用于胚胎培养的血清含有未知成分，可能影响实验结果，尤其是在涉及信号相互作用的研究中。本文采用无血清加氧培养系统，证明了中期妊娠小鼠胚胎在培养16–40小时后 表现出与正在发育的胚胎相当的形态发育 在子宫内.
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摘要
摘要
采用商品化的干细胞培养基添加剂配制的无血清培养基，在充氧的旋转瓶培养系统中对中期妊娠阶段的小鼠胚胎进行培养。在E10.5时期的鼠胚通过手术从子宫中仔细分离，保留完整的卵黄囊；随后通过精确的外科操作，在维持胚胎与卵黄囊之间血管连续性的前提下，将胚胎轻柔地从卵黄囊中暴露出来。与保留完整卵黄囊或去除卵黄囊制备的胚胎相比，此类胚胎在相同培养条件下表现出更优的存活率和发育进展。我们证明，这些小鼠胚胎在37 °C条件下，于含95% O2 / 5% CO2的气体环境中，在旋转瓶培养装置中使用明确成分的培养基培养16–40小时后，其形态学生长和发育水平可媲美在体（in utero）发育的胚胎。我们认为，该方法将有助于需要利用全胚胎培养技术研究胚胎器官发生过程中重要信号相互作用的研究人员。
引言
体外 利用完整胚胎的培养方法非常适合研究胚胎器官发生过程中涉及的信号机制，而这些机制通常难以触及 在子宫内 完整胚胎提供了组织完整性和支持，适合器官发生过程中不同细胞活动所必需的信号机制适时发生的组织相互作用。虽然整体胚胎培养为多种应用提供了平台，例如移植研究、遗传和组织操作、微珠植入研究、毒理学研究， 等等目前使用的胚胎培养系统主要依赖血清来维持胚胎在培养过程中的正常生长和发育1-9.
血清已被用作培养基的主要成分之一，其添加比例范围为10%-100%6-8,10,11。 然而，血清的成分并未明确定义，可能因动物个体不同以及每次采集时间的不同而存在差异。实验室制备血清耗时较长，且需遵循严格的制备流程；而 commercially 获取的血清则在不同批次之间表现出显著的变异性，并会增加实验成本。此外，血清中可能含有未知因子，如生长因子、激素或其他蛋白质，这些成分可能影响某些实验的结果，尤其是涉及组织相互作用中关键信号分子研究的实验。研究表明，在培养体系中添加血清可能改变细胞内某些信号分子的水平，例如环磷酸腺苷（cAMP），以及参与有丝分裂原信号通路和磷脂酰肌醇3（PI 3）-激酶信号通路的相关蛋白12-14。与此相反，无血清培养体系具有诸多优势，包括提供无抗原环境、避免可能干扰细胞过程的生物活性酶，并确保实验间的一致性。
在本研究中，我们采用由市售干细胞培养基添加剂配制的无血清培养基，在95% O₂2 / 5% CO₂2 在37 °C的滚瓶培养装置中15,16. 小鼠胚胎培养16至40小时 在这些明确定义的条件下，胚胎整体躯体形态及心脏、四肢、脑和眼等不同结构的发育均表现出进展，表明细胞增殖、迁移、分化及组织间相互作用处于适当水平。对体外培养中胚胎发育的分子分析显示，以眼等复杂器官系统为例，其眼部发育过程与在体内发育胚胎的眼组织中所观察到的发育过程一致。 在子宫内 （Kalaskar 和 Lauderdale，正在准备中）。因此，我们证明在中期妊娠阶段培养的小鼠胚胎表现出渐进性生长和形态发育，与在体内发育的胚胎所观察到的发育过程相当。 在子宫内.
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方案
小鼠胚胎培养：
所有实验操作均严格遵循美国国立卫生研究院指南，根据第 A2010 07-119 号协议进行，该协议已通过佐治亚大学机构动物护理和使用委员会的审查和批准，该委员会持续承担监管职责。
1. 培养基的制备
- 使用市售干细胞培养基及添加剂配制培养液，成分如下：KnockOut DMEM、KnockOut 血清替代物（KSR）（10%）、N-2 补充剂（1×）、牛血清白蛋白（2%）、青霉素（50 IU/ml）、链霉素（50 μg/ml）和两性霉素B（1.25 μg/ml）。所配制的培养液与先前报道的培养液相似15 添加抗真菌剂，并使用两倍浓度的抗生素（有关特定试剂和设备的详细信息， 见 材料清单
注意： 先前所用的抗生素浓度（Moore-Scott， 等.15足以支持胚胎培养至24小时 时间周期。然而，当培养时间超过24小时后，我们观察到培养物出现污染，通过将抗生素浓度加倍成功控制了污染。 - 根据制造商建议，将培养基组分储存在 4 °C 或 -20 °C。KSR 和 N-2 补充剂应分装后于 -20 °C 保存，以避免反复冻融。KnockOut DMEM 开封后应按照制造商建议在 30 天内使用完毕。使用前将各组分在 37 °C 水浴中预热。
- 在无菌条件下配制培养基。将装有培养基成分的瓶及所有设备表面用70%酒精喷雾消毒后，再放入培养罩内。
- 培养基成分可在无菌烧杯中或直接在滤器系统（Corning）中混合。首先将白蛋白粉末加入KnockOut DMEM中，轻轻振荡充分混匀，直至白蛋白完全溶解。随后加入N-2 Supplement、KSR和抗生素，使用移液器彻底混匀。接着使用0.22 µm孔径滤膜在真空负压条件下过滤除菌。将培养基分装至50 ml锥形管中，4 °C保存备用。培养基配制后应在4–5天内用于培养。
2. 培养设备的准备
- 对玻璃培养瓶和橡胶瓶塞进行灭菌。用铝箔包裹培养瓶，并将橡胶瓶塞放入盛水的烧杯中，通过高压灭菌法进行灭菌。
- 使用70%乙醇喷雾对培养室（精密培养箱单元）进行灭菌，并在开始培养前预热至37 °C。培养室内中央装有一个可旋转的圆盘，用于固定培养瓶。气体进入培养室的流量由压力计调控，通过观察末端玻璃管水中逸出的气泡可调节流速。该滚瓶培养装置是New和Cockroft17最初介绍的装置的改进版本。
- 将装有95% O2 / 5% CO2混合气体的气瓶连接至培养室，并调节气体流速至“每秒一粒气泡”，即50 cc/min，以确保培养胚胎获得充足的氧气供应。
3. 小鼠胚胎的收集与培养前准备
- 为获得野生型小鼠胚胎，我们使用了C57BL/6J和CD-1（Charles River Laboratories）遗传背景品系的小鼠。
- 每天早晨检查雌性小鼠是否有阴道栓。发现阴道栓当天的中午定为E0.5 dpc（交配后天数）。
- 在E10.5 dpc时，按照标准操作流程处死怀孕小鼠以收集小鼠胚胎。使用CO₂处死小鼠。2 根据美国兽医协会（AVMA）《动物安乐死指南》（2013年版）规定的吸入式装置进行操作。为确保动物死亡，在暴露于CO后实施颈椎脱位术2.
- 用70%乙醇喷洒腹部腹侧表面，以防止腹部毛发粘附到器械上。然后使用尖端-钝头手术剪从腹侧打开腹腔。 和一对 4-3/4 英寸 显微解剖镊 以定位子宫。使用一把4英寸的 显微解剖镊 用眼科剪轻轻剪开，将整个子宫提起并从体内分离 子宫体及子宫角尖端
- 用预热至 37 °C 的 1× PBS 快速冲洗整个子宫，以去除附着的血液，随后立即转移至含有预热至 37 °C 的 DMEM 的培养皿中。使用前用 70% 乙醇喷雾对器械进行消毒。
注意： 建议在实验全程中将 PBS、DMEM 及培养基等溶液预先加热并维持在 37 °C。 - 在解剖显微镜下，应使用轻便手术剪对子宫进行分段解剖。这会在分段后的子宫两侧形成小开口，通过这些开口可插入一对经改良（末端钝化）的显微解剖镊 可用精细解剖镊轻轻插入以扩大开口，从而暴露胎盘蜕膜。随后可用精细解剖镊轻轻撕除蜕膜，暴露带有Reichert膜的壁层卵黄囊（PYS）。用镊子的一侧边缘轻轻刺破Reichert膜及PYS，并与下方的脏层卵黄囊（VYS）层分离，以暴露仍附着完整VYS的胚胎。外周胎盘锥体及滋养层衍生物可随胎盘蜕膜或Reichert膜一并去除。操作时需格外小心，避免VYS破裂，否则胚胎会立即弹出。
- 应使用塑料转移移液管将带有完整卵黄囊的胚胎转移至含有已预热至37 °C培养基的培养皿中。
注意： 从子宫分离后立即转移至培养基有助于胚胎在体外培养中更好地发育。 - 用显微镊子在卵黄囊上制造一个小开口，注意避开主要血管。可使用尖头镊子在靠近胚胎头部区域的卵黄囊上轻轻穿刺形成开口；或者使用两把钝头镊子夹住卵黄囊并轻轻撕开，形成一个小开口。随后用镊子轻轻扩张开口，使其大小刚好足以让胚胎头部通过。紧贴胚胎的羊膜应使用镊子轻轻夹起并撕开，避免接触胚胎本体。在保持胚胎血管系统与卵黄囊连接完整的前提下，轻柔地将胚胎头部继而整个胚胎从卵黄囊中取出15.
注意： 任何对卵黄囊血管系统的损伤都可能影响胚胎在培养过程中的发育。具有血管系统损伤的胚胎不应用于培养，但可用于胚胎分期，之后可予以丢弃。 - 胚胎分期标准：在解剖显微镜下观察胚胎，根据体节数量以及身体和头部大小、肢体和眼睛形态等形态学特征进行分期分组。 每组至少两个胚胎。
注意： 同一窝获得的胚胎通常在发育上表现出差异 在子宫内 并且在体型大小、形态特征和体节数量上存在差异。然而，我们发现，根据我们的形态学标准分组的胚胎通常具有相似的体节数（±1）。因此，无需对每个胚胎逐一计数体节，以免延迟开始培养的时间。
注意： 不要使用已用于计数体节的胚胎进行培养。为避免培养开始的时间延迟，应在对其他胚胎开始培养后，再进行体节计数。从子宫分离后延迟培养的胚胎通常发育较差。 - 将胚胎立即转移至含有预热至37 °C新鲜培养基的培养皿中，并将其移至超净工作台，随后再次将胚胎转移至含有无菌培养基的培养皿中，然后放入含有培养基的培养瓶中开始培养。
注意： 胚胎在培养前需进行多次培养基转移，以防止污染，因为胚胎收集和解剖的不同步骤是在未安装于培养罩内的体视显微镜下进行的。
注意： 当产仔数较大时（>12 个胚胎），处理其中一半胚胎，开始培养或将它们放入含有培养基的培养皿中，并置于 CO2 37 °C 培养箱中孵育。 当胚胎在外界放置较长时间时（>35-40 分钟后，我们观察到心跳减缓，这将影响后续培养过程中的发育。
4. 小鼠胚胎的培养
- 在超净工作台中打开已灭菌的培养瓶，并做好正确标记。向每个培养瓶中加入3 ml预热至37 °C的培养基，然后使用无菌塑料移液管将小鼠胚胎轻柔地转移至培养瓶中。随后，用橡胶瓶塞密封培养瓶，以便将培养瓶固定在培养装置的滚动圆盘上。
注意： 可在处死小鼠前预先准备含有培养基的培养瓶，并将其放置于培养装置的滚筒上，以缩短胚胎转移至培养瓶所需的时间。
注意： 小鼠胚胎可单独培养，也可将两个或三个胚胎共同培养于同一培养瓶中。 - 培养瓶应无菌转移至37 °C的培养装置中，并用橡胶塞将其牢固地挂在滚轴盘的孔上。开启滚轴盘，使其以每分钟35转（rpm）的恒定速度旋转，以确保胚胎在培养液中自由悬浮，同时促进胚胎组织的气体自由交换。连接至培养室的气瓶中的气体经滚轴盘和橡胶塞流入培养瓶内。
- 将胚胎培养 16–40 小时 并定期检查气体流出情况和培养室温度。
注意： 胚胎在培养条件下的操作：让胚胎在培养环境中适应至少30分钟。随后可弃去发育状态较差且心跳微弱的胚胎，保留其余胚胎用于后续操作实验。胚胎操作方法包括电穿孔等。5,9,16，显微注射18，微球植入16此时可进行药物处理及其他操作。我们已成功实施了植入经特定信号分子处理的Affi-Gel琼脂糖 beads 的实验，以研究其在早期眼发育中的作用。操作后的胚胎可转移至新鲜培养基中继续培养。 - 在培养 9–10 小时后，按特定时间间隔完全更换为新鲜培养基 18-19 小时 培养40小时后的培养物状态.
注意： 如果培养在16-18小时结束，则可能无需更换培养基。 - 培养成功的评估指标：胚胎在培养中的存活应通过可见的心跳和体内血液循环来确定，而胚胎在培养中的生长应通过体长增加、体节数目以及头部、四肢、心脏和眼睛的形态发育来评估。
- 在子宫内 发育至E11.0天（约40–41体节）和E12.0天（约49–50体节）的胚胎应作为对照，用于比较培养16–18小时的胚胎 分别为38-40小时。
- 不同培养时期胚胎发育情况 在子宫内 可在解剖显微镜下观察并捕获各个阶段的图像。使用 Spot 成像软件采集图像，随后利用图像处理软件进行后期处理。
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结果
小鼠胚胎在体外（ex utero）的发育依赖于多个因素，从子宫从体内分离开始，直至胚胎进入培养阶段。如图1所示，该操作流程包括一系列步骤：将妊娠子宫从体内分离（图1A），分离带有完整卵黄囊的胚胎（图1B），将胚胎从卵黄囊中暴露出来（图1C），并在37 °C条件下，于含95% O2 / 5% CO2气氛的滚动瓶培养装置中，使用无血清培养基对胚胎进行培养。当胚胎在从子宫分离后立即转入培养基时，存活率达到100%。在此培养条件下，小鼠胚胎培养16–40小时后，其生长和形态发育与在子宫内（in utero）发育的相应阶段胚胎相当（图2）。
E10.5（约34-35体节期）的胚胎（图 2A）在培养16-40小时后存活并发育进展良好，远超过35体节阶段。培养16-18小时后的胚胎（图2D
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讨论
中孕期小鼠胚胎在无血清培养基中培养，培养环境气体组成为95% O₂2 / 5% CO₂2 在37 °C的滚瓶培养装置中。胚胎发育 子宫外 从安乐死小鼠中分离子宫到完成培养的整个过程中，每一步都高度依赖于多个因素（图1。影响发育的最重要因素是开始培养所需的时间。操作过程中需要格外注意的其他关键步骤包括：从子宫中分离带有完整卵黄囊的胚胎，以及将胚胎从卵黄囊中取出。由于啮齿类动物具有盘状胎盘，即使在角部轻微损伤胎盘蜕膜，对子宫进行分段解剖也不会破坏胚胎的血液供应。实际上，这会在两端留下一个小开口，可通过该开口插入一对钝头镊子，轻轻撕开子宫和胎盘蜕膜，从而便于分离出带有完整卵黄囊的胚胎。然而，接下来将胚胎从卵黄囊中取出的步骤尤为关键，因为若损伤卵黄囊中的主要血管，可能会对胚胎在培养过程中的发育造成影响。当从卵黄囊中取出胚胎时，若能保持卵黄囊内血管系统的完整性，则可支持胚胎的正常发育。以往的研究表明，在培养发育阶段超过E10的鼠胚时，卵黄囊的打开已被证实可行。1,15,
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披露
我们没有任何相互竞争的财务利益。
致谢
我们感谢Julie Gordon博士和Nancy Manley博士在培养技术方面提供的有益建议。本工作得到了儿童青光眼基金会和Sharon-Stewart无虹膜研究信托基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut 血清替代物 | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 添加剂 | Invitrogen | 17502-048 | 储存液：100 倍 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A9418-50G | 储存液：100% |
| 抗生素-抗真菌溶液 | Cellgro | 30-004-Cl | 储存液：青霉素（10,000 IU/ml）；链霉素（10,000 µg/ml）；两性霉素（250 µg/ml） |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 精密培养箱 | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | 编号：840-374 | |
| 旋转装置用玻璃瓶 | B.T.C. Engineering | ||
| 硅橡胶塞 | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 气瓶 | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo 解剖显微镜 | Zeiss | ||
| Stemi SV6 显微镜 | Zeiss | ||
| CO2 水套式培养箱 | Forma Scientific | 型号：3110 | |
| 细胞培养操作台 | Nuaire 二级 A2 型生物安全柜 | 型号：Nu-425-600 | |
| 水浴锅 | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| 电子天平 | Mettler Toledo | AG285 | |
| 离心管，50 ml | Corning | 430291 | |
| 轻便手术剪 | Roboz | RS-6702 | |
| 锐-钝手术剪 | Roboz | RS-6812 | |
| 显微解剖镊，4 英寸 | Roboz | RS-5211 | |
| 显微解剖镊 - Hudson (cWALD)，4-3/4 英寸 | Roboz | RS-5237 | |
| 显微解剖镊（5/45） | Roboz | RS-5005 | 经改造 - 尖端由锐利改为钝头 |
| 显微解剖镊（5） | Roboz | RS-5060 | 经改造 - 尖端由锐利改为钝头 |
| 显微解剖镊（55） | Roboz | RS-5063 | 经改造 - 尖端由锐利改为钝头 |
| 器械托盘 | Roboz | RT-1401S | |
| 器械托盘盖 | Roboz | RT-1401L | |
| 培养皿 - 100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| 培养皿 - 60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 培养皿 - 35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| 滤器系统（0.22 µm 醋酸纤维素）- 150 ml | Corning | 431153 | |
| 滤器系统（0.22 µm 醋酸纤维素）- 250 ml | Corning | 430756 | |
| 滤器系统（0.22 µm 醋酸纤维素）- 500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid 移液器 | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| 血清移液管 - 10 ml | VWR | 89130-898 | |
| 一次性血清移液管 - 25 ml | Corning | 4251 | |
| 转移移液管 - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
参考文献
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