无血清全胚胎培养系统中的小鼠胚胎发育

摘要

用于胚胎培养的血清含有未知成分，可能影响实验结果，尤其是在涉及信号相互作用的研究中。本文采用无血清加氧培养系统，证明了中期妊娠小鼠胚胎在培养16–40小时后 表现出与正在发育的胚胎相当的形态发育 在子宫内.

摘要

采用商品化的干细胞培养基添加剂配制的无血清培养基，在充氧的旋转瓶培养系统中对中期妊娠阶段的小鼠胚胎进行培养。在E10.5时期的鼠胚通过手术从子宫中仔细分离，保留完整的卵黄囊；随后通过精确的外科操作，在维持胚胎与卵黄囊之间血管连续性的前提下，将胚胎轻柔地从卵黄囊中暴露出来。与保留完整卵黄囊或去除卵黄囊制备的胚胎相比，此类胚胎在相同培养条件下表现出更优的存活率和发育进展。我们证明，这些小鼠胚胎在37 °C条件下，于含95% O₂ / 5% CO₂的气体环境中，在旋转瓶培养装置中使用明确成分的培养基培养16–40小时后，其形态学生长和发育水平可媲美在体（in utero）发育的胚胎。我们认为，该方法将有助于需要利用全胚胎培养技术研究胚胎器官发生过程中重要信号相互作用的研究人员。

引言

体外 利用完整胚胎的培养方法非常适合研究胚胎器官发生过程中涉及的信号机制，而这些机制通常难以触及 在子宫内 完整胚胎提供了组织完整性和支持，适合器官发生过程中不同细胞活动所必需的信号机制适时发生的组织相互作用。虽然整体胚胎培养为多种应用提供了平台，例如移植研究、遗传和组织操作、微珠植入研究、毒理学研究， 等等目前使用的胚胎培养系统主要依赖血清来维持胚胎在培养过程中的正常生长和发育^1-9.

血清已被用作培养基的主要成分之一，其添加比例范围为10%-100%^6-8,10,11。 然而，血清的成分并未明确定义，可能因动物个体不同以及每次采集时间的不同而存在差异。实验室制备血清耗时较长，且需遵循严格的制备流程；而 commercially 获取的血清则在不同批次之间表现出显著的变异性，并会增加实验成本。此外，血清中可能含有未知因子，如生长因子、激素或其他蛋白质，这些成分可能影响某些实验的结果，尤其是涉及组织相互作用中关键信号分子研究的实验。研究表明，在培养体系中添加血清可能改变细胞内某些信号分子的水平，例如环磷酸腺苷（cAMP），以及参与有丝分裂原信号通路和磷脂酰肌醇3（PI 3）-激酶信号通路的相关蛋白^12-14。与此相反，无血清培养体系具有诸多优势，包括提供无抗原环....

方案

小鼠胚胎培养：

所有实验操作均严格遵循美国国立卫生研究院指南，根据第 A2010 07-119 号协议进行，该协议已通过佐治亚大学机构动物护理和使用委员会的审查和批准，该委员会持续承担监管职责。

1. 培养基的制备

1. 使用市售干细胞培养基及添加剂配制培养液，成分如下：KnockOut DMEM、KnockOut 血清替代物（KSR）（10%）、N-2 补充剂（1×）、牛血清白蛋白（2%）、青霉素（50 IU/ml）、链霉素（50 μg/ml）和两性霉素B（1.25 μg/ml）。所配制的培养液与先前报道的培养液相似¹⁵ 添加抗真菌剂，并使用两倍浓度的抗生素（有关特定试剂和设备的详细信息， 见 材料清单
   注意： 先前所用的抗生素浓度（Moore-Scott， 等.¹⁵足以支持胚胎培养至24小时 时间周期。然而，当培养时间超过24小时后，我们观察到培养物出现污染，通过将抗生素浓度加倍成功控制了污染。
2. 根据制造商建议，将培养基组分储存在 4 °C 或 -20 °C。KSR 和 N-2 补充剂应分装后于 -20 °C 保存，以避免反复冻融。KnockOut DMEM 开封后应按照制造商建议在 30 天内使用完毕。使用前将各组分在 37 °C 水浴中预热。<....

结果

小鼠胚胎在体外（ex utero）的发育依赖于多个因素，从子宫从体内分离开始，直至胚胎进入培养阶段。如图1所示，该操作流程包括一系列步骤：将妊娠子宫从体内分离（图1A），分离带有完整卵黄囊的胚胎（图1B），将胚胎从卵黄囊中暴露出来（图1C），并在37 °C条件下，于含95% O₂ / 5% CO₂气氛的滚动瓶培养装置中，使用无血清培养基对胚胎进行培养。当胚胎在从子宫分离后立即转入培养基时，存活率达到100%。在此培养条件下，小鼠胚胎培养16–40小时后，其生长和形态发育与在子宫内（in utero）发育的相应阶段胚胎相当（图2）。

E10.5（约34-35体节期）的胚胎（图 2A）在培养16-40小时后存活并发育进展良好，远超过35体节阶段。培养16-18小时后的胚胎（图2D

讨论

中孕期小鼠胚胎在无血清培养基中培养，培养环境气体组成为95% O₂₂ / 5% CO₂₂ 在37 °C的滚瓶培养装置中。胚胎发育 子宫外 从安乐死小鼠中分离子宫到完成培养的整个过程中，每一步都高度依赖于多个因素（图1。影响发育的最重要因素是开始培养所需的时间。操作过程中需要格外注意的其他关键步骤包括：从子宫中分离带有完整卵黄囊的胚胎，以及将胚胎从卵黄囊中取出。由于啮齿类动物具有盘状胎盘，即使在角部轻微损伤胎盘蜕膜，对子宫进行分段解剖也不会破坏胚胎的血液供应。实际上，这会在两端留下一个小开口，可通过该开口插入一对钝头镊子，轻轻撕开子宫和胎盘蜕膜，从而便于分离出带有完整卵黄囊的胚胎。然而，接下来将胚胎从卵黄囊中取出的步骤尤为关键，因为若损伤卵黄囊中的主要血管，可能会对胚胎在培养过程中的发育造成影响。当从卵黄囊中取出胚胎时，若能保持卵黄囊内血管系统的完整性，则可支持胚胎的正常发育。以往的研究表明，在培养发育阶段超过E10的鼠胚时，卵黄囊的打开已被证实可行。^1,15,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KnockOut DMEM	Invitrogen	10829-018
KnockOut 血清替代物	Invitrogen	10828-028
N-2 添加剂	Invitrogen	17502-048	储存液：100 倍
牛血清白蛋白	Sigma	A9418-50G	储存液：100%
抗生素-抗真菌溶液	Cellgro	30-004-Cl	储存液：青霉素（10,000 IU/ml）；链霉素（10,000 µg/ml）；两性霉素（250 µg/ml）
DMEM	Cellgro	15-013-CV
精密培养箱	B.T.C. Engineering Milton Cambridge England	编号：840-374
旋转装置用玻璃瓶	B.T.C. Engineering
硅橡胶塞	B.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 气瓶	AirGas Inc.
Stemi SV11 Apo 解剖显微镜	Zeiss
Stemi SV6 显微镜	Zeiss
CO2 水套式培养箱	Forma Scientific	型号：3110
细胞培养操作台	Nuaire 二级 A2 型生物安全柜	型号：Nu-425-600
水浴锅	Fisher Scientific	IsoTemp205
电子天平	Mettler Toledo	AG285
离心管，50 ml	Corning	430291
轻便手术剪	Roboz	RS-6702
锐-钝手术剪	Roboz	RS-6812
显微解剖镊，4 英寸	Roboz	RS-5211
显微解剖镊 - Hudson (cWALD)，4-3/4 英寸	Roboz	RS-5237
显微解剖镊（5/45）	Roboz	RS-5005	经改造 - 尖端由锐利改为钝头
显微解剖镊（5）	Roboz	RS-5060	经改造 - 尖端由锐利改为钝头
显微解剖镊（55）	Roboz	RS-5063	经改造 - 尖端由锐利改为钝头
器械托盘	Roboz	RT-1401S
器械托盘盖	Roboz	RT-1401L
培养皿 - 100 mm	Fisher Scientific	087571Z
培养皿 - 60 mm	Fisher Scientific	0875713A
培养皿 - 35 mm	Fisher Scientific	0875711YZ
滤器系统（0.22 µm 醋酸纤维素）- 150 ml	Corning	431153
滤器系统（0.22 µm 醋酸纤维素）- 250 ml	Corning	430756
滤器系统（0.22 µm 醋酸纤维素）- 500 ml	Corning	430758
Pipet-aid 移液器	Drummond Scientific Co.	D57849
血清移液管 - 10 ml	VWR	89130-898
一次性血清移液管 - 25 ml	Corning	4251
转移移液管 - 7.7 ml	Thermo Scientific	202-20S