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由废水中提取的电活性微生物生物膜：生长、维护与基本表征

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DOI：

10.3791/50800

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2013年12月29日

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

本文内容

摘要

演示了在三电极体系中，由恒电位仪控制，于分批补料反应器内通过计时安培法培养阳极电活性微生物生物膜的过程。采用循环伏安法，在有电子供体和无电子供体条件下对胞外电子传递进行表征。同时演示了基本的数据分析方法。

摘要

利用恒电位仪控制的三电极体系，在分批补料反应器中演示了由废水接种物培养阳极电活性微生物生物膜的过程。恒电位仪的使用可精确调节电极电位，并确保微生物培养条件的可重复性。在培养过程中，通过计时安培法（CA）监测电流的产生。根据这些数据计算最大电流密度（j最大）以及库仑效率（毛细管电泳) 被讨论作为表征生物电催化性能的测量方法。循环伏安法（CV）是一种非破坏性的 即一种非侵入性方法用于研究电活性细菌的胞外电子传递（EET）。在存在微生物底物的条件下，对阳极生物膜电极进行循环伏安法（CV）测量。 即. 转换条件，且在无底物的情况下， 即 非周转条件下，采用不同扫描速率进行实验。随后，通过实例展示数据分析过程，并推导与解释微生物胞外电子传递的基本热力学参数：峰电位（Ep），峰值电流密度（jp），形式电位（Ef) 和峰分离（ΔEp）。此外，本文还将探讨该方法的局限性以及数据分析的最新进展。因此，本视频文章旨在提供基本实验步骤和基础数据分析的指南。

引言

阐明微生物胞外电子传递（EET）的基本原理并将其应用于人工系统，是当前至关重要且迅速发展的研究与开发领域1-3。对这些电活性（或生物电催化或电化学活性）微生物的研究，包括纯菌株、明确的共培养体系以及复杂的群落，需要一系列复杂的技术、方法和实验方案4。这些方法源自多个科学学科，例如电化学、材料科学和微生物学，可在不同层级上提供深入见解，即从完整的微生物生物膜到单个分子。其中，电化学及电化学方法构成了所有研究活动的基础。

传统上，在这些工程系统的原型——微生物燃料电池（MFCs）中，通常采用类似燃料电池的装置来培养和维持电活性微生物的生长5遗憾的是，这类微生物燃料电池通常无法监测甚至控制单个电极的电位，因此对电极过程的理解极为有限。 仅报告了电池电压。如今，人们越来越认识到，对微生物燃料电池（MFC）中单个电极电势进行独立监测与控制具有明显优势，这不仅对基础研究至关重要，也对工程应用具有重要意义。此外，随着微生物电化学技术应用范围的不断拓展，目前已包括 例如 修复、脱盐、合成，甚至生物计算，在所谓的微生物生物电化学系统（BES）中实现2,6,7 单独控制各个电极电位通常至关重要。这种控制通常通过使用外部电源或恒电位仪来实现。因此，使用恒电位仪能够— 与其他类型的装置相比—— 精确调节各个电极电位至关重要，因为电极作为胞外电子传递过程中的终端微生物电子受体（对于阳极）或电子供体（对于阴极）。 图1 展示了阳极上微生物电子传递（EET）当前的研究现状 详见细节 例如2,4,6,8,9 阴极的EET仍主要未被开发利用10.

因此，控制电极电位不仅能够实现微生物培养条件的可重复性，还可根据胞外电子传递（EET）的热力学特性对培养条件进行定制化调控。11本文展示了如何通过恒电流法（CA）和循环伏安法（CV）结合分批补料反应器实验，提取电活性微生物生物膜的特征参数。这些参数包括最大电流密度j最大值）和库仑效率（毛细管电泳）以及EET特性。此处对形式电位（Ef) 可能与实际的电子传递位点将成为研究重点。这些参数的提取以源自废水的混合培养生物膜为例进行说明，该生物膜主要由 地杆菌属物种.12 这些废水来源的生物膜是通过一种简单的电化学筛选程序获得的 如世界范围内众多研究团队所证实13-16.

研究微生物胞外电子传递的动态电化学技术

对于电活性微生物培养物电子传递过程的热力学表征，需要采用动态电化学技术。通常这些技术包括电位控制的， 即 伏安法，以及电流控制， 即电化学动力学技术17因此，电位控制技术更为普遍，包括例如方波伏安法和线性扫描伏安法18然而，最常用的是循环伏安法（CV）19,20循环伏安法在电化学的各个领域中广为人知且广泛应用，涵盖电池研究 通过 材料科学到酶生物电化学21将其应用于活体微生物细胞仅可追溯到十多年前22 并在最近几年显著增加23,24尤其是循环伏安法与光谱学方法的结合，为揭示激发态能量传递（EET）机制及其分子本质提供了前所未有的深入见解。 例如25,26 同时，微生物胞外电子传递热力学及理论特性的提取理论框架得到了拓展和深化27-30然而，实验操作不当或数据分析不充分常常阻碍了循环伏安法在微生物电化学领域的恰当应用。因此，除了研讨会之外（例如 在欧盟-ISMET 2012会议上的教程19本视频文章将为电活性细菌的循环伏安实验提供基本操作指南。内容重点在于基本实验步骤和基础数据分析，而非提供最新的动力学分析方案。以下讨论中涉及的最重要术语汇总于 方框 1 （改编自 Harnisch 和 Freguia）19 并经过修改。

方案

由于在生物电化学分批补料反应器中的筛选过程因底物选择和缺氧条件而具有高度特异性，因此在本示例中无需无菌操作条件。

1. 生长培养基的制备

  1. 根据 Kim 的方法，使用磷酸盐缓冲液制备适量的培养基 等13 （参见 表1）。此处乙酸钠（10 mM）作为底物。本文所使用的培养基仅为一种示例，可根据实验目的调整其组分。
  2. 加入1 ml 每20份原生废水 毫升 作为接种物的生长培养基。废水样品取自市政废水处理厂在机械过滤后的环节（例如参见 图2）并可在4℃下密封保存至多三个月，以备后续使用 °C.
    （注意：根据实验目的，初始细胞数量可能至关重要，此时应予以测定。在本示例中，初始细胞数量并不重要，因为生物膜将达到稳态条件。）
  3. 将培养基（含接种物）用氮气吹扫至少30分钟以去除其中的氧气，具体操作为将针头插入培养基中，并打开氮气气流。  液流应足够强，以确保能够观察到培养基的充分混合。
    （注意：根据培养基体积的大小，甚至应考虑延长脱气时间。在脱气过程中设置补料分批反应器（步骤 2.1–2.2））

2. 补料分批反应器的设置

  1. 取一个合适的反应容器- 此处使用一个改良的250 ml四颈圆底烧瓶。
    （注意：反应器通常应至少具有四个入口，以用于连接三个电极以及取样和培养基更换。当反应器因取样或更换培养基而定期开启时，可忽略产生的气体体积；或者，应安装气泡计数器。为避免不必要的趋光性生长，反应器应避免直接暴露于光照下。）
  2. 对于三电极体系（参见 图3 将参比电极（RE）（此处为 Ag/AgCl，饱和 KCl，0.197 V 相对于 SHE）、工作电极（WE）和对电极（CE）通过各自的入口插入烧瓶中（详见第 3 节） 通过 硅胶塞——密封，确保气密性。
    （注意：使用工作电极和对电极的石墨棒。将电极导线穿过硅胶塞并在外部固定。参比电极通过硅胶塞上的钻孔插入。为避免短路，确保电极之间无任何物理接触，即使在搅拌或培养基循环过程中也应如此。放置电极时，应使其完全浸没于培养基溶液中。为密封起见，用Parafilm包裹每个入口处的硅胶塞。）
  3. 通过取样口将含有接种物的培养基（此处为250 ml）倒入反应器中，同时用氮气冲洗。
  4. 用硅胶塞封闭最后一个入口并确保密封严实。注意：残留的氧气不会对混合物种生物膜造成损害。这些生物膜能够耐受甚至消耗低水平的氧气，但这可能会降低库仑效率（CE）。

3. 计时安培法生物膜生长

  1. 将电极连接至恒电位仪相应的电缆上。将容器置于温度可控的腔室中，此处为35 °C 被使用31，以确保环境条件恒定。
  2. 打开控制恒电位仪的软件，选择技术：计时安培法。设置参数，例如：施加一个恒定电位 E我们 0.2 V（相对于 Ag/AgCl）持续一段时间 t 500小时≈ 20 天）。电流以时间步长 d 记录ti 每分钟
    注意：所施加电位的选择取决于所研究的体系或微生物。通常，在正电位下研究阳极过程，在负电位下研究阴极过程。也可根据电子供体/受体的标准电位以及预期的微生物电子传递位点的正式电位推断出合适的电位；此处作为起点，请参考近期文献。
  3. 开始计时安培法。软件会绘制出随时间变化的测量电流曲线，所观察到的最大电流（i最大是一个重要的在线参数，详见第4和第5节。 

4. 生物膜的维持

  1. 根据环境条件的不同， 例如温度升高时，氧化电流开始流动并达到稳定平台（参见 图4）。当电流再次降至零后，暂停计时电流法测量并补充培养基溶液。为促进生物膜更快生长，可在电流达到最大值平台期后立即更换培养基。打开取样口，小心地在不破坏薄层生物膜的前提下排出旧培养基。在重新加入培养基时再次通入氮气进行冲洗。关闭取样口并确保密封严实。
  2. 重复步骤 4.1 的操作，直至最大氧化电流达到稳态（参见 图4).
    （注意：一个恒定的 i最大值 被认为表明已形成稳定的稳态生物膜。
  3. 取1 ml 用于底物分析的新鲜培养基和换液后培养基样品， 例如. 通过高效液相色谱法（HPLC）测定。初始底物（乙酸盐）浓度（c0）以及剩余底物溶液的浓度（c1) 随后将用于效率计算（见第节 数据分析).
    注意：为了获得未改变的结果， 例如 由于会进一步消耗底物，应立即分析底物样品。若无法立即分析，请将样品置于-18℃或更低温度的冷冻条件下保存 °C，不超过一个月。

5. 应用循环伏安法研究电子传递

  1. 在电流流动的峰值和谷值处进行循环伏安法测定，如图所示（图4）。根据研究问题的不同，通常在系统达到稳态后进行循环伏安法（CV），以获得可比较的结果。（注：电流的产生称为 turnover 条件，与底物的微生物氧化及随后的电子传递相关：即微生物生物电催化；而非 turnover 条件下的 CV 则是在恒电流（CA）中接近零电流流动时进行的。）
  2. 在恒电位仪控制软件中选择技术：循环伏安法，并设置适当的参数，例如：将工作电极（EWE）的初始电位 Ei 设为 -0.5 V（相对于参比电极 RE），扫描速率 v=dE/dt 为 1 mV/sec ，扫描至顶点电位 E1 为 0.3 V（相对于 RE），再返回起始电位 E2 = Ei = -0.5 V。
    注：使用循环伏安法时，恒电位仪随时间线性改变施加于工作电极的电压（见图5）——框2 提供了选择实验参数及故障排除的基本原则。
  3. 启动循环伏安法，并记录足够数量的循环，以获得可重复的 CV 曲线。通常至少需要 3 次循环。  所得曲线称为循环伏安图（亦见图7）。注：根据测量条件的不同，可获得不同的信息，如下一节所示。

6. 数据绘图

此处仅讨论数据的绘图方法。更详细的论述将在下一节中展开。

  1. 使用合适的数据分析软件，此处所有数据均导出为文本格式，并作为 ASCII 文件导入。
  2. 计算并优先使用电流密度（j）而非绝对电流（i).
    （注意：然而，由于计算方法的不同，各种方案在计算时 j 确实存在，需明确指出所使用的是哪一种。此处为几何面积归一化的电流密度， 即. 采用电极的投影表面积。
  3. 计时安培法 将测得的电流密度随时间的变化绘制成图。
  4. 循环伏安法 将测得的电流密度作为工作电极电位的函数进行绘图 E我们.

结果

1. 计时安培法

通过计时安培法测量可计算出两个操作特性：最大电流密度（j最大), 即 每秒最大电子流，以及库仑效率（凝胶电泳), 即总电流流动与消耗的底物之间的关系。 图4 显示了使用补料分批反应器测得的典型计时安培法生物膜生长曲线，包含多个生长周期。在初始的迟缓期后，出现第一个电流密度峰值。随后由于底物耗尽，电流再次下降。当电流接近零时，按指示更换培养基。在底物补充后，电流密度再次上升，且后续的电流密度峰值高于第一个峰值。经过多个生长周期后 j最大 是恒定的——表明形成了稳态的生物膜14. 当达到稳态时 j最大 其数值取决于多个参数， 例如 电极材料、反应器温度和生物膜组成通常被视为特定电活性微生物生物膜/电极系统的特征。（对于流通式反应器而言，并非如此 j最大，但采用恒定的稳态电流密度。第二个操作特性是库仑效率 (CE) (公式 1。这就是作为电流流动所记录的电子数量， Qp ，与理论最大电子数相关的分批补料周期 Qth, 根据该循环中底物消耗量计算得出。

静态平衡公式 CE=QP/Qth×100；流程图中的效率计算。

（公式 1）

通过积分恒电流曲线可获得总转移电荷量（另见图6）：

电荷计算公式，\( Q_P = \int_0^t i \, dt \)，积分方法。

（公式 2）

根据法拉第定律可计算出理论上的可能电荷量：

热力学方程 Qth=ΔcVzF，化学势分析，用于教学。

（公式 3）

其中 V 为培养基体积，F 为法拉第常数（F = 96,485.34 C/mol），z 为氧化底物释放的电子数（以乙酸为例，其氧化为 CO2 时释放 8 个电子），Δc = c0-c1 表示底物消耗量（通过化学分析方法测定，例如 高效液相色谱法）。

2. 循环伏安法：

在非周转条件和周转条件下记录循环伏安图（如图4所示）。在这两种情况下，均可获得不同类型的信息。下文将讨论如何鉴定可能的和实际的胞外电子传递位点。

2.1 非周转条件——鉴定可能的 EET 位点：

图7 显示非循环条件下的典型循环伏安图， 即在无底物的情况下。 图7A 显示了高扫描速率（此处为 50 mV/sec）下生物膜的循环伏安图，其中仅出现一对峰，表明仅存在一个形式电位 Ef 可以被确定。通常，氧化峰的峰电位可用于计算氧化还原电对的形式电位 EpA 及其相应物种的还原峰 EpC 通过计算算术平均数（另见 图 7C):

电化学方程式：Ej = (EpA + Epc)/2，用于分析伏安法研究中的氧化还原电位。

（公式 4）

当对相同的生物膜施加足够低的扫描速率（此处为 1 mV/sec）时，可识别出多达四个氧化还原电对（各自的正式电位如图 7B所示）。原因是使用较低扫描速率时，电容性背景电流会降低，详见框 1及例如17,21。然而，非周转循环伏安图仅显示电极表面所有的氧化还原活性化合物，因此反映的是可能的胞外电子传递（EET）位点的Ef。只有对周转循环伏安图进行分析，才能获得实际参与电子传递的EET位点的Ef（见步骤 2.2）。

进一步分析非循环伏安曲线时，可考察其他特征参数，如峰分离ΔEp（公式 5），以及最大峰电流ipA和最小峰电流ipC（见图7C）。

静力平衡方程 ΔEP=EpA-EpC；用于教学目的的公式示意图。

（公式 5）

这些参数，尤其是针对不同扫描速率记录的参数，可用于电极上电子转移过程的机理与动力学分析。然而，尽管此类动力学分析在化学体系中已较为成熟，但将其应用于电活性微生物生物膜时却并不直接可行，参见e.g.19,30

  1. 转换条件——鉴定实际的电子传递位点：

在存在底物的情况下进行循环伏安法测定时，会得到催化循环伏安图（参见 图8A）。绘制数据后，可观察到典型的S形、即所谓的生物电催化曲线17-19一阶导数的最大值 即循环伏安曲线的拐点给出了形式电位 Ef 的 实际的 EET 位点（参见 图8B）。对于年轻个体而言， 即薄的， 地杆菌科以生物膜为主导的体系中，此处为开始恒电位（CA）后168小时，可观察到两个拐点。随后，其导数曲线显示出两个极大值，分别对应于生物电催化活性电子传递（EET）位点的形式电位：-0.376 V 和 -0.295 V（相对于Ag/AgCl，饱和KCl，即相对于标准氢电极SHE为0.197 V）。在 图7B 这些位点被称为 Ef,2 和 Ef,3，分别。该发现还表明，与标准电位相关的氧化还原过程 Ef,1 和 Ef,4 （在非周转循环伏安图中）与生物电催化无关。随着生物膜的生长和增厚，循环伏安图仅显示一个拐点， 即，即在导数曲线上仅有一个极大值。该形式电位 Ef，此处为相对于饱和KCl的Ag/AgCl电极的-0.32 V，约等于指定用于该薄生物膜EET的两个表观电势的算术平均值例如 此处 Ef,2 和 Ef,3）——参见 图9这表明，这种非常基础的循环伏安分析能够以快速且非侵入的方式提供有关电子传递热力学的见解，但值得注意的是，其无法得出进一步的机理或动力学结论。

值得注意的是，通过本方案中特定条件获得的生物膜主要由 地杆菌 物种（本演示未展示）12,15. 更改所选参数 例如 底物，温度 等等还会影响微生物群落组成，从而影响其电化学特性。

表1. 根据Kim et al.32 的培养基配方

组分(mg/L) / (ml/L)   
NaH2PO4•H2O2,690.00
Na2HPO44,330.00
NH4Cl310.00
KCl130.00
乙酸钠820.00
金属溶液12.50
维生素溶液12.50
表2. 金属和维生素溶液的组分33。
微量元素溶液：维生素溶液：
组分mg/L   组分mg/L   
氮川三乙酸1,500.0生物素2.0
MgSO4•7H2O         3,000.0叶酸2.0
MnSO4•2H2O         500.0盐酸吡哆醇10.0
NaCl  1,000.0盐酸硫胺素5.0
FeSO4•7H2O          100.0核黄素5.0
CoSO4 或 CoCl2     100.0烟酸5.0
CaCl2•2H2O            100.0DL-泛酸钙5.0
ZnSO4   130.0维生素B120.1
CuSO4•H2O10.0对氨基苯甲酸5.0
AlK(SO4)2               10.0硫辛酸5.0
H3BO3 10.0
Na2MoO4•2H2O     10.0
注：将氮川三乙酸用KOH溶解至pH 6.5，然后继续加入矿物质。


电化学术语示意图；包含电化学中的方程和公式。
循环伏安法参数设置与故障排除指南，重点介绍电位窗口和扫描速率的调整，以优化CV实验。

微生物电子传递示意图；MET、DET、MIET、DIET 途径；电子传递分析。
图1. 微生物胞外电子传递可能机制的示意图。 点击此处查看高清图像。

水样采集过程；使用水桶采样器从污水处理流程中采集样品。
图 2. 在格栅集水装置后于污水处理厂进行采样（德国污水处理厂）。 点击此处查看大图。

电化学池示意图与带有恒电位仪和电极装置的照片；标注了对电极（CE）、参比电极（RE）和工作电极（WE）。
图3. 三电极系统装置。（A）示意图，（B）实际反应器；CE = 对电极，RE = 参比电极，WE = 带有电活性微生物生物膜的工作电极，SP = 取样口。 点击此处查看高清图像。

电化学图；CV分析；电流与时间；稳态方法；数据单位为微安和小时。
图 4. 基于分批补料废水接种物的生物膜生长的计时安培曲线图。在三次培养基更换循环后，氧化电流达到稳态。图中标注了延迟期、培养基更换时间点，以及在稳态生物膜条件下进行循环伏安法（CV）和非周转CV分析的时间点（原始数据来自 Liu14）。点击此处查看高清图像

电化学分析，E-t图，循环伏安法，电位随时间变化，分析化学。
图5. 循环伏安法一个周期中的典型电位-时间过程。 循环伏安法从初始电位 Ei 开始，施加的电压随时间以扫描速率 v 线性变化。在选定的顶点电位 E1 处，电压返回至终点电位 E2，此处 E2 = Ei。点击此处查看大图。

显示电流密度 j 与时间 t 的电化学分析图，展示峰值 jmax。
图 6. 源自废水生物膜一个生长周期的典型计时电流曲线；图中标识了最大电流密度 jmax、流过的（实际）电荷量 Qp、初始底物浓度 c0 以及一个生长周期后的底物浓度 c1 。 点击此处查看高清图像。

电化学分析图；显示电流与电压关系的循环伏安图。
图7. 一种G. sulfurreducens生物膜的非周转循环伏安图。 扫描速率：(A) 50 mV/sec，(B) 1 mV/sec 23；(C) B的局部放大图，显示阳极在峰值处的峰电流密度（jpA）及其对应的峰电位（EpA）。相应地，在谷值处显示阴极的峰电流密度（jpC）及其对应的峰电位（EpC）。形式电位Ef和峰分离ΔEp分别由公式4和公式5得出（详见下文说明）。点击此处查看高清图像。

电化学分析；伏安法图谱；电流与电位关系；峰检测；数据分析。
图8. （A）代谢活跃的G. sulfurreducens生物膜的周转循环伏安图。扫描速率为5 mV/sec。（B）伏安曲线的一阶导数23。图中标出了实际电子传递位点的形式电位：Ef,2和Ef,3。 点击此处查看高清图像。

Cyclic voltammetry graph; current vs. potential; electrochemical analysis; data results.
图9. (A) 厚度较大的代谢性样品的循环伏安图与 (B) 其一阶导数 G. sulfurreducens 生物膜. 扫描速率为 5 mV/sec（比较 图8). 单击此处查看大图。

讨论

本文方案展示了一种利用废水接种物，在三电极系统和补料分批反应器中培养电活性微生物生物膜的简便且直接的方法。恒电流法可用于从多种接种源中培养并筛选电活性微生物生物膜，并对生物膜的最大电流密度和库仑效率进行基本表征。循环伏安法作为一种非侵入性技术，可用于研究微生物生物膜电子传递（EET）的热力学特性，从而识别可能和实际的EET传递位点。综合这些参数，可实现：i）在相同条件下对不同微生物生物膜进行表征与比较；ii）在相同电活性微生物生物膜条件下，研究不同运行条件的影响。然而，这些实验仅能作为研究的起点。一方面，微生物生物电化学这一多层面领域需要进一步深入开发和应用电化学方法与实验方案，包括提取动力学与机理数据的模型，以及电化学阻抗谱等其他方法。34,35另一方面，电化学方法无法提供有关分子特性、微生物组成以及微生物空间结构的信息， 等等需要进一步采用非侵入性且与电化学联用的技术，或侵入性技术4.  方框 2 对实验过程中关键步骤以及初步故障排除进行了简要讨论。 

从工程学角度来看，必须考虑到电活性生物膜阳极仅仅是当前微生物生物电化学系统的一个组成部分，还需分析多种其他因素以实现对整个系统的全面理解。36然而，我们希望本视频文章能有助于理解并定制BES的核心要素， 即 微生物电极

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

F.H. 感谢德国联邦教育与研究部（BMBF）（“下一代生物技术工艺——生物技术2020+”研究奖）和亥姆霍兹联合会（青年研究者小组）提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
初级废水废水处理厂机械过滤后采集
250 ml 圆底烧瓶，带三个额外进样口Th.Geyer Berlin GmbH，德国9.011 845额外进样口由本单位玻璃工安装
Ag/AgCl 参比电极（饱和 KCl，0.195 V 相对于 SHE），带陶瓷隔膜Sensortechnik Meinsberg，德国SE 11
石墨棒（Ø=1 cm，l=3 和 5 cm）CP-Handels-GmbH，Wachtberg，德国用作电极材料
不锈钢，1.4301 号，Fe/Cr18/Ni10 型导线Goodfellow GmbH，Bad Nauheim，德国155-923-05
硅胶塞Th.Geyer Berlin GmbH，德国9.230 512 和
ParafilmneoLab，Heidelberg，德国3-1011用于密封以维持厌氧条件
恒电位仪/恒电流仪 MPG2 型BioLogic Science Instruments，法国
EC-LabBioLogic Science Instruments，法国用于执行电化学测量的软件
Origin 8.6OriginLab数据分析软件

参考文献

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由废水中提取的电活性微生物生物膜：生长、维护与基本表征
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