同时记录视交叉上核神经元的电生理活动与钙成像

摘要

本文描述了同时记录膜电位或电流以及细胞内钙离子浓度变化的方法。通过全细胞膜片钳配置的膜片钳电极，将钙离子指示剂bis-fura-2导入视交叉上核神经元中。

摘要

同时采用电生理记录与荧光成像方法，用于研究膜电位或电流变化在调控细胞内钙离子浓度中的作用。环境条件的改变（例如明暗周期）可调节下丘脑视交叉上核（SCN）中神经元及神经网络的活动，以及该区域作为哺乳动物脑内主生物钟所在部位的一系列昼夜节律钟基因的表达。兴奋性突触传递可导致突触后细胞内Ca²⁺浓度升高，这一过程被认为能够激活信号通路，从而改变昼夜节律钟基因的节律性表达。本研究使用含SCN的下丘脑脑片，通过填充有钙离子指示剂双呋拉-2（bis-fura-2）的内液微电极进行膜片钳记录。当微电极与SCN神经元膜之间形成高阻封接后，通过轻柔负压使细胞膜破裂，钙探针随之扩散进入神经元，填充胞体及树突区域。在记录膜电位或膜电流的同时，同步进行细胞内钙离子浓度的定量比率测量。利用这些方法，可研究突触活动及单个神经元动作电位发放所引起的细胞内钙离子浓度变化的作用。在本演示中，我们展示了在脑片中维持的单个SCN神经元上，同步记录其电生理活动与细胞内钙信号的技术方法。

引言

已知神经元中基因表达的变化是突触信号传导的结果。兴奋性神经递质谷氨酸的信号传导可使神经元膜电位去极化，最终导致基因的转录与翻译^1,2。谷氨酸激活离子型受体后，允许细胞外钙离子进入细胞，钙离子被认为作为第二信使在激活基因转录过程中发挥关键作用。要评估膜电活动（如动作电位发放频率）与细胞内钙离子浓度变化之间的关系，需要结合两种方法——全细胞膜片钳技术和荧光钙探针的定量成像技术^3-5，从而可在单个神经元中研究这种关系。单细胞记录技术可记录脑内特定区域单个神经元的活动。全细胞记录技术能够控制膜电压或膜电流，从而实现对特定离子通道电流的实验性操控。使用充满荧光钙探针的微电极还可确保神经元被充分填充钙探针。该技术在处理成年动物脑切片样本时具有明显优势，因为这些神经元使用更常见的细胞渗透性探针难以负载，且该方法可减少潜在的背景荧光干扰问题^6-8。

光是哺乳动物调节其位于下丘脑视交叉上核（SCN）的昼夜节律钟的主要方式。视网膜中转换的光信号通过视网膜下丘脑束（RHT）传递^9-11，并在SCN中释放谷氨酸^12,13。谷氨酸激活位于SCN神经元上的NMDA和AMPA离子型受体，导致钙离子和钠离子内流，进而启动细胞内信号级联反应，最终改变一组时钟基因的表达^14-17，并引起昼夜节律钟的相位偏移^18-20。然而，钙离子可通过离子型谷氨酸受体直接进入神经元，也可通过膜去极化及电压依赖性钙通道（VDCC）的激活进入细胞²¹。因此，我们建立了一种实验方案，用于研究SCN神经元中细胞内钙离子浓度与膜电活动之间的关系，例如动作电位发放和突触输入所引发的变化²²。

方案

1. 下丘脑脑片的制备

1. 提前获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）对涉及动物的任何操作的批准。此处描述的动物操作程序符合《2013年美国兽医协会动物安乐死指南》，并已事先获得俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会的批准。 & 科学大学动物照护与使用委员会（IACUC）。
2. 配制 500 ml 不含 MgCl₂ 的切片缓冲液₂ 和 CaCl₂ (表1）。用95% O₂₂ 和5% CO₂ 室温下孵育，然后加入 MgCl₂₂ 和 CaCl₂ 持续通气的同时，用蔗糖将渗透压调节至300 mOsm。使用蒸气压渗透压计测定渗透压。
3. 制备1 L不含MgCl的记录液₂ 和 CaCl₂ (表2）。用95% O₂₂ 和5% CO₂ 然后加入 MgCl₂₂ 和 CaCl₂ 继续通气的同时，用 NaOH（10 N）将 pH 调至 7.2–7.4，用蔗糖将渗透压调至 300 mOsm。HEPES 缓冲液的添加为可选步骤，用于进一步稳定 pH。
4. 切片和记录用溶液可在使用前于冰箱中保存数天。
5. 制备3%琼脂糖，倒入无菌培养皿中（6 mm深），冷藏。
6. 切取三块大小约为 6 mm × 6 mm × 6 mm 的琼脂糖凝胶块。
7. 用异氟烷深度麻醉一只4至8周龄的Sprague-Dawley大鼠。检测麻醉深度，当足垫受夹捏后无后肢回缩反射时，表明麻醉深度适当。确认麻醉适当后，通过快速断头法处死大鼠。 
8. 迅速取出脑组织，注意先切断视神经，然后将其置于冰冻的、饱和5% CO₂的切片液中₂ 和 95% O₂₂ 静置冷却 2-3 分钟。
9. 修剪脑组织。将脑组织用镊子放置在置于冰上、盛有玻璃培养皿中的湿润（用切片液湿润）圆形滤纸上。
10. 冠状面切取脑组织，去除残留的小脑和脑干，然后切除前部皮层及两侧部分，保留包含下丘脑的脑组织块，注意保护含有视交叉上核（SCN）、视神经和视交叉的一侧。
11. 在冰冷但干燥的切片机切片室中，涂抹一层足够大的氰基丙烯酸盐胶水薄膜，以固定脑组织和琼脂糖块。
12. 将冰冷的脑组织块尾侧朝下转移到胶水上，使包含视交叉上核（SCN）的一侧朝向最先切割的方向，视神经位于该侧并形成一个 "V" 指向上方。
13. 将琼脂糖块放置于其余三侧。用持续通入5% CO₂的冰冻切片缓冲液填充切片室。₂ 和 95% O₂₂氰基丙烯酸酯胶水遇湿气会固化，从而固定脑组织和琼脂糖块。
14. 切取冠状下丘脑切片（220-250 µm厚）包含视交叉上核（SCN）的脑片。通常选择视交叉宽度约为2-4 mm的切片，此时视交叉呈白色条带状，SCN位于其背侧，在视交叉两侧各有一个微小的“凹陷”。^rd 心室（图1A).
15. 将切片置于记录室中（36 °C）固定在 Leica DMLFS 显微镜载物台上。灌流室中持续灌注以 95% O₂ 混合 5% CO₂ 预先饱和的记录液（流速 2 ml/min）₂ 和5% CO₂₂ 并使用管路加热器预热。
16. 在脑片制备后0.5–8小时，对SCN神经元进行全细胞膜片钳和钙成像记录。

2. 膜片钳记录

1. 在半倍总体积的水中配制电极内液（细胞内液）溶液。
2. 用1 N KOH将溶液pH值调节至7.3。
3. 加入剩余的水。溶液的终末渗透压应为280-290 mOsm。
4. 将电极液通过 0.2 µm 滤膜过滤，分装（0.5 ml）至微量离心管中，于 -20 ℃ 保存 °C.
5. 将1 mg bis-fura-2六钾盐与99.29 μL溶剂混合，配制钙探针bis-fura-2六钾盐储备液（10 mM）。 µ0.2 升 µm 过滤水
6. 分装至不同的离心管中（2-5 µl 每份）并冷冻（-20 °C）。
7. 解冻一份内液和Ca²⁺ 探针在使用前短暂添加。加入2 µ将 bis-fura-2 储存液 1 微升加入至 400 微升中 µ内部溶液的最终体积为50 l µM 钙探针浓度。轻轻吹打混匀溶液。钙探针浓度（10–250 µM）根据实验设计和成像系统的不同而有所变化。请注意，bis-fura-2 由两个相连的 fura-2 分子组成。
8. 分两个阶段拉制全细胞膜片钳电极，使其外径尖端直径约为1 µ兆欧姆（7-10 MΩ）Ω 用细胞内液填充时。
9. 用少量回填电极 µ含钙探针的内液，经4 mm注射器滤器（0.2）过滤 µm) 通过Microfil管对低体积样品进行操作。
10. 在红光照射下，通过视频监视器观察，将电极引导进入记录室时，对其施加少量正压。 
11. 使用低倍物镜（4X）将微电极置于视交叉上核（SCN）上方。SCN表现为位于第三脑室两侧、视交叉背侧的两个半透明区域。图1A).
12. 将显微镜切换至高倍放大（40X 或 63X）。在更高放大倍数下，可针对视交叉上核（SCN）的亚区及单个 SCN 神经元进行记录。
13. 将微电极向前推进至神经元表面时，施加轻微的正向压力。
14. 对微电极施加轻柔的负压，以形成电阻为3-10 GΩ的封接Ω.
15. 使用采集软件控制的放大器将膜电位调节至 -60 mV。
16. 对电极施加额外的负压，以破裂细胞膜，进入全细胞记录模式。
17. 进入全细胞模式后，SCN神经元的胞体和树突会充满荧光探针。
18. 在监测和存储钙探针图像数据的同时（如下所述），以电流钳模式测量膜电位，或以电压钳模式测量电流。在实验过程中查看采集到的图像以及340 nm/380 nm荧光比值的数据图。

3. 细胞内 Ca²⁺ 的测定

1. 定量 Ca²⁺ 通过单色器以10 nm带宽、分别在340 nm和380 nm波长下快速激发组织，并经UG11光学滤光片过滤以阻断400 nm以上谐波波长，再经400 nm DCLP二向色镜反射，发射光通过510 nm滤光片，记录一对图像以获取测量数据。±40 nm 发射滤光片
2. 使用冷却CCD相机采集图像，通过调整曝光时间和像素合并模式，以最小化光漂白并最大化记录速度。
3. 使用定量成像软件采集和显示图像。
4. 从初始图像中选择感兴趣区域，以转换为相对荧光强度单位数据（即. 胞体，树突， 等等。）。同时选择一个区域用于测量背景荧光（图1B).
5. 原始图像和定量的光学数据在实验过程中持续保存。实验结束后，通常会重新分析所保存的图像，以便有更充足的时间更精确地选定需定量的目标区域。
6. 数据可以表示为估计的细胞内钙离子浓度（Est[Ca²⁺]i)。通过340 nm激发后发射光强度与背景扣除后的比值（R）除以380 nm处的相应比值，并结合340 nm和380 nm处的最大与最小荧光强度，用于计算钙离子浓度⁴使用数据分析软件进行背景扣除及其他计算。
7. 一个 在 体外 使用10 mM CaCl可测定bis-fura-2荧光的最大值和最小值₂ 用于 Ca²⁺ 结合态与10 mM EGTA用于Ca²⁺ 自由条件。Ca²⁺ 探针的解离常数 Kd 取 bis-fura-2（Invitrogen）的值为 370 nM。

结果

利用下丘脑脑片，我们在全细胞模式下同时记录了电压钳和电流钳条件下细胞内钙离子的变化。如图1A所示，在高倍镜（40X 或 63X 紫外物镜）下，将微电极在施加少量正压的情况下缓慢下放至目标位置。接触神经元后，通过轻柔抽吸形成吉欧姆封接。在电压钳模式下，将细胞膜电位设定为 -60 mV 后，进一步施加抽吸以破裂膜片，形成全细胞记录构型。在显微镜监视器上可观察到神经元迅速被探针染料填充。与胞体处于相似焦平面的树突结构也可被观察到（图1A 插图）。此外，也可调整焦平面以测量远端树突中的钙离子变化。在 -60 mV 电压钳条件下，我们通过施加短暂（2 毫秒）至 +20 mV 的电压阶跃（频率为 10 Hz）来模拟动作电位的发放，该频率处于许多 SCN 神经元白天动作电位发放率的生理范围内（图1B 和 图1C）。对神经元的不同兴趣区域（ROI），包括近端树突，进行定量分析，并在每个波长下扣除背景信号，以计算在 340 nm 和 380 nm 激发光激发下发射荧光的比值（图1B，插图...

讨论

上述方法提供了一个强大的工具，可以同时记录神经元膜电活动与细胞内钙浓度之间的联系。该方法具有许多优点，因为它结合了两种非常充分表征的方法 - 全细胞膜片钳记录和使用荧光染料测量细胞内钙。我们的方法与其他研究人员描述的方法类似^_6,23。

使用该方法时必须考虑许多项目。首先是使用全细胞贴片配置，这导致用细胞内微电极溶液透析细胞内容物。透析可导致电压门控离子通道的衰减和第二信使介导信号的丢失^24-26。其次，细胞损伤或千兆欧密封损坏可导致钙水平升高，这可能与细胞输入电阻降低有关²⁴。第三，在填充微电极之前应过滤含有探针的细胞间溶液，以避免堵塞微电极尖端。通过最小化这些因素，细胞内钙和膜电活动可以同时在膜片钳形神经元中记录超过 30 分钟。我们使用 β-Escin 穿孔贴片方法²⁷ 和双呋喃-2 来减缓透析并增加记录时间取得了一些成功。第四，钙和螯合剂 EGTA 或 BAPTA 是用于稳定细胞内钙浓度的细胞间溶液的常见成分。然而，我们没有将这些纳入我们的记录条件下，透析神经元可能会...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Fisher Scientific 公司	S271-3
KCl	Fisher Scientific 公司	P217-500
NaH2PO4•H2O	Sigma化学公司	S-9638
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific 公司	M33-500
CaCl2•2H2O	Fisher Scientific 公司	C79-500
D-葡萄糖	Fisher Scientific 公司	D16-500
NaHCO₃3	Fisher Scientific 公司	S233-500
蔗糖	Fisher Scientific 公司	S5-500
D-葡萄糖酸钾	Sigma-Aldrich	G4500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
腺苷5′′三磷酸二钾盐二水合物	Sigma-Aldrich	A8937
鸟苷-5′′三磷酸三钠盐	Sigma-Aldrich	G9002
琼脂糖（超纯）	Life Technologies	15510-027	将凝胶倒入无菌培养皿，形成6 mm厚的层
KOH	Sigma-Aldrich	P-6310
NaOH	Sigma-Aldrich	S-5881
双呋拉-2，六钾盐	Invitrogen	B6810	细胞非通透性
设备名称	公司	货号	评论
切片机	Leica	VT1000S	组织切片
氰基丙烯酸酯胶水（Roti-Coll1）	卡尔·罗斯特有限责任公司	货号 0258.1
微电极拉制仪	Narshige International USA	PP-83
微电极毛细管	World Precision Instruments	1B150F-4
Microfil 34 g	World Precision Instruments	MF34G-5
注射器滤器	康宁	#431212
显微镜	Leica	DM LFS	配备4倍、40倍紫外和63倍紫外物镜，以及落射荧光装置
CCD相机	滨松	ORCA ER	12 bit CCD
Fura-2滤光立方体	染色	71500A	使用 UG11 滤光片设置
多色染料 IV	Till Photonics GmBH		单色计时器
紫外线阻隔安全眼镜	紫外产品
EPC-9 放大器	HEKA Eletronik
Metafluor	Molecular Devices		成像软件
Patchmaster	HEKA Eletronik		数据采集软件
Igor version 6	Wavemetrics		电生理学 &和 Ca2+ 数据分析
VAPRO 5520	Westcor		蒸气压渗透压计