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方法文章

光学检测 大肠杆菌 多孔硅生物传感器检测细菌

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DOI：

10.3791/50805

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2013年11月20日

 ,  , 
1Department of Biotechnology and Food Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Inter-Departmental Program of Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Russell Berrie Nanotechnology Institute, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

介绍了一种用于快速检测细菌的无标记光学生物传感器。该生物传感器基于纳米结构的多孔硅，设计用于将目标细菌细胞直接捕获到其表面。我们将单克隆抗体固定在多孔换能器上，作为捕获探针。研究结果表明，该生物传感器可在数分钟内检测出低浓度细菌，且无需对样品进行预处理（如细胞裂解）。

摘要

一种基于纳米结构多孔硅的无标记光学生物传感器被设计用于快速捕获和检测大肠杆菌（Escherichia coli）K12 菌株，作为模式微生物。该生物传感器依赖目标细菌细胞直接结合到其表面，且无需对检测样本进行预处理（例如 细胞裂解）。采用介孔硅薄膜作为该生物传感器的光学换能元件。在白光照射下，多孔层在其反射光谱中呈现出清晰可辨的法布里-珀罗干涉条纹。对反射光谱数据进行快速傅里叶变换（FFT）后可得到单一峰。通过监测FFT峰强度的变化，可实现对目标细菌通过抗体-抗原相互作用在生物传感器表面捕获过程的检测，从而实现对细菌附着过程的“实时”观察。

通过电化学阳极氧化工艺制备的介孔硅薄膜与针对目标细菌的单克隆抗体相偶联。通过荧光标记实验验证了抗体的固定化、免疫活性及特异性。当该生物传感器暴露于目标细菌时，细菌细胞可直接被捕获到经抗体修饰的多孔硅表面。这些特异性捕获事件导致生物传感器薄膜光学干涉光谱的强度发生变化。我们证明，该生物传感器可在不到一小时内检测相对较低浓度的细菌（检测限为104 个细胞/ml）。

引言

对致病菌的早期和准确鉴定在食品安全、水质安全、环境监测以及即时诊断方面具有重要意义1。由于传统微生物学技术耗时长、操作繁琐，且无法在实验室环境之外实现对微生物的"实时"检测，生物传感器正不断发展以应对这些挑战2-5。

近年来，多孔硅（PSi）已成为构建传感器和生物传感器的有前景的平台6-20。在过去十年中，已发表了大量关于基于多孔硅的光学传感器和生物传感器的研究21,22。纳米结构的多孔硅层通常通过单晶硅片的电化学阳极腐蚀法制备而成。所得的多孔硅纳米材料具有多种优势特性，例如较大的比表面积和自由体积、可调控的孔径尺寸以及可调的光学性质10,16。多孔硅层的光学性质，如光致发光8,11和基于白光反射的干涉测量技术7,19，受环境条件影响显著。当目标分子或分析物被捕获到多孔层内部时，会导致薄膜平均折射率发生变化，表现为光致发光光谱的调制或反射光谱中波长的偏移10。

尽管PSi光学生物传感器技术取得了巨大创新，但基于PSi的细菌检测平台的相关报道仍较少6,8,20,23-29此外，大多数这些概念验证研究已经证明 "间接" 细菌检测。因此，通常需要在检测前对细胞进行裂解，以提取目标蛋白或DNA片段，这些片段是所研究细菌的特征性标志29我们的方法是直接将目标细菌细胞捕获到多孔硅（PSi）生物传感器上。因此，将针对目标细菌的特异性单克隆抗体固定在多孔表面。细菌细胞通过抗体-抗原相互作用结合到生物传感器表面，从而引起反射光谱振幅（强度）的变化。24-26.

本研究中，我们报道了一种基于多孔硅（PSi）的光学生物传感器的构建，并展示了其作为无标记生物传感平台在检测大肠杆菌（Escherichia coli（E. coli）K12细菌（作为模式微生物）中的应用。所监测的光学信号来源于PSi纳米结构因法布里-珀罗薄膜干涉而反射的光（图1A）。光信号振幅/强度的变化与目标细菌细胞在生物传感器表面的特异性固定相关联，从而实现对细菌的快速检测与定量分析。

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方案

1. 氧化多孔SiO2的制备

  1. 将单面抛光、重掺杂p型（0.0008 Ω·cm）的硅片（<100>晶面）在体积比为3:1的氢氟酸水溶液与无水乙醇混合液中，于恒定电流密度385 mA/cm2条件下腐蚀30秒。请注意，氢氟酸为强腐蚀性液体，操作时须格外小心。
  2. 用无水乙醇多次冲洗所得多孔硅（PSi）薄膜表面，并在干燥氮气氛围下吹干薄膜。
  3. 将 freshly-etched PSi 样品置于管式炉中，在空气氛围下800 °C氧化1小时（将样品于室温放入炉内，升温至800 °C，保持1小时，关闭炉子并待其冷却至室温后方可取出样品）。

2. PSiO2 支架的生物功能化

  1. 将氧化的多孔硅（PSiO2）样品在95%巯丙基（三甲氧基硅烷-3）（MPTS）溶液（108 mM，甲苯中）中孵育1小时。
  2. 用甲苯、甲醇和丙酮冲洗经硅烷处理的PSiO2样品，并在干燥氮气下吹干。
  3. 将经硅烷修饰的PSiO2样品在1 ml 100 mM PEO-碘乙酰基生物素溶液中孵育30分钟。
  4. 用0.1 M磷酸 缓冲盐水（PBS）溶液多次冲洗经生物素处理的PSiO2样品。
  5. 将经生物素修饰的PSiO2样品在1 ml 100 μg/ml链霉亲和素（SA）溶液中孵育30分钟。
  6. 用0.1 M PBS溶液多次冲洗经SA处理的PSiO2样品。
  7. 将所得的SA修饰PSiO2样品在1 ml 100 μg/ml生物素化E. coli单克隆抗体（免疫球蛋白G，IgG）溶液中，或在100 μg/ml生物素化兔IgG溶液中（作为单克隆抗体的模型）孵育30分钟。

3. 荧光标记与荧光显微镜观察

  1. 将IgG修饰的表面与15 μg/ml荧光素（FITC）标记的抗兔IgG孵育40分钟，同时以15 μg/ml荧光素（FITC）标记的抗小鼠IgG作为对照。
  2. 用0.1 M PBS溶液多次冲洗修饰后的样品。
  3. 在荧光显微镜下观察样品。

4. 细菌培养

  1. 在10 ml离心管中加入5 ml LB培养基（每升去离子水中含5 g NaCl、5 g酵母提取物和10 g胰蛋白胨），培养大肠杆菌K12（E. coli K12）。于37 °C条件下振荡培养过夜。
  2. 通过在600 nm波长下测定光密度（OD）来监测细菌浓度。在LB培养基中过夜培养后，使用分光光度计测定OD600以确定细菌浓度。细胞数量与OD600值成正比（1 OD600 = 108 个细胞/ml）。

5. 细菌检测

  1. 将IgG修饰的PSiO2和未处理的PSiO2（作为对照）样品置于定制的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）流动池中。固定流动池，以确保在所有测量过程中均在同一位置测定样品的反射率。
  2. 在室温下用大肠杆菌（E. coli）K12悬液（104 个细胞/ml）孵育样品30分钟，随后用0.85% w/v的生理盐水冲洗流动池30分钟，以去除细菌悬液。
  3. 在整个实验过程中监测反射率数据的变化。所有光学测量均需在水相环境中进行。光谱应使用CCD光谱仪采集，并通过快速傅里叶变换（FFT）进行分析，具体方法如前所述25,26。
  4. 在生物传感实验结束后，立即在直立式光学显微镜下观察样品，以确认细菌存在于生物传感器表面。

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结果

氧化的多孔硅（PSiO2）薄膜的制备方法如“实验方案”部分所述。图1B展示了热氧化后所得多孔硅薄膜的高分辨率扫描电子显微图像。PSiO2层具有定义明确的圆柱形孔隙，孔径范围为30–80 nm。

采用成熟的硅烷化技术结合生物素-链霉亲和素（biotin-SA）系统，将单克隆抗体（IgG）分子接枝到PSiO2表面。详细的合成路线如图2所示。首先，对热氧化后的表面用MPTS进行硅烷化处理，形成含巯基的硅烷化表面（图2c）。接下来，将活化的表面与SH反应性生物素连接分子孵育（图2d），随后通过生物素-SA桥接将链霉亲和素（SA）蛋白连接到生物素修饰的表面30（图2e）。生物传感器表面功能化的最后一步是将生物素化的单克隆抗体与SA进行生物偶联（图2f）。

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讨论

基于PSiO2纳米结构（一种法布里-珀罗薄膜）构建了一种无标记光学免疫传感器，并验证了其作为细菌检测生物传感器的潜在应用价值。

修改与故障排除

在设计免疫传感器时，一个主要问题是抗体在沉积和图案化到固体基底过程中容易发生非预期的构象变化，这可能导致生物传感器灵敏度下降31,32。为尽量减少这一问题，通过生物素-链霉亲和素（SA）桥接将抗体与PSiO2表面偶联。由于生物素与链霉亲和素之间具有高结合亲和力（Kd ~10-13 M），它们被广泛应用于多种生物技术领域。生物素-链霉亲和素连接是生物传感器开发中受体固定最常用的化学方法之一10,32,33,34。通过生物素-链霉亲和素反应可调控固定化抗体的可及性，该反应在固体表面与IgG之间提供了一种灵活的连接方式31,35。因此，首先需用生物素/链霉亲和素对PSiO2进行生物功能化修饰，以实现生物素化抗体在纳米结构上的...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作由以色列科学基金会（资助号 1118/08 和资助号 1146/12）以及明娜·克罗尔纪念研究基金资助。E.S. 衷心感谢拉塞尔·贝瑞纳米技术研究所提供的经济支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硅晶片Siltronix Corp.高度硼掺杂，p型，电阻率为0.0008 Ω-cm，<100>晶向
水性氢氟酸（48%）Merck101513
无水乙醇Merck818760
PBS缓冲液（pH 7.4）通过将50 mM Na2HPO4、17 mM NaH2PO4和68 mM NaCl溶于Milli-Q水（18.2 MΩ）中配制而成
0.85% w/v生理盐水通过将0.85 g NaCl溶于100 ml Milli-Q水（18.2 MΩ）中配制而成
95% (3-巯丙基)三甲氧基硅烷（MPTS）Sigma Aldrich Chemicals175617
PEO-碘乙酰基生物素Sigma Aldrich ChemicalsB2059
链霉亲和素（SA）Jackson ImmunoResearch Labs Inc.016-000-114
荧光素（DTAF）标记的链霉亲和素Jackson ImmunoResearch Labs Inc.016-010-084
生物素化的兔IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.011-060-003
荧光标记的抗兔IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.111-095-003
荧光标记的抗小鼠IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.115-095-003
生物素化的E. coli抗体Jackson ImmunoResearch Labs Inc.1007
E. coli（K-12）由以色列理工学院Sima Yaron教授慷慨提供

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