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方法文章

非人灵长类动物肺脏脱细胞与再细胞化：基于专用大型器官生物反应器的方法

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DOI：

10.3791/50825

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2013年12月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Stem Cell Research and Regenerative Medicine, Tulane University School of Medicine, 2Division of Regenerative Medicine, Tulane National Primate Research Center, 3Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine, 4Department of Pharmacology, Tulane University School of Medicine

本文内容

摘要

全器官脱细胞技术可制备天然生物支架，用于再生医学。本文介绍了一种非人灵长类动物肺再生模型，其中完整肺脏在生物反应器中进行全器官脱细胞处理，随后接种成体干细胞和内皮细胞，该生物反应器可支持血管循环和液体培养基通气。

摘要

可用于满足当前及未来器官移植需求的肺源数量严重不足。生物人工组织再生技术是传统器官移植的一种颇具吸引力的替代方案。该技术利用器官天然的生物细胞外基质（ECM）作为支架，将自体细胞或干细胞/前体细胞接种并培养于其上，从而促进原始组织的再生。天然ECM通过一种称为脱细胞化的过程获得。脱细胞化通过使用一系列去污剂、盐类和酶处理组织，有效去除细胞成分，同时保持ECM结构的完整。利用脱细胞化及后续再细胞化技术对啮齿类动物肺脏进行的研究表明，所生成的类似肺组织在气体交换功能方面仅实现了有限的成功。 体内尽管啮齿类动物模型提供了必要的概念验证，但其结果无法直接转化为人类应用。非人灵长类动物（NHP）是更适合用于研究生物人工器官制备以实现最终临床应用的模型。

本文介绍了从恒河猴（NHP）获取肺脏后实现完全脱细胞的实验方案。所得无细胞肺支架可接种多种细胞，包括间充质干细胞和内皮细胞。文稿还描述了一种生物反应器系统的构建方法，该系统可在负压通气产生的机械牵拉与应变以及血管内脉动灌注条件下培养接种细胞的恒河猴肺组织；这些力学刺激已知可分别促进细胞向肺系和内皮系分化。文中提供了脱细胞及细胞接种的代表性结果。

引言

组织和器官的生物工程是再生医学领域的一个重要补充。组织和器官的构建 "实验室培养的" 获得可用于移植以替代病变器官功能的器官，对于满足当前和未来器官移植的需求具有重要意义。组织工程的基本原理是将特定类型的细胞或其前体细胞接种到支架上，该支架可维持所构建组织的形态，同时提供适当的生长因子和培养条件，以模拟发育或再生过程。尽管已使用合成支架进行组织工程研究，但天然细胞外基质（ECM）可能是实现器官特异性支架的最佳来源。全器官脱细胞是一种可在去除细胞的同时保留天然ECM化学成分和结构特征的技术。所得的无细胞基质支架可作为平台，用于接种并培养再生细胞。 体外1,2.

已开发出多种啮齿类动物肺部脱细胞及后续再细胞化的模型，以研究该技术的可行性3-6。尽管这些模型提供了关键的概念验证，但啮齿类动物模型并不能直接转化为满足人类临床需求的应用。最近一项研究指出，小鼠与人类在创伤性损伤（及相关炎症）中的基因组反应相关性较差；这些发现引发了对使用小鼠作为人类此类复杂生化过程模型有效性的质疑7。非人灵长类动物（NHP）模型的优势在于其在基因组、解剖和生理水平上与人类生物学高度相似，并且允许更灵活的操作，从而更有利于外推至人类应用。猕猴已被广泛用于多种临床前研究，是组织工程研究的优良模型8-11。我们近期报道了利用一种对肺ECM影响最小的方案成功实现猕猴（Macaca mulatta）肺脏脱细胞的过程12。 肺脱细胞通过依次使用四种由去垢剂、盐类和酶组成的脱细胞溶液处理组织实现，期间交替使用去离子水（dH2O）和PBS进行清洗。我们通过改进Price et al.最初描述的方案，对该流程进行了优化4。采用多种组织学和蛋白质分析技术，对所得无细胞基质的组分相对于天然猕猴肺组织的组成进行了表征。

本报告中，我们展示了一种详细的非人灵长类动物肺脏脱细胞方法，以及利用大型器官生物反应器对所得无细胞肺支架进行再细胞化的操作流程，该技术最初由 Calle et al.13 在 JoVE 中报道。 通过修改原始方案以适应大型动物肺脏的尺寸、通气和灌注需求，该技术已成功从啮齿类动物模型过渡至恒河猴模型。本报告中所有研究均按照杜兰国家灵长类动物研究中心现行的机构生物安全委员会（IBC）政策进行。该技术的演示至关重要，因为在缺乏可视化操作步骤的情况下，识别解剖结构并对较大器官进行物理操作有时十分困难。这些方法所支持的研究为在脱细胞恒河猴肺中开展关键的临床前研究奠定了基础，可用于评估以恒河猴间充质谱系干细胞和恒河猴微血管内皮细胞进行再细胞化的效果。我们改进的生物反应器可模拟发育环境，在大型动物肺脏中施加机械牵拉和应变力，从而能够在已知有利于肺组织和内皮发育的条件下研究肺再细胞化过程13-15。

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方案

1. 全器官猕猴肺脱细胞

  1. 溶液的制备
    1. 将10-15 L去离子水（dH2O）分装至1-2 L瓶中，进行高压灭菌。
    2. 在磁力搅拌器上搅拌的同时，将1 ml Triton X-100加入999 ml dH2O中，配制"Triton溶液"（0.1% Triton X-100溶于dH2O）。使用0.22 µm滤器装置过滤该溶液，并于室温保存。
    3. 在搅拌条件下，缓慢将20 g脱氧胆酸钠（SDC）加入约900 ml dH2O中，配制"SDC溶液"（2% SDC溶于dH2O）。待SDC完全溶解后，将溶液转移至量筒中，并用dH2O定容至1 L。使用0.22 µm滤器装置过滤该溶液，并于室温保存。
    4. 将58 g NaCl加入约900 ml dH2O中，搅拌至完全溶解，配制"NaCl溶液"。再用dH2O补足至终体积1 L，过滤后于室温保存。
  2. 器官准备
    1. 处理猕猴组织时，必须格外小心以防止感染性暴露事件。在接触非人灵长类动物组织前，应穿戴以下个人防护装备（PPE）：外科口罩、面罩、外科手套、一次性防护服以及第二层外科手套。
    2. 从动物尸检中采集完整的心肺组织块，并将其置于含50 U/ml肝素的PBS中，以防止外部血液凝固。
    3. 将肺平放在解剖盘中，使用适当尺寸的带倒刺雌性鲁尔接头插管肺动脉。用经酒精灭菌的扎带固定插管位置。
    4. 在气管周围套上无菌扎带，将一个0.250英寸 雌性鲁尔接头插入气管开口，然后收紧扎带，使气管紧固在接头倒刺周围。
    5. 通过灌注含30 U/ml肝素和5 µg/ml硝普钠（SNP）的PBS溶液排出肺内滞留空气。让溶液依靠肺的自然回缩力排出，并重复灌注两次。第三次灌注后，用鲁尔帽封闭气管插管，使液体保留在肺内。
    6. 剪除心脏心尖部分，并用PBS-肝素-SNP溶液冲洗心室内腔，以清除残留血液。切开双侧心房，以便灌注时促进肺循环系统的引流。
    7. 将心肺组织块浸入dH2O中。用60 ml注射器吸取PBS-肝素-SNP溶液。用镊子将动脉插管完全浸入水中，使血管开口处的所有气泡逸出。连接注射器，小心抽出活塞，使液体缓慢流入血管系统。
    8. 取下气管插管上的堵头，让气道内的液体依靠肺的自然回缩力排出。持续向连接血管插管的注射器中添加PBS-肝素-SNP溶液，以维持动脉上方约15-20 cm H2O的压力。持续灌注，直至尽可能清除肺血管系统中的血液。
  3. 脱细胞处理
    1. 第1天：将心肺组织块浸入dH2O中。分别通过连接在浸没状态下的气管和动脉插管上的60 ml 注射器，对肺进行充气和灌注dH2O。重复气道和血管冲洗共5次（包括首次），即用dH2O清洗5轮。
    2. 将肺从水中取出，浸入Triton溶液中。如前法对肺进行Triton溶液的充气与灌注。再次重复灌注一次，随后将浸没的器官置于Triton溶液中于4 °C下过夜孵育。
    3. 第2天：过夜孵育后，将肺组织块从Triton溶液中取出，用dH2O外部清洗，再将组织块浸入新鲜dH2O中。按照步骤 1.3.1的方法重复dH2O清洗5次。
    4. 将肺从dH2O中取出，浸入SDC溶液中。按照步骤1.3.2的方法，以相同方式对肺进行SDC溶液的充气与灌注。将组织块浸没于SDC溶液中于4 °C下过夜孵育。
    5. 第3天：按照步骤1.3.1的方法再次用dH2O清洗组织。
    6. 将组织从dH2O中取出，浸入NaCl溶液中。按照步骤1.3.2的方法，以相同方式对肺进行NaCl溶液的充气与灌注。将组织浸没于NaCl溶液中，在室温下孵育1小时。
    7. 按照步骤1.3.1的方法，用dH2O彻底清洗肺组织以去除NaCl溶液。
    8. 新鲜配制"DNase溶液"（30 µg/ml DNase、1.3 mM MgSO4、2.0 mM CaCl2溶于dH2O）。将肺浸入该溶液中，并如步骤1.3.2所述向气道和血管系统灌注该溶液。将肺在DNase溶液中于室温下孵育1小时。
    9. 新鲜配制"PBS溶液"（1x PBS + 5x抗生素/抗真菌剂）。将肺从DNase溶液中取出，用PBS溶液进行外部清洗。将肺浸入PBS溶液中，按照步骤1.3.1的方法清洗5次。
    10. 将肺置于密封容器中的PBS溶液中，于4 °C下过夜保存。次日（第4天），用新鲜的冰冻PBS溶液按照步骤1.3.1的方法清洗5次，随后将肺保存于4 °C的无菌密封容器内的PBS溶液中，直至使用。

2. 大型器官生物反应器

  1. 组装与组织安装
    1. 预先组装呼吸回路和血管回路结构，以及气管和血管插管适配器（图1）。除无菌包装的空气过滤器和注射端口外，所有生物反应器组件均需进行高压灭菌。
    2. 在层流罩内按照图2所示示意图组装生物反应器组件。在使用前，立即用已在细胞培养孵箱中平衡至5% CO2环境的培养基填充主腔室。
    3. 将气管和血管插管适配器连接至肺插管，并通过将肺组织浸入培养基中，并将插管适配器连接至改装盖上的相应接口，将器官安装至主生物反应器腔室。连接完成后，牢固密封盖子；在再细胞化期间，腔室将不再打开。
    4. 用培养基填充气管储液罐至约一半高度，并安装改装后的盖帽。
    5. 按图示在所有腔室上安装无菌0.22 µm注射式过滤器、鲁尔堵头和注射端口。
    6. 通过呼吸回路装置将气管储液罐连接至主腔室。按图示连接呼吸回路管道。
    7. 使用注射端口和装有18 G针头的60 ml注射器从管道中抽吸空气；调节三通阀的方向，使液体流向注射器。
    8. 将已密封且连续连接的生物反应器腔室连同已安装的器官一起转移至组织培养孵箱，以平衡温度和气体环境。通过连接至主腔室的注射泵以约每2分钟一次完整"呼吸"的频率对肺进行通气，并通过蠕动泵以约10 ml/min的流速灌注血管系统，持续约30分钟。
  2. 气道接种
    1. 制备所需细胞密度的细胞悬液用于气道接种（体积取决于器官大小）。
    2. 通过连接在呼吸回路三通阀上的注射端口，轻柔注入细胞悬液使肺膨胀。
    3. 在37 °C、5% CO2条件下静置培养过夜，期间不进行气道通气或血管灌注，以使细胞附着于去细胞化肺基质。
    4. 过夜孵育后，重新启动标准气道通气程序，并将器官继续培养3–7天（或按所需时间）。
  3. 血管接种
    1. 参照气道细胞接种的方法，制备内皮细胞悬液。
    2. 将细胞悬液转移至含有小型磁力搅拌子的内皮细胞接种储液罐中。
    3. 旋转连接主腔室与内皮接种储液罐之间的管道中的三通阀，改变流路方向，并通过蠕动泵在轻柔搅拌下逐步接种内皮细胞。
    4. 当接种完成（即 内皮细胞接种储液罐中的细胞悬液已耗尽）时，停止灌注，静置孵育约4–6小时。随后以约10 ml/min的流速（或根据监测情况设定所需压力）重新启动主腔室培养基的血管灌注。
    5. 持续进行血管灌注培养3–7天。

3. 故障排除与替代方法

  1. 气管插管：如果气管过小，可使用缝线代替扎带固定鲁尔套管。¼英寸 雌性鲁尔接头可作为适用于多种气管直径的足够套管。
  2. 通过肺动脉灌注去除血液由于组织来源于尸体动物，微血栓较为常见，导致肺毛细血管床的部分区域无法完全清除残留血液。然而在脱细胞过程中，这些小血管会变得通透，脱细胞试剂可有效裂解并降解这些血凝块。脱细胞前应进行灌注以尽可能清除血液，但无需完全去除实质组织中的所有血迹。
  3. 肺部液体的排出：猕猴肺部保持较强的自然回缩力 离体即使充满液体时也保持通畅。然而，在脱细胞过程中，细胞被裂解并释放出物质（包括DNA），这些物质会增加灌注液体的黏度，从而使其更难排出。将肺组织浸没在灌注液中于4 °C孵育过夜，通常足以使肺完全排出黏稠液体。或者，尽可能让肺排出液体后，继续灌注后续溶液；加入去垢剂和去离子水冲洗通常有助于清除黏稠液体，使脱细胞过程高效进行。
  4. 向洗涤剂溶液中添加抗生素：抗生素和抗真菌剂可添加至去离子水洗涤液以及洗涤剂溶液中；然而，青霉素/链霉素在存在脱氧胆酸钠时会发生沉淀，这些沉淀物可能干扰脱细胞及洗涤过程。此外，在脱细胞过程中无需添加抗生素/抗真菌剂，因为所用浓度的洗涤剂已足以裂解并杀灭微生物。脱细胞完成后，使用含5倍青霉素/链霉素/两性霉素B的PBS溶液进行冲洗和保存，足以防止大多数污染。
  5. 去除生物反应器管路中的空气使用注射器将针头插入三通旋塞的针口，可有效抽吸生物反应器管路中的空气。或者，也可采用同样方式连接注射器，向管路中灌注1× PBS或培养基，以在安装器官前排出空气。
  6. 脱细胞与再细胞化过程中及之后肺脏的通气与灌注尽管本报告中列出的流速和时间足以实现细胞黏附以及气道液体通气和血管灌注，但这些参数应由使用者通过实验确定。培养时间也可根据接种细胞的生长速率进行调整。

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结果

下图所示结果来自分别进行的实验，其中气道或血管腔室分别接种了食蟹猴骨髓来源的间充质干细胞或食蟹猴肺来源的微血管内皮细胞，这些细胞的分离与表征如前所述16-18。

在脱细胞过程中，猕猴肺组织逐渐变白，最终呈现半透明外观；然而，肺组织保持了其宏观解剖结构，仍具有较强的弹性，并能在液体充盈后产生自然回缩（图 3A 和 3B）。在显微水平上，脱细胞后肺组织的组织学超微结构保持完整，即通过低倍显微镜仍可清晰分辨细支气管、呼吸性细支气管、肺泡囊、血管及毛细血管（图 3C 和 3D）。然而，组织学微解剖结果显示，尽管脱细胞过程对肺的宏观结构和超微结构仅造成轻微干扰，但组织中已完全不存在完整的细胞（图 3E 和 3F）。

细胞经去污剂裂解后释放的基因组DNA通过DNase处理被降解，并在后续洗涤步骤中被有效去除。使用Qi...

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讨论

可采用多种物理、化学和酶学方法高效且有效地对组织进行脱细胞处理12,20。利用大型器官制备三维生物基质所面临的挑战包括需要大量脱细胞溶液、昂贵的商用设备（例如生物反应器），以及为获得最终组织来源产物所需进行的大量方法学调整。我们的方法提供了一种简明的途径，可最大限度减少物理操作、试剂用量和成本。恒河猴肺组织的完全脱细胞和灭菌仅需三天；此外，我们的脱细胞组织可在4 °C下保存数周，无污染或支架降解迹象。我们近期报道了对脱细胞恒河猴肺支架的详细表征，结果发现Triton X-100/脱氧胆酸法（改良自Price 等4）可高效去除细胞，同时对肺基质的影响最小4,19。

我们自主研发的生物反应器由生物实验室中常见的部件组成。该生物反应器的耗材或可更换组件总估算成本为 <500美元。尽管这种生物反应器是一种 "基础模型" 可配备多种组件以监测或改善其功能（例如压力、流量、温度和 pH 传感器）。根据我们对恒河猴肺支架再细胞化的经验，启动再细胞化时的理...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

作者谨向《组织工程学》（Tissue Engineering）的编辑致谢，感谢其允许在本报告中使用此前发表文章中的图片。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
亚硝基铁氰化钠Sigma-Aldrich71778-25G
肝素钠盐FisherBP2425
曲拉通 X-100FisherBP151-100
脱氧胆酸钠FisherBP349-100
氯化钠Fisher7647-14-5
牛胰 DNaseSigma-AldrichDN25制备母液，分装并冷冻保存
硫酸镁Fisher10034-99-8
氯化钙FisherC614-500
PBS（不含 Ca/Mg）Gibco, Life Technologies10010-031
抗生素-抗真菌剂Gibco Life Technologies15240062
细胞培养基
α-MEM 培养基Gibco Life Technologies12561-072
199 培养基Gibco Life Technologies11150067
优质胎牛血清Atlanta BiologicalsS11150
L-谷氨酰胺 100xGibco Life Technologies25030-081
内皮细胞生长补充剂（ECGS）ScienCell1052
抗生素-抗真菌剂Gibco Life Technologies15240062
细胞接种与生物反应器培养
止回阀Cole-ParmerEW-98553-20
Y型连接器Cole-ParmerED-30614-08
三通旋塞阀Harvard Apparatus721664
MasterFlex L/S 14 管路Cole-Parmer96420-14
MasterFlex L/S 16 管路Cole-Parmer96420-16
1/8 英寸雄性锁紧鲁尔接头Cole-ParmerEW-45505-04
1/8 英寸雌性鲁尔接头Cole-ParmerSI-45502-04
雄性鲁尔锁紧堵头Cole-ParmerEW-45505-56
注射端口Medi-Dose EPSIV2004
乳胶管St. Louis Medical SuppyHN10910
软管夹Cole-ParmerEW-06832-02
2 L 广口瓶Fisher05-719-276
60 ml 注射器FisherNC9035364

参考文献

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