（图2B）。
在图3中展示了本研究所述原位杂交（ISH）方法在肾组织中检测miRNA的适用性，该图改编自Kriegel 等18的研究。在该研究中，我们发现与假手术动物相比，单侧输尿管...
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讨论
本文的目的是描述一种在福尔马林固定的肾脏组织中效果良好的miRNA原位杂交（in situ hybridization）实验方案。在优化该方案的过程中，已识别出多个导致染色伪影的重要来源。仔细注意这些关键点有助于避免染色伪影，并提高原位杂交实验成功的可能性。
在长时间孵育过程中，组织切片干燥是导致染色假象最可避免的原因之一。一旦发生干燥，干燥区域在NBT/BCIP显色过程中会呈现非常深的染色（图1）。在整个实验流程中，必须确保所有孵育步骤期间组织切片始终完全被液体覆盖，并且载玻片始终保持完全水平。此外，在杂交步骤和抗体孵育等长时间孵育过程中，应使用HybriSlip覆盖组织切片，以帮助防止液体蒸发。若观察到组织切片出现部分或完全干燥，则样品很难获得理想的染色结果，从而无法对这些样品中的miRNA表达进行准确解读。
在蛋白酶K消化和多聚甲醛处理步骤中，液体覆盖同样至关重要。该消化步骤的目的是允许miRNA探针进入细胞。如果在短暂孵育期间组织未能完全被液体覆盖，则未暴露于酶消化的...
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致谢
本研究工作由美国国立卫生研究院基金项目 HL082798 和 HL111580 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 70011044 | |
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma | D5758 | |
| 吐温-20 | Sigma | P1379 | |
| 二甲苯 | Sigma | 534056 | |
| 乙醇 | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| 甘氨酸 | J.T. Baker | 4059-00 | |
| 柠檬酸 | Sigma | C2404 | |
| 甲酰胺 | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC 缓冲液 | Life Technologies | 15557-044 | |
| 肝素 | SAGENT | 25021-400-30 | |
| 酵母 RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| 蛋白酶 K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA 探针 | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- 随机 miR 探针 | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR 探针 | Exiqon | 99002-05 | |
| 抗地高辛抗体 Fab 片段 | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount 封片剂 | Fisher | SP15-500 | |
| 盖玻片 | Fisher | 根据组织大小适配 | |
| Microtom HM 355 S 切片机 | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| 载片式杂交孵育箱 | Boekel | 241000 | |
| 铝制托盘组件 | Boekel | C2403973 | |
| 不锈钢架插入件 | Boekel | C2403754 |
参考文献
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