本文描述了一种用于鉴定膜蛋白在体（in vivo）蛋白质相互作用（PPI）的生物化学方法。该方法结合了蛋白质交联、亲和纯化和质谱分析技术，可适用于几乎所有细胞类型或生物体。利用该技术，甚至可以实现对瞬时蛋白质相互作用的鉴定。
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摘要
摘要
膜蛋白对细胞存活至关重要，因此是重要的治疗靶点1-3。由于它们以复合物形式发挥功能4，因此需要能够识别和表征其相互作用的方法5。为此，我们开发了一种膜蛋白Strep标签相互作用实验，称为膜蛋白Strep标签亲和纯化相互作用实验（Membrane-SPINE）6。该技术结合了使用可逆交联剂甲醛进行的体内交联，以及对带有Strep标签的膜蛋白诱饵进行亲和纯化。在实验过程中，交联的捕获蛋白会随膜蛋白诱饵一同被纯化，随后通过煮沸实现分离。因此，利用Membrane-SPINE分析膜蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）时可完成两个主要任务：第一，通过免疫印迹验证所提出的相互作用伙伴；第二，通过质谱分析鉴定新的相互作用伙伴。此外，该技术甚至能够检测到低亲和力、瞬时的PPIs。最后，Membrane-SPINE几乎可适用于所有细胞类型，使其成为鉴定膜蛋白PPIs的一种强大筛选工具。
引言
要理解蛋白质的功能，必须了解其相互作用伙伴。目前已有多种经典技术可用于鉴定可溶性蛋白质的相互作用伙伴。然而，由于膜蛋白具有疏水性，这些技术难以直接应用于膜蛋白4。为克服这一局限，我们开发了膜蛋白Strep-蛋白质相互作用实验方法（Membrane Strep-protein interaction experiment, Membrane-SPINE）6。该方法基于SPINE技术，而后者仅适用于可溶性蛋白质7。
膜蛋白SPINE技术利用了交联剂甲醛的两个优势：首先，甲醛能够轻易穿透细胞膜，因此可对活细胞中相互作用组（interactome）提供精确的瞬时快照8。其次，甲醛交联可通过煮沸逆转9。在此，利用这两个优势可不仅识别膜蛋白的永久性相互作用，还可识别其瞬时的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）6。
简而言之，将Strep标签融合至整合膜诱饵蛋白的C末端。表达该膜诱饵蛋白的细胞用甲醛孵育，使猎物蛋白与膜诱饵蛋白发生交联（图1）。无需对猎物蛋白进行任何修饰。接着，制备膜组分。通过去污剂处理溶解膜蛋白，并利用亲和纯化将诱饵蛋白与其结合的猎物蛋白共同纯化。随后，通过加热煮沸逆转交联，再通过SDS-PAGE将诱饵蛋白及其共洗脱的猎物蛋白分离。最后，可通过免疫印迹分析或质谱法鉴定猎物蛋白。
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方案
注意：有关本方案中所列缓冲液的详细信息，请参见表1。
1. 通过甲醛交联在活细胞中固定蛋白质-蛋白质相互作用
- 首先准备培养基、储备液和缓冲液P1
- 制备500 ml培养基：该培养基应提供支持膜诱饵蛋白与猎物蛋白相互作用的条件。此外，应进行一项在预期无相互作用条件下开展的实验（例如 无需交联。
注意：我们比较在应激和非应激条件下细菌中的蛋白质-蛋白质相互作用。因此，我们制备500 ml的Luria Bertani（LB）培养基（表1）并补充一种诱导应激的试剂（例如 0.5 M NaCl）置于2 L锥形瓶中。作为对照，我们使用含0.17 M NaCl（pH 7.0）的普通LB培养基。 - 配制 Tris 缓冲液（20 mM Tris-HCl；pH 8.0）和 0.1 M 乙二胺四乙酸（EDTA）pH 8.0 储存液表1).
- 准备缓冲液 P1。将蔗糖溶解于 Tris 缓冲液中，使其终浓度为 0.5 M。通过过滤除菌缓冲液 P1，并于 4 °C 保存。
- 制备500 ml培养基：该培养基应提供支持膜诱饵蛋白与猎物蛋白相互作用的条件。此外，应进行一项在预期无相互作用条件下开展的实验（例如 无需交联。
- 培养表达带有C端Strep-tag融合的膜诱饵蛋白的细胞。充分诱导膜诱饵蛋白的表达。
注意：我们在细菌对数生长期早期（A600 = 0.3）时，向500 ml培养基中加入250 µl 1 M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使终浓度为0.5 mM。为确保充分表达，将细菌培养至对数生长后期（A600 = 1.2). - 为每种培养物准备两个离心烧杯，每个烧杯的最小体积为300 ml，并将其置于冰上。
- 进行甲醛交联。
警告：甲醛具有高毒性。 建议在通风橱内操作。- 将培养容器转移至安全通风橱中。将每个样品均分为两份，一份不进行交联（- X），另一份加入甲醛交联（+ X）。向250 ml培养液中加入4 ml 37%甲醛溶液，使终浓度为0.6%。
- 将培养容器转移回原条件，继续培养细胞20分钟，操作同前。
- 在安全通风橱内将培养物加入离心管中。在3,000 × g条件下离心30分钟以收集细胞。
- 在安全通风橱中用移液器小心吸除上清液。收集含有甲醛的有毒上清液，并按规定妥善处理。
- 为了在膜蛋白制备过程中获得最佳得率，需先制备原生质球。本文提供了一种革兰氏阴性菌原生质球形成的实验方案：
- 制备缓冲液 P2（表1) 从冻干粉中制备。在1.5 ml离心管中，将2 mg溶菌酶轻轻溶解于0.1 M EDTA（pH 8）中。缓冲液P2必须在实验当天新鲜配制。
- 配制含蛋白酶抑制剂的Tris缓冲液（P3缓冲液）。向10 ml Tris缓冲液中加入0.1 ml 1 M苯甲基磺酰氟（PMSF）表1) 至终浓度为 10 mM。应立即使用该缓冲液，以确保 PMSF 作为蛋白酶抑制剂的正常功能。
- 将细胞沉淀重悬于10 ml含蛋白酶抑制剂的Tris缓冲液中，并将溶液转移至15 ml锥形管。
- 加入1 ml P2缓冲液，冰上孵育30分钟。
- 通过离心收集球状体，3,000 x g 离心 30 分钟，小心弃去上清液。
- 将原生质球沉淀在 -20°C 下孵育过夜。
2. Strep-标签膜蛋白（诱饵蛋白）的纯化
- 将原生质球沉淀置于冰上。
- 在原生质球沉淀于冰上融化期间，为每份原生质球样品准备 10 ml P3 缓冲液。将 1 mg DNase I 轻柔溶解于 10 ml Tris 缓冲液中。使用前加入 0.1 ml 1 M PMSF。
- 用 6 ml 新鲜配制的 P3 缓冲液重悬沉淀。在冰上对样品进行超声处理，每次持续 1 分钟，共 4 次，每次间隔 1 分钟，以破坏原生质球。
- 以 10,000 × g 离心 10 分钟，收集细胞碎片。用移液器将上清液转移至超速离心管中。
- 以 100,000 × g 离心 30 分钟，沉淀膜组分。用 Tris 缓冲液小心洗涤沉淀，切勿将其溶解。用纸巾（e.g. Kleenex）擦干管壁。整个操作过程中避免扰动沉淀。
- 用 1 ml Tris 缓冲液小心重悬沉淀（= 膜组分）。取 20 µl 等分试样，通过 BCA 法（e.g. BCA assay）测定蛋白浓度。此步骤后，膜样品可在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存。
3. Strep标签膜诱饵蛋白的纯化及SDS-PAGE
- 用Tris缓冲液将膜组分的蛋白浓度调整至5 mg/ml。取2.5 ml膜组分（5 mg/ml）加入超速离心管中，加入0.25 ml 20% Triton X-100，使终浓度为2%，以溶解膜蛋白。加入微型磁力搅拌子，在冰上搅拌1小时。
注意：尽管通常使用Triton X-100作为去垢剂效果良好，但为优化实验条件，可尝试更换其他去垢剂。在这方面，我们发现使用适用于目标膜诱饵蛋白功能纯化的去垢剂效果最佳。 - 在执行步骤3.1的同时，从（表1）中配制50 ml缓冲液W和5 ml缓冲液E。将10 ml 5倍浓缩的缓冲液W加水定容至50 ml，并加入150 µl 20% Triton X-100。
- 将1 ml 5倍浓缩的缓冲液E加水定容至10 ml，并加入30 µl 20% Triton X-100。用8 ml缓冲液W平衡1 ml Strep-Tactin superflow重力流层析柱。
注意：在整个纯化过程中，任何缓冲液中所添加的去垢剂浓度必须比其临界胶束浓度（cmc）高10倍，这一点至关重要 。
- 将1 ml 5倍浓缩的缓冲液E加水定容至10 ml，并加入30 µl 20% Triton X-100。用8 ml缓冲液W平衡1 ml Strep-Tactin superflow重力流层析柱。
- 从溶解样品中取出微型磁力搅拌子，在100,000 × g条件下超速离心30分钟，沉淀不溶性膜组分。用移液器小心移取上清液用于后续纯化。
- 将上清液上样至层析柱。仅依靠重力流过柱。用5 ml缓冲液W洗涤层析柱，重复此洗涤步骤5次。
- 用1 ml缓冲液E洗脱膜诱饵蛋白。重复此洗脱步骤4次。
- 使用离心过滤装置将第2、3、4次洗脱组分浓缩至300 µl。
- 将每个样品200 µl与50 µl 5倍SDS-PAGE上样染料混合。将每份样品均分至125 µl等份。取其中一份在95 °C下煮沸20分钟，以逆转甲醛交联。将样品在室温下静置冷却至少10分钟。
- 将每份样品30 µl上样至适合免疫印迹的聚丙烯酰胺凝胶的单个泳道中。使用预染蛋白分子量标记物以获得最佳参照，并进行SDS-PAGE10电泳。
4. 免疫印迹分析以确认相互作用蛋白
- 完成步骤 3.8 后，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上 例如 半干式
- 用封闭液封闭膜以防止非特异性标记。通过称量牛血清白蛋白（BSA）配制封闭液，使其在含0.05% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBS-T）中达到3%（w/v）的终浓度。使用足量封闭液完全覆盖膜，于室温下封闭1小时。
- 稀释并按照常规方法孵育针对猎物蛋白的特异性一抗。使用HRP标记的抗体作为二抗。
- 使用高灵敏度化学发光检测试剂盒显影免疫印迹。通过传统胶片显影程序或数字成像设备监测信号。
5. 用于鉴定相互作用伴侣的纳升液相色谱-电喷雾电离-串联质谱高分辨率实验
- 若猎物蛋白无特异性抗体，或需鉴定未知的相互作用蛋白，则使用质谱法（MS）进行鉴定。为防止角蛋白污染，应使用预制胶进行蛋白质分离。
- 根据制造商说明书，使用适用于质谱分析的染色试剂盒对SDS-PAGE进行银染。所有染色和洗涤步骤均在玻璃槽中进行。
- 切下相应条带，并通过高分辨率液相色谱-质谱联用技术（LC/MS9）进行分析。
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结果
膜蛋白SPINE分析可实现膜蛋白及其瞬时相互作用蛋白伙伴的共纯化。该共纯化通过使用交联剂甲醛来实现。有两个关键参数可防止非特异性交联：甲醛浓度和交联时间。通过免疫印迹可轻松控制甲醛的使用量，确保其充分但不过量。甲醛交联的蛋白质复合物可通过煮沸解离，但不能通过SDS处理解离。因此，在未煮沸样品的免疫印迹中，Strep标签膜蛋白诱饵的上部区域会呈现弥散条带，从而可观察到这些复合物。
一个包含所有必要对照的膜蛋白SPINE实验的代表性结果如图2所示。实验中使用的诱饵蛋白为大肠杆菌（Escherichia coli）的整合膜蛋白CpxA6,11。CpxA是一种感应激酶，包含一个N端感应结构域，该结构域具有两个跨膜结构域（TMD），连接一个较大的胞外感应结构域，以及一个C端高度保守的胞内催化结构域12。在受到刺激后，CpxA会激活其对应的反应调节蛋白CpxR，活化的CpxR随后扩散以介导下游应答反应。在膜蛋白SPINE实验中，Strep标签被融合至CpxA的C末端（CpxA-Strep）。在未经煮...
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讨论
膜蛋白SPINE分析是一种生物化学方法，可用于验证并鉴定膜蛋白此前未知的相互作用伙伴。膜蛋白SPINE技术结合了甲醛介导的体内交联与Strep标签膜蛋白诱饵的纯化。结合免疫印迹法，可验证预测的相互作用伙伴（图2）。此外，结合质谱分析，则可鉴定未知的相互作用伙伴（图3）。对于这两种应用，均无需对捕获蛋白（猎物蛋白）进行任何修饰。而且，膜蛋白SPINE具有足够的灵敏度，能够检测内源性表达的猎物蛋白6。
本文介绍了一种针对革兰氏阴性菌膜蛋白优化的实验方案。革兰氏阴性菌的包膜将细胞质与外界环境分隔开来，除了细胞质膜外，还含有外膜和肽聚糖囊状结构。因此，本方案包括去除外膜和肽聚糖囊状结构，从而获得所谓的球状体。由于此类方案适用于大多数细胞类型，本实验方案应可适用于绝大多数膜蛋白的研究。此外，还需考虑以下几点。
首先，用于过表达膜诱饵蛋白的载体拷贝数需要在高水平与低水平之间取得平衡：高水平可保证足够的膜蛋白纯化产量，而低水平则可防止...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本研究得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）GraKo1121、Hu1011/2-1 和 SFB940 项目对 S.H. 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 37% 甲醛 | Roth | 4979.1 | 使用期限不应超过一年 |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Pierce | 23225 | |
| 微型磁棒 | Roth | 0955.2 | 长度 5 mm，直径 2 mm |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | 用于溶解的标准去垢剂 |
| n-十二烷基-β-麦芽糖苷 | Glycon | D97002-C | 溶解 CpxA 的最佳去垢剂 |
| 1 ml Strep-Tactin superflow 重力流层析柱 | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag 蛋白纯化缓冲液套装 | IBA | 2-1002-001 | 包含缓冲液 W 和缓冲液 E |
| Amicon Ultra-4 离心过滤器 | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico 化学发光底物 | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest 银染试剂盒 | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver 染色试剂盒 | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| 超速离心机 |
参考文献
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