一种用于果蝇觅食行为的单体检测方法 果蝇

摘要

在本视频文章中，我们描述了一种自动化检测方法，用于测量饥饿或饱腹状态对成年果蝇Drosophila melanogaster依赖嗅觉的食物搜寻行为的影响。

摘要

对于许多动物而言，饥饿会以促进寻找合适食物来源的方式影响其嗅觉系统。在本视频文章中，我们描述了一种自动化检测方法，用于测量饥饿或饱食状态对成年果蝇Drosophila melanogaster依赖嗅觉觅食行为的影响。实验在一个避光的箱体内进行，箱内使用果蝇无法感知的红光照明，通过摄像头连接定制的数据采集软件，可同时监测六只果蝇的位置。每只果蝇被限制在独立的实验区域内活动，区域中央放置食物气味源。 实验区域底部为多孔材质地板，可有效防止气味积聚。通过软件分析确定果蝇定位气味源的潜伏期，该指标反映了不同生理状态下嗅觉敏感性的变化。本文中，我们将讨论实施该行为学范式的关键操作步骤，并涵盖果蝇装载、气味污染、检测温度、数据质量及统计分析等方面的具体问题。

引言

饥饿状态会促进两种摄食相关行为：觅食和进食¹。这一简单的行为检测方法可用于研究与觅食相关的趋化性行为^2,3。具体而言，该方法可追踪果蝇的位置、行走速度以及定位食物气味目标所需的时间。食物发现的潜伏期可作为衡量果蝇在内部摄食动机状态改变后，其嗅觉检测系统敏感性变化的指标。此前的手动检测方法曾被用于证明GABA-B受体信号在成年果蝇气味定位行为中的重要性³。目前的自动化检测版本在研究短神经肽F（sNPF）信号如何重塑黑腹果蝇（Drosophila）的嗅觉图谱并影响摄食相关行为方面发挥了关键作用²。

实验在黑暗且温湿度受控的房间内进行。位于透明丙烯酸测试板上方的数码摄像机通过660 nm LED背光照明追踪果蝇的活动。摄像机采集的信息由测试区域旁的计算机实时处理。我们使用数据采集软件记录并保存测试期间果蝇位置的坐标信息。

在此实验范式中，将受试对象释放到一个中央含有食物气味的区域内；该气味源在区域内形成食物气味梯度，从而诱导果蝇产生觅食行为。类似的气味搜寻方案已应用于单个Drosophila幼虫的化学感应研究⁷。尽管其他行为检测方法，如四区嗅觉仪^4,5或T型迷宫⁶，可用于评估气味回避或趋向行为，但此范式最适合用于评估嗅觉敏感性和趋化行为。<....

方案

1. 果蝇采集与饥饿处理

1. 在受控的温度和湿度条件下饲养实验果蝇（例如 21 °C，相对湿度50-60%，12小时光照/12小时黑暗循环条件下
2. 在羽化当天收集雌蝇，将其与4-5只雄蝇一同放入新的培养管中（每管最多30只），在2-5天内完成饲养。
3. 准备果蝇饥饿实验用的培养室。
   1. 将一张组织巾（4.8 x 8.4 英寸）推入空塑料管底部。用蒸馏水彻底浸湿组织巾。使用物体按压组织巾，并轻轻挤出多余水分。
   2. 将小瓶倒置以倒掉多余的水。水量应足以保持果蝇的水分和饥饿室的湿润，但不应过多以免淹死果蝇。
4. 将果蝇从培养管转移至饥饿室，并在实验开始前约18-24小时封堵管口。将培养管置于受控的温度与湿度条件下过夜，直至次日实验开始。

2. 食物气味的制备

1. 在玻璃烧瓶中加入 0.1 g 低熔点琼脂糖和 10 ml 蒸馏水，配制 1% 琼脂糖溶液。将琼脂糖溶液放入微波炉中加热，直至刚开始沸腾但尚未溢出为止。
   1. 停止微波加热，轻轻旋转烧瓶一次。重复此步骤两次，直至琼脂糖完全溶解。将烧瓶置于设定为 50 °C 的加热板上保温，以保持琼脂糖溶液处于液态。
2. 取 990 μl 的 1% 琼脂糖溶液和 10 μl 苹果醋，加入一个 1.....

结果

数据分析软件及其布局（示例见图1）用于根据一组分析标准评估每只果蝇在10分钟试验期间的表现。以下标准用于确定是否采用每只果蝇的数据进行数据分析，旨在剔除因受伤、疾病、应激或缺乏动机而无法完成觅食任务的果蝇。

若果蝇静止不动超过 300 秒，则被视为“不活跃”，其数据将被排除，除非满足以下任一条件：a）已成功找到食物源；或 b）在静止期结束后至少 100 秒内的平均速度 >10 mm/sec （图 2a、2b、2c）。

健康的果蝇从滞留室释放后会立即表现出强烈的搜寻行为。因此，为了仅筛选出在主动嗅觉搜寻早期阶段具有正常运动速度的果蝇，只有在实验开始的前50秒内运动速度处于特定范围内的个体才会被纳入数据分析。该标准基于以下观察结果：a）当果蝇接近气味源时，其运动速度会下降；b）在实验的前50秒内，极少有果蝇能够到达气味目标。速度标准是通过评估在特定实验温度下至少100只对照组果蝇的平均运动速度来确定的，其中速度的上限和下限分别设定为平均速度加减一个标准差。例.......

讨论

在本实验方案中，我们描述了一种用于食物搜寻行为检测的逐步操作流程。除了与食物相关的气味外，该方法还可适用于研究果蝇定位其他气味源的能力。例如，可用于研究雄性果蝇寻找配偶的行为³ 。关于本实验方案，我们在此提出以下若干补充注意事项：

首先，饲养温度决定了实验果蝇在测试前应培养的时间长度。建议检测多个年龄阶段，以确定实验最合适的果蝇年龄。例如，根据我们的经验，当果蝇在21 °C下饲养时，在饲养4-5天后，饲喂组与饥饿组果蝇的反应差异最为显著。

其次，LED灯照射一块玻璃漫射板，从而在亚克力培养室下方产生均匀且恒定的照明。充分均匀、稳定且明亮的照明对于果蝇运动的自动追踪至关重要。不均匀的光照或闪烁的光源可能导致果蝇自动追踪出现错误，表现为间歇性无法检测果蝇位置，或导致软件将光伪影误认为果蝇本身。我们发现，无论是商用LED背光灯还是自行搭建的LED阵列，均能同样良好地满足本实验的照明需求。

第三，如果软件错误地将光照或琼脂糖的微小变化识别为额外的物体，则需调.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
苹果醋	Spectrum		市售可得
琼脂糖，VII型	Sigma-Aldrich	A0701	低凝胶温度琼脂糖
丙烯酸测试板		定制	板上包含6个区域。每个区域直径为60 mm，高度为6 mm。具体尺寸请参见测试板示意图。
LabVIEW V.8.5	National Instruments	776670-09	程序平台：PositioningTool.vi，FlyTracking--Six Zones.vi 注意："elapsed time.vi"、"time into file.vi" 和 "two object detect.vi" 是必需的子程序，必须可用，以便主数据采集程序 "FlyTracking--Six zones.vi" 能够运行。
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6	Wavemetric, Inc.		宏平台：Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones
Basler scA1390-17fm	National Instruments	779980-01	数字相机 注意：相机驱动程序可在 Baslerweb.com 获取
8 mm镜头	National Instruments	780024-01	Basler数字相机镜头
磨砂玻璃漫射板	Edmund Optics	定制	用于散射光线，尺寸为25 cm × 30 cm
US Std. No. 100	Fischer Scientific	04-881X	筛网，标称孔径为150 μm
照明选项1
660 nm LED背光（20 cm × 20 cm）	Spectra West	BL47192	一种更简单但成本更高的照明方案。
LED背光电源	Spectra West
照明选项2
660 nm LED	Superbrightleds	RL5R1330	波长660 nm（约7×7的LED阵列，用于14.7英寸×9.75英寸的面板）
线性直流电源	GW Instek	GPS-1830D	LED面板电源
无焊面包板	Digikey	922354-ND	用于LED的面包板