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一种用于果蝇觅食行为的单体检测方法 果蝇

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DOI：

10.3791/50801

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2013年11月4日

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1Neurobiology Section, Division of Biological Sciences, University of California-San Diego, 2Department of Neuroscience, Columbia University, 3Dart NeuroScience, 4School of Dental Medicine, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

在本视频文章中，我们描述了一种自动化检测方法，用于测量饥饿或饱腹状态对成年果蝇Drosophila melanogaster依赖嗅觉的食物搜寻行为的影响。

摘要

对于许多动物而言，饥饿会以促进寻找合适食物来源的方式影响其嗅觉系统。在本视频文章中，我们描述了一种自动化检测方法，用于测量饥饿或饱食状态对成年果蝇Drosophila melanogaster依赖嗅觉觅食行为的影响。实验在一个避光的箱体内进行，箱内使用果蝇无法感知的红光照明，通过摄像头连接定制的数据采集软件，可同时监测六只果蝇的位置。每只果蝇被限制在独立的实验区域内活动，区域中央放置食物气味源。 实验区域底部为多孔材质地板，可有效防止气味积聚。通过软件分析确定果蝇定位气味源的潜伏期，该指标反映了不同生理状态下嗅觉敏感性的变化。本文中，我们将讨论实施该行为学范式的关键操作步骤，并涵盖果蝇装载、气味污染、检测温度、数据质量及统计分析等方面的具体问题。

引言

饥饿状态会促进两种摄食相关行为：觅食和进食1。这一简单的行为检测方法可用于研究与觅食相关的趋化性行为2,3。具体而言，该方法可追踪果蝇的位置、行走速度以及定位食物气味目标所需的时间。食物发现的潜伏期可作为衡量果蝇在内部摄食动机状态改变后，其嗅觉检测系统敏感性变化的指标。此前的手动检测方法曾被用于证明GABA-B受体信号在成年果蝇气味定位行为中的重要性3。目前的自动化检测版本在研究短神经肽F（sNPF）信号如何重塑黑腹果蝇（Drosophila）的嗅觉图谱并影响摄食相关行为方面发挥了关键作用2。

实验在黑暗且温湿度受控的房间内进行。位于透明丙烯酸测试板上方的数码摄像机通过660 nm LED背光照明追踪果蝇的活动。摄像机采集的信息由测试区域旁的计算机实时处理。我们使用数据采集软件记录并保存测试期间果蝇位置的坐标信息。

在此实验范式中，将受试对象释放到一个中央含有食物气味的区域内；该气味源在区域内形成食物气味梯度，从而诱导果蝇产生觅食行为。类似的气味搜寻方案已应用于单个Drosophila幼虫的化学感应研究7。尽管其他行为检测方法，如四区嗅觉仪4,5或T型迷宫6，可用于评估气味回避或趋向行为，但此范式最适合用于评估嗅觉敏感性和趋化行为。

该检测方法具有多个关键优势。首先，由于数据采集和分析过程基本实现自动化，因此能够快速获取大量数据集。其次，该方法可分离并测量单只果蝇的行为，从而消除了可能影响其行为的社会性嗅觉信号。第三，实验方案简单，实验设计简洁，使得该检测方法效率高且易于向他人传授。

此外，该检测方法可结合黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）所拥有的丰富遗传工具8，进一步探究食物搜寻行为背后的神经环路。利用GAL4-UAS系统以及UAS-shibirets1、UAS-破伤风毒素和UAS-TrpA1(B)等转基因工具，可实现对神经元沉默或激活的靶向基因表达9-12。

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方案

1. 果蝇采集与饥饿处理

  1. 在受控的温度和湿度条件下饲养实验果蝇（例如 21 °C，相对湿度50-60%，12小时光照/12小时黑暗循环条件下
  2. 在羽化当天收集雌蝇，将其与4-5只雄蝇一同放入新的培养管中（每管最多30只），在2-5天内完成饲养。
  3. 准备果蝇饥饿实验用的培养室。
    1. 将一张组织巾（4.8 x 8.4 英寸）推入空塑料管底部。用蒸馏水彻底浸湿组织巾。使用物体按压组织巾，并轻轻挤出多余水分。
    2. 将小瓶倒置以倒掉多余的水。水量应足以保持果蝇的水分和饥饿室的湿润，但不应过多以免淹死果蝇。
  4. 将果蝇从培养管转移至饥饿室，并在实验开始前约18-24小时封堵管口。将培养管置于受控的温度与湿度条件下过夜，直至次日实验开始。

2. 食物气味的制备

  1. 在玻璃烧瓶中加入 0.1 g 低熔点琼脂糖和 10 ml 蒸馏水，配制 1% 琼脂糖溶液。将琼脂糖溶液放入微波炉中加热，直至刚开始沸腾但尚未溢出为止。
    1. 停止微波加热，轻轻旋转烧瓶一次。重复此步骤两次，直至琼脂糖完全溶解。将烧瓶置于设定为 50 °C 的加热板上保温，以保持琼脂糖溶液处于液态。
  2. 取 990 μl 的 1% 琼脂糖溶液和 10 μl 苹果醋，加入一个 1.5 ml 离心管中，配制成 1% 苹果醋溶液。涡旋振荡使溶液充分混匀，然后置于设定为 50 °C 的干浴孵育器中。

3. 测试房间与行为实验箱的设置

  1. 将测试房间调节至所需的环境条件（例如 温度和湿度）。
  2. 打开LED面板（660 nm）。
  3. 用热水冲洗筛网和测试板，并将其放入干燥烘箱中加热，直至所有水分蒸发。在开始实验前，将筛网和测试板冷却至测试房间的温度。
  4. 在扩散板上方放置一个浅盘，并加入水以提高局部湿度，同时掩盖琼脂糖液滴中的水分。
  5. 将筛网置于水盘上方。

4. 将果蝇装入检测板

测试板的规格示意图可在补充文件部分找到。测试板由透明丙烯酸材料制成，包含6个测试区域。一个简单的滑动装置包含容纳室，可在实验开始时允许果蝇的装载、临时固定，并同时将6只果蝇释放到各自的测试区域中。测试板每个区域中心刻有十字标记，指示应将气味物质滴加的位置。

  1. 将滑块插入丙烯酸测试板中。
  2. 轻轻将吸虫器插入小瓶，穿过棉塞，让约6只果蝇自行爬入吸虫器。操作过程中务必尽可能轻柔。可利用果蝇的趋光性，将小瓶开口朝向微弱光源，诱导果蝇向吸虫器内爬行。如有必要，也可施加轻微负压，吸取约6只雌性果蝇。
  3. 将吸虫器尖端插入测试板的第一个孔中，让一只果蝇进入固定孔，然后轻轻推动滑块前进，将果蝇装入下一个孔。重复此操作，直至所有6个固定孔均被果蝇占据。
  4. 用移液器吸取5 μl的1%苹果醋酸琼脂溶液，直接滴加在测试板内表面十字交叉线的中心位置。

5. 测试板的定位

  1. 为使测试板居中，请打开名为 "Positioning Tool.vi" 的文件。该 LabVIEW VI 文件可在补充文件部分找到。通过点击屏幕左上角的白色箭头运行该文件。
  2. 将测试板放置在筛网之上，使测试区域开口朝向筛网底部，气味目标位于测试板顶部。将刻在测试板背面的十字线与显示器屏幕上的十字线对齐。
  3. 完成对齐后，点击显示器左上角附近的红色圆点以中止程序运行。

6. 记录实验过程中的果蝇位置

  1. 为了在每次觅食试验中追踪并记录果蝇的坐标，打开采集软件文件 "果蝇追踪——六区域.vi" “Fly Tracking--Six Zones.vi”的LabVIEW虚拟仪器文件可在补充文件部分找到。通过点击显示器左上角的白色箭头来运行该文件。
  2. 为文件命名并点击 "好的。"
  3. 推动测试室中的滑块，使果蝇进入测试区域。注意不要移动测试室，以免导致与分析软件坐标的对齐不准确。
  4. 点击 "开始" （开始录制），并确保测试室内的唯一光源为660 nm LED面板。
  5. 试验结束后，取下筛网和行为观察室。将测试板从筛网上提起，并通过将平板浸入冰中来移除果蝇。用热水轻轻清洗平板，去除所有琼脂糖残留物。将测试板放入干燥烘箱中以除去水分。
  6. 通过开启小型风扇对测试区域通风约 2 min。关闭风扇，将下一组果蝇装入下一个测试板中。

7. 使用自定义软件进行数据分析

“果蝇追踪数据分析——六区域”可在补充文件部分找到。在数据采集过程中，采集软件会将每只果蝇在每个时间点的位置坐标记录到一个文本文件中。一台位于测试板正上方的数字相机以0.5 Hz的帧率采集图像。分析软件程序"Data Analysis for Fly Tracking-Six Zones"从该文本文件中提取信息，用于：a）计算果蝇的平均速度；b）确定果蝇成功定位气味源的时间点；c）生成图形窗口，使用户能够查看：果蝇的位置、果蝇随时间变化与气味源之间的距离，以及果蝇随时间变化的平均速度。该软件还可将数据格式化，便于轻松导出至电子表格程序。在此宏中，觅食潜伏期定义为果蝇在 arena 中心半径5 mm范围内持续停留至少5秒的时间点。

  1. 打开分析软件文件 "Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones"。在 "Windows" 选项卡下，点击 "Create New Table"。重复此步骤，直至创建六个表格。
  2. 在 "Macros" 选项卡下，点击 "Foodfinding"。主面板应出现以下选项：Open Raw Data File for Layout；Open Raw Data File for Data File；Fly Location；Distance；Speed；Layout；FormatDataFile。
  3. 若要查看原始数据而不将数值追加到文本文件中，请点击 "Open Raw Data File for Layout"。在弹出的浏览器窗口中定位并选择实验数据文件，然后点击 "Open"。
  4. 点击 "Fly Location" 以查看每只果蝇在六个实验区域中的位置（屏幕上应出现六个X-Y图，分别描绘每只果蝇随时间变化的位置）。
  5. 点击 "Distance" 以查看每只果蝇距气味源的距离（屏幕上应出现六个图表，分别描绘每只果蝇随时间变化距气味源的距离）。y = 5 mm 处的水平线表示果蝇被认为已到达食物源的阈值。
  6. 点击 "Speed" 以查看每只果蝇在试验期间的平均速度（屏幕上应出现六个图表，分别描绘每只果蝇随时间变化的速度）。
  7. 点击 "Layout" 以显示一个布局，其中包含所有果蝇的位置、距离和速度图，以及每只果蝇的平均速度（前50秒内）和发现气味源的潜伏期 (图1)。为正确查看该布局，可能需要调整页边距。为此，请先点击布局窗口。在 "File" 选项卡下，点击 "Page Setup for Layout"。将页边距重置为0.2英寸，然后点击 "OK"。每个位置图的左侧均有一个小表格，表头为 "Speed" 和 "Latency"。各表头下的数值分别表示平均速度（mm/sec）和觅食潜伏期（秒）。Latency 下为空白条目表示该果蝇未能定位到气味源。觅食潜伏期定义为果蝇在距离培养皿中心5 mm半径范围内持续停留至少5秒的时间点。
  8. 要打印布局，请点击布局区域（将布局更新为当前文件）。点击 "File"，然后点击 "Print Layout"。
  9. 要查看下一个文件，只需点击 "Open Raw Data File for Layout"。选择要查看的下一个原始数据文件，然后点击 "OK"。点击 Layout 窗口以用新数据文件更新窗口内容。
  10. 设置可保存在实验文件中以供后续使用。

8. 将数据分析软件中的数据导出至电子表格程序

  1. 要导出每个文件的速度和延迟数据，请点击 "打开数据文件的原始数据文件。" 选择一个实验数据文件并点击 "开放。" 将打开一个新浏览器窗口。
  2. 在新打开的浏览器窗口中，右键单击 "新" 然后点击 "文本文档。" 为新文本文件命名。选择新命名的文本文件，然后单击 "开放。" 将原始数据文件中的数据存储到文本文件中。
  3. 要从另一个文件导出数据，请点击 "打开数据文件的原始数据文件。" 单击另一个文件，然后单击 "开放。" 选择8.2）步骤中的文本文件。对剩余需要导出的数据文件继续执行此过程。
  4. 当所有所需的数据文件均已添加到文本文件后，单击 "格式化数据文件。" 选择用于存储之前步骤数据的文本文档，然后单击 "打开" （新窗口将自动打开）。
  5. 在窗口中创建一个新的文本文档，为文件命名，然后单击 "保存。" 这将创建一个文本文件，其中包含每只果蝇的文件名、平均速度和潜伏期，可导入电子表格程序。
  6. 累积图根据果蝇在不同时间到达食物气味目标的总数绘制而成 （图3）).
  7. 使用比例 z 检验对实验数据集进行统计学显著性分析。

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结果

数据分析软件及其布局（示例见图1）用于根据一组分析标准评估每只果蝇在10分钟试验期间的表现。以下标准用于确定是否采用每只果蝇的数据进行数据分析，旨在剔除因受伤、疾病、应激或缺乏动机而无法完成觅食任务的果蝇。

若果蝇静止不动超过 300 秒，则被视为“不活跃”，其数据将被排除，除非满足以下任一条件：a）已成功找到食物源；或 b）在静止期结束后至少 100 秒内的平均速度 >10 mm/sec （图 2a、2b、2c）。

健康的果蝇从滞留室释放后会立即表现出强烈的搜寻行为。因此，为了仅筛选出在主动嗅觉搜寻早期阶段具有正常运动速度的果蝇，只有在实验开始的前50秒内运动速度处于特定范围内的个体才会被纳入数据分析。该标准基于以下观察结果：a）当果蝇接近气味源时，其运动速度会下降；b）在实验的前50秒内，极少有果蝇能够到达气味目标。速度标准是通过评估在特定实验温度下至少100只对照组果蝇的平均运动速度来确定的，其中速度的上限和下限分别设定为平均速度加减一个标准差。例...

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讨论

在本实验方案中，我们描述了一种用于食物搜寻行为检测的逐步操作流程。除了与食物相关的气味外，该方法还可适用于研究果蝇定位其他气味源的能力。例如，可用于研究雄性果蝇寻找配偶的行为3 。关于本实验方案，我们在此提出以下若干补充注意事项：

首先，饲养温度决定了实验果蝇在测试前应培养的时间长度。建议检测多个年龄阶段，以确定实验最合适的果蝇年龄。例如，根据我们的经验，当果蝇在21 °C下饲养时，在饲养4-5天后，饲喂组与饥饿组果蝇的反应差异最为显著。

其次，LED灯照射一块玻璃漫射板，从而在亚克力培养室下方产生均匀且恒定的照明。充分均匀、稳定且明亮的照明对于果蝇运动的自动追踪至关重要。不均匀的光照或闪烁的光源可能导致果蝇自动追踪出现错误，表现为间歇性无法检测果蝇位置，或导致软件将光伪影误认为果蝇本身。我们发现，无论是商用LED背光灯还是自行搭建的LED阵列，均能同样良好地满足本实验的照明需求。

第三，如果软件错误地将光照或琼脂糖的微小变化识别为额外的物体，则需调...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本研究获得了美国国立卫生研究院（R01DK092640）和美国国家科学基金会（0920668）向 J.W.W. 提供的研究资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
苹果醋Spectrum市售可得
琼脂糖，VII型Sigma-AldrichA0701低凝胶温度琼脂糖
丙烯酸测试板定制板上包含6个区域。每个区域直径为60 mm，高度为6 mm。具体尺寸请参见测试板示意图。
LabVIEW V.8.5National Instruments776670-09程序平台：PositioningTool.vi，FlyTracking--Six Zones.vi 注意："elapsed time.vi"、"time into file.vi" 和 "two object detect.vi" 是必需的子程序，必须可用，以便主数据采集程序 "FlyTracking--Six zones.vi" 能够运行。
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6Wavemetric, Inc.宏平台：Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones
Basler scA1390-17fmNational Instruments779980-01数字相机 注意：相机驱动程序可在 Baslerweb.com 获取
8 mm镜头National Instruments780024-01Basler数字相机镜头
磨砂玻璃漫射板Edmund Optics定制用于散射光线，尺寸为25 cm × 30 cm
US Std. No. 100Fischer Scientific04-881X筛网，标称孔径为150 μm
照明选项1
660 nm LED背光（20 cm × 20 cm）Spectra WestBL47192一种更简单但成本更高的照明方案。
LED背光电源Spectra West
照明选项2
660 nm LEDSuperbrightledsRL5R1330波长660 nm（约7×7的LED阵列，用于14.7英寸×9.75英寸的面板）
线性直流电源GW InstekGPS-1830DLED面板电源
无焊面包板Digikey922354-ND用于LED的面包板

参考文献

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