研究树木组织内节肢动物与微生物群落的技术

摘要

我们提供一种保存完整树木韧皮部并对其进行观察前处理的技术。我们构建了一种称为“韧皮部三明治”的装置，可用于引入并观察栖息于韧皮部组织中的节肢动物、微生物及其他生物体。

摘要

松树的韧皮部组织是成千上万种生物的栖息地。节肢动物和微生物利用韧皮部和形成层组织进行求偶、产卵、育幼、取食，或躲避树外的天敌及恶劣环境条件。由于这些生物位于树皮之下，其在韧皮部栖息环境中的活动难以直接观察。我们提供一种技术，用于保存完整的韧皮部组织，并将其制备成适用于无脊椎动物和微生物实验的样品。该装置被称为“韧皮部三明治”，可实现节肢动物、微生物及其他生物的引入与观察。该技术促进了人们对生活在树木韧皮部中生物的取食行为、生活史特征、繁殖、发育及种间相互作用的深入理解。该技术的优势包括使用低成本材料、三明治尺寸可调、可通过钻孔反复打开或引入多种生物，以及能够保持韧皮部结构的完整性与活性。韧皮部三明治是一种优秀的科学探究教学工具，适用于中小学（K-12）科学课程以及大学科研实验室。

引言

针叶树的韧皮部和树皮组织中栖息着成千上万种生物。韧皮部取食（phloeophagy），即取食树皮内层韧皮组织的行为，通常与树皮甲虫、钻木昆虫以及多种生活在树木内部的无脊椎动物和微生物类群相关。²³ 树皮甲虫（鞘翅目：象甲科）除成虫短暂离开以寻找新的寄主树木外，其整个发育和生活周期均在韧皮部内完成。³¹ 由于树皮甲虫对树木具有显著的经济影响，因此已被广泛研究^18,19，但针对其在树木组织内部行为的直接观察仍十分有限。⁴ 此外，树皮甲虫挖掘形成的坑道会成为众多物种的栖息环境。¹¹ 大量真菌³⁰、细菌³、螨类^10,21、线虫^16,19以及其他捕食性和寄生性节肢动物^22,24均生活在韧皮部组织中。本文所提供的技术可用于直接观察通常栖息于皮下环境中的树皮甲虫、螨类和钻木昆虫。通过对该实验方案进行轻微调整，也可用于研究真菌和细菌。

利用“韧皮部三明治”技术，可对树木组织内的树皮甲虫及其相关生物进行研究。该技术最早可追溯至1933年的文献记载，当时用于观察花斑冷杉甲虫（Dendroctonus pseudotsugae）的幼虫龄期。² 随着不同材料的出现，韧皮部三明治经历了多种改进形式。最初，该装置由一片韧皮部夹在两片玻璃板之间，并用橡皮筋压紧固定。² 此后，研究人员在制作三明治时陆续采用了夹具、胶带、胶水、塑料及其他材料。^{13,14,15,17,26,28} 本文所述的实验方案在以往设计基础上进行了优化。例如，过去通常从三明治侧面将试验物种引入玻璃或塑料板之间的缝隙，这种设计限制了虫道扩展的方向。而在顶板上设置进入孔，可使试验物种更自由地启动自然虫道的构建。本方案的另一优势在于结构简化，仅需少量工具即可轻松制作。韧皮部三明治的使用使得对取食行为、繁殖、发育以及生物间相互作用的直接观察成为可能，而这些在以往难以实现。^1,5,22 该方法也是K-12教育及科学课程与展示活动中的优秀教学工具。

在制备韧皮部三明治的过程中，存在一些细微之处，这些细节难以从文献中解读或未在论文中报道。我们认为，一种可视化（即， 需要一段视频来描述韧皮部三明治的制作过程，这将对研究取食韧皮部生物的科研人员和教育工作者具有重要价值。本实验方案提供了一种简单且经济的方法，用于观察栖息于韧皮部组织中的节肢动物、微生物及其他生物。

方案

1. 筛管的选择与树木组织的去除

1. 选择具有特定特征的树木。采集松树（i.e.，Pinus 属树木）的韧皮部，因为它们具有数毫米厚的明显韧皮层。^18,27 找到下部枝条较少的树木后，检查其是否存在昆虫侵害和/或病原体等其他缺陷。或者，在韧皮部夹层中可使用云杉等其他针叶树的韧皮部。⁹ 其他树种如硬木也可能适用于韧皮部的剥离。
   注意：树冠较大的针叶树通常具有最厚的韧皮组织。为最大限度获取韧皮部，最好选择树干（主干）上无缺陷且枝条较少的树木。自修剪型松树品种效果最佳。韧皮部通常在生长季节最厚，且树干较高处的韧皮部比靠近地面处更厚。秋季或冬季时，韧皮部有时难以从树木上剥离。
2. 砍倒树木或使用近期砍伐的原木以获取韧皮组织。选择倒树方向时，应尽量减少对目标树木及周围邻近树木的损伤。砍除主干上的枝条，以便在剥离韧皮部时更容易接触树皮材料。
3. 树木砍倒（放倒；倒在地上）后，立即使用锋利的刮刀从主干上刮除树皮（图1A）。刮除一定面积的树皮，直至暴露韧皮层。
   注意：韧皮层通常颜色较浅（例如，呈乳白色）且湿润，而外层树皮则较干燥、颜色较深（图1B）。需特别注意不要刮伤韧皮部。刮除树皮的面积取决于所需韧皮部样本的大小。
4. 去除树皮后，使用锋利的刀具切割出韧皮部样本的轮廓。确保刀具切割至木质部（图2A）。
5. 为剥离韧皮部，从韧皮部样本的一角开始，用手指小心地将其向后剥离。可使用刀具辅助从木质部上刮下韧皮部。持续拉剥，直至整块韧皮部完全分离。
   注意：韧皮部通常在夏季最容易从树木上剥离。若韧皮部极难剥离，可使用 spatula 形工具辅助操作。
6. 立即将韧皮部样本放入无菌袋中。为获得最佳效果，可对袋子进行真空密封（图2B）；若使用 ziploc 袋，则需将袋内空气完全排出。此举可延长韧皮部的保存时间。可选地，可将多个韧皮部样本置于同一袋中。将韧皮部储存在密封袋中，温度略高于冰点（1 至 10°C），以保持其新鲜度。

2. 制作韧皮部三明治

1. 切割两块相同大小的透明丙烯酸、聚碳酸酯或类似的透明硬质材料（例如，略大于韧皮部组织的玻璃片（图 2C）。将亚克力板的边缘打磨圆滑，以防止尖角撕裂Parafilm密封膜。本方案使用厚度为1/8英寸的透明亚克力板。
   注意：切割片段的大小取决于目标生物体的需求以及研究的持续时间。例如，一对树皮甲虫使用4 dm² 为期一个月的韧皮部观测，但仅需1 dm² 如果研究在数天内进行。
2. 在一块丙烯酸材料上钻孔，以便研究生物进入。孔的大小和数量取决于实验目的。图 2D).
3. 在将韧皮部置于亚克力片之间之前，对亚克力表面进行消毒（连同 > 70% 乙醇）或，若使用新的丙烯酸材料，则去除保护膜。
4. 将新鲜的韧皮部组织置于两块无菌丙烯酸板之间。根据需要，将带有孔洞的丙烯酸板朝向韧皮部的内侧或外侧。通常情况下，应使韧皮部的外侧（即原本带有树皮的一侧）朝向入口孔。

3. 封闭韧皮部夹心结构

1. 为在韧皮部夹心结构周围形成临时密封，使用宽2英寸的Parafilm膜条带包裹韧皮部夹心的边缘（图2C）。也可使用聚偏二氯乙烯薄膜包裹边缘进行密封。⁶ 随后，在夹心结构两侧各放置一个夹具，将亚克力板压紧至韧皮部。确保整个表面均被夹紧，以防止亚克力板与韧皮部之间产生空隙（图2C）。若夹紧不当，样本可能在亚克力板与韧皮部之间发生移动。
2. 为形成半永久性密封，可在韧皮部周围添加非粘接性环氧树脂或凡士林。确保密封材料完全包围韧皮部。随后使用夹具或带螺栓的螺丝（可能需要提前钻孔）将亚克力板紧密固定于韧皮部。此类夹心结构的有效期最长为一至两个月。
3. 根据研究生物的氧气需求，可在夹心结构的一侧或多侧添加空气过滤器。这将允许空气进入韧皮部夹心结构，同时减少韧皮部的水分流失。我们通常使用简单的活性炭过滤器，其还可降低真菌和细菌污染的风险。
4. 对于需要自由进出的研究样本，可将其中一块亚克力板替换为木材或其他类似材料，以便昆虫钻入。这一点对于钻木昆虫的观察尤为重要，因为它们在韧皮部层次完成幼虫阶段后，会进一步钻入木质部。
5. 为防止测试对象从入口逃逸，可在孔口上覆盖小型培养皿（或其他物体、胶带），以阻断逃逸路径。由于栖息于此类空间的生物通常适应低光照环境，可能需要将夹心结构置于暗室或暗箱中，或在其上方覆盖不透光材料以遮挡光线。

4. 观察韧皮部三明治中的生物体

1. 将研究样本引入韧皮部三明治的入口孔（图 2D）。在红光或调至低亮度的白光下，使用解剖显微镜观察样本（图 2E）。
2. 为记录样本在韧皮部三明治内的活动或生长情况，可将相机或摄像机连接至显微镜。将专用摄像机连接至显微镜目镜（图 2E & F）。对于螨类、线虫和伪蝎等体型极小的生物，应使用连接至显微镜的高清摄像机。
3. 为记录声音，可将麦克风插入韧皮部三明治的入口孔，或从其侧面插入。由于入口孔较小，应使用小型麦克风，例如驻极体电容麦克风。
4. 若需从韧皮部三明治的侧面或表面记录声音，可使用压电元件（图 3B）。播放声音时，可使用同一压电元件，或将触觉激励器（激振器）连接至亚克力板顶部或底部的表面。

结果

上述方案使研究人员能够观察栖息在树皮下隐秘环境中的生物。为了说明该技术的应用，我们介绍一项来自本实验室的代表性研究，该研究采用了此技术¹²。在本实验中，利用韧皮部三明治法观察声学处理对树皮甲虫繁殖力、掘道距离和存活率的影响（图2E和2F）。由于使用了韧皮部三明治，得以直接观察甲虫行为，并揭示了若干有趣的发现。首先，我们通过每24小时用记号笔在丙烯酸板上标记甲虫位置，记录其每日掘道距离。该过程揭示了不同声处理之间的显著差异，而这些差异若无韧皮部三明治则无法被察觉。其次，我们观察到特定声处理导致产卵量减少。韧皮部三明治的可移动特性使得研究人员能够在解剖显微镜下进行卵的观察，而不会干扰甲虫的正常活动。在观察过程中，我们使用连接至显微镜的高清摄像机记录了甲虫产卵行为。其他值得注意的观察结果包括配偶间的杀戮行为以及特定声处理引发的飞行启动行为。韧皮部三明治检测法对研究树皮甲虫对声学处理的响应至关重要。这些发现无法在树皮下环境中直接观察到，因而为应对树皮甲虫暴发的管理策略开发提供了宝贵的科学依据。

图 1. A) 从树木上去除树皮所需的工具。项目 1 和 2 为刨刀，用于刮除树皮。项目 3（短斧）和 4（拉锯）可用于清除靠近削皮区域的树枝。B) 使用刨刀从树上剥离树皮。注意红褐色树皮下方韧皮部的浅色部分。

图 2. A) 刮除树皮后去除韧皮部。 B) 新鲜韧皮部保存在真空密封袋中。 C) 用夹具将丙烯酸板固定在一起形成的韧皮部三明治结构，边缘包裹Parafilm以防止韧皮部污染和干燥。 D) 树皮甲虫靠近在丙烯酸板上钻出的孔洞。 E) 使用显微镜观察韧皮部三明治结构。 F) 韧皮部三明治内树皮甲虫的视频显示。

图 3. A) 从韧皮部三明治中的甲虫获取信息素。空气正被抽过含有Super-Q吸附剂的管道。B) 通过压电换能器（图中央）对韧皮部三明治内的山地松甲虫进行声音录制与回放。

讨论

韧皮部分层夹心法可用于引入并观察栖息于韧皮部组织中的节肢动物、微生物及其他小型生物^{1,7,8,9,17,18}。该技术已促成多项新发现，加深了人们对树木韧皮部内生物的行为、生活史特征、发育过程及相互作用的理解^1,5,10。本文所述的夹心法方案融合了以往多种设计的优点，可提供一种经济实用、仅需少量设备和材料即可轻松构建的夹心装置。玻璃、丙烯酸或聚碳酸酯片材可重复使用，唯一消耗性材料仅为帕拉菲尔膜（Parafilm）和韧皮部组织。

尽管本方案中的所有步骤都很重要，但某些步骤必须严格遵守，以确保最大程度的成功。首先，应选择树干部分无枝或少枝的树木。枝条过多的树木难以刮皮，且在去除韧皮部时需绕开每个枝条，导致获得的可用韧皮部片段较少。其次，必须尽量减少韧皮部暴露在空气中的时间。我们会在取下每一片韧皮部后立即放入袋中。当取下三至六片后，立即将其转移至真空密封袋；在野外工作中，我们使用电源逆变器连接车辆电池为封口机供电。最后，在执行本方案时对丙烯酸部件进行消毒并保持整体清洁，可减少“三明治”结构中的真菌生长，这一点对于长期观察尤为重要。

如上所述，筛管夹心装置存在一定的局限性。由于筛管层较薄，只能引入通常栖息于筛管中的小型生物。较大的昆虫，例如钻木甲虫（i.e., Buprestid, Cerambycid 物种），可被引入并观察其生命周期的早期阶段，但该观察时间通常仅限于两到三周；此后幼虫需要进入木质部木材中进行化蛹。相比之下，对于树皮甲虫，尤其是Ips属的种类，可观察到完整的生命周期，包括交配、卵孵化、取食、化蛹以及羽化为成虫。此时，夹心装置的可用性通常因干燥和真菌生长而终止。²⁸ 此外，该装置无法让昆虫自由且自然地定殖或离开筛管夹心结构。²⁷

我们的方案在所用韧皮部的大小、形状和类型方面具有灵活性。短期研究所需的韧皮部材料较少，三明治结构的尺寸可相应调整。多种针叶树种已被用作韧皮部三明治中的韧皮部供体例如， 北美黑松¹²，花旗松²，云杉²⁹，火炬松²⁷，长叶松²⁷）。三明治结构中的材料也可进行调整；例如，可使用玻璃板代替丙烯酸板，以及使用环氧树脂或胶带代替Parafilm。

该实验方案中最困难的部分是韧皮部的去除过程。相邻树木的韧皮部去除难度可能存在差异。当某棵树的韧皮部较难去除时，耐心尤为关键。在此类情况下，应仔细地将刀片插入坚硬的木质部与疏松的韧皮部之间进行分离。这一过程的操作感受与给树木“剥皮”完全相似。

掌握基本的夹心技术后，可对实验方案进行调整以满足特定需求。例如，通过优化去除韧皮部所需的技术，可以移除并使用更大的组织片段来制作更大的夹心结构。此外，还可对方案进行修改以适配特定仪器，例如，增加用于监测化学物质释放的孔洞（图 3A），或用于记录和播放声音的装置（图 3B）。也可进行改造，以实现对韧皮部及其共生生物的半永久性保存，或对可后续释放的生物进行临时观察。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抽拉刀片	Big Horn Brand	20265	11” 刀片
去鳞刀	American Angler	30530	9” 刀片
聚碳酸酯	Nexan	GE-33	厚度 0.093 英寸
Parafilm M	Fisher Scientific	S37441	宽 2”
夹具	Pony Jaw Opening	3201-HT-K	4” × 1”
真空封口机 及封口袋	FoodSaver	V2840; FSFSBF0742-015	卷装 VacLoc 真空 袋