非人灵长类龙脱细胞和Recellularization使用专门的大型器官生物反应器

Summary

全器官脱细胞产生可用于再生医学的天然生物支架。描述了一种非人灵长类动物肺再生模型，其中整个肺脱细胞，然后在促进血管循环和液体培养基通气的生物反应器中接种成体干细胞和内皮细胞。

Abstract

可用的肺数量不足，无法满足当前和未来的器官移植需求。生物人工组织再生是传统器官移植的一种有吸引力的替代方案。该技术利用器官的天然生物细胞外基质 （ECM） 作为支架，自体细胞或干细胞/祖细胞可以接种并培养到该支架上，以促进原始组织再生的方式进行培养。天然 ECM 通过称为脱细胞的过程分离。脱细胞是通过用一系列去污剂、盐和酶处理组织来实现的，以实现有效去除细胞物质，同时保持 ECM 完整。利用啮齿动物肺的脱细胞化和随后的再细胞化进行的研究表明，在产生能够在体内进行气体交换的肺样组织方面取得了边际成功。虽然提供了基本的概念验证，但啮齿动物模型不能直接转化为人类使用。非人灵长类动物 （NHP） 提供了一种更合适的模型，用于研究生物人工器官生产的最终临床用途。

提出了实现从 NHP 恒河猴获得的肺完全脱细胞的方案。所得的脱细胞肺可以接种多种细胞，包括间充质干细胞和内皮细胞。该手稿还描述了生物反应器系统的开发，其中细胞接种的猕猴肺可以在负压通气以及通过脉管系统的脉动灌注提供的机械拉伸和应变条件下培养;已知这些力分别沿肺和内皮谱系指导分化。提供了脱细胞化和细胞接种的代表性结果。

Introduction

组织和器官的生物工程是再生医学领域的一个有吸引力的补充。为了满足当前和未来对移植需求的需求，创造适合移植到患者体内以替代患病器官功能的"实验室培养"器官是非常可取的。组织工程的原理是将所需的细胞类型或其祖细胞接种到支架中，该支架支持工程组织的形状，同时提供模拟发育或再生过程所需的适当生长因子和培养条件。虽然合成支架已用于组织工程，但天然细胞外基质 （ECM） 可能是用于此目的的器官特异性支架的最佳来源。全器官脱细胞是一个允许去除细胞同时保持天然 ECM 的化学和结构方面完整的过程。所得的脱细胞基质支架可用作再生细胞接种和体外培养的平台 ^1,2。

已经开发了几种肺脱细胞和随后的再细胞化的啮齿动物模型来研究这项技术的可行性^3-6。虽然提供了基本的概念验证，但啮齿动物模型不能直接转化为人类临床需求。最近的一项研究指出，小鼠和人类之间对创伤性损伤（和相关炎症）的基因组反应相关性不佳;这些发现对使用小鼠作为人类这种复杂生化过程模型的有效性提出了质疑⁷。非人灵长类动物 （NHP） 模型的优势在于在基因组、解剖学和生理学水平上与人类的生物学非常相似，并允许更灵活的作，以便更好地外推到人类使用。恒河猴已用于各种临床前应用，是研究组织工程的优秀模型^8-11。我们最近描述了恒河猴 （Macacca mulatta） 肺的成功脱细胞，利用一种对肺 ECM 影响最小的程序

Protocol

1. 全器官猕猴肺脱细胞

1. 溶液的制备
   在
   1. 1-2 L 瓶中高压灭菌 10-15 L 去离子水 （dH₂O）。
   2. 通过在磁力搅拌器上搅拌，将 1 ml Triton X-100 混合在 999 ml dH₂O 中，制备"Triton 溶液"（0.1% Triton X-100 在 dH₂O 中）。通过 0.22 μm 过滤装置过滤溶液。在室温下储存。
   3. 通过在搅拌的同时将 20 g 脱氧胆酸钠 （SDC） 缓慢加入 ~900 ml dH₂O 中来制备"SDC 溶液"（2% SDC 在 dH₂O 中）。一旦 SDC 溶解，将溶液转移到量筒中，并用 dH₂O 使体积达到 1 ml。通过 0.22 μm 过滤装置过滤溶液。在室温下储存。
   4. 通过将 58 g NaCl 添加到 ~900 ml dH₂O 中并搅拌直至完全溶解来制备"NaCl 溶液"。加入 dH₂O 至最终体积为 1 L，过滤，并在室温下储存。
2. 器官准备
   1. 在处理猕猴组织时，必须格外小心，以防止感染性暴露事件。在处理非人类灵长类动物组织之前，请穿戴以下个人防护装备 （PPE

Results

下面显示的结果代表了单独的实验，其中气道或血管室分别接种了恒河猴骨髓来源的间充质干细胞或恒河猴肺来源的微血管内皮细胞，它们被分离并表征为如前所述^16-18。

在整个脱细胞过程中，猕猴肺表现出逐渐的美白，最终在过程结束时呈现半透明的外观;然而，肺保持了其大体解剖特征，在很大程度上保持了弹性，并且在用液体充气后能够产生自然的反冲力（图 3A 和 3B).在微观水平上，脱细胞后组织学超微结构保持完整;也就是说，细支气管、呼吸细支气管、肺泡囊、血管和毛细血管仍然可以通过低倍显微镜非常清楚地区分（图 3C 和 3D）。然而，组织学显微解剖学表明，虽然肺的大体解剖结构和超微结构受到脱细胞的轻微干扰，但组织完全缺乏完整的细胞（图 3E 和 3F）。

细胞被去污剂裂解时释放的细胞 DNA 通过 DNase 处理降解，并.......

Discussion

组织可以通过多种采用物理、化学和酶促剂的方法高效且有效地脱细胞^12,20。从大型器官生产 3D 生物基质的挑战包括需要大量脱细胞溶液、昂贵的商业设备（即 生物反应器）以及获得最终组织衍生产品所需的令人眼花缭乱的方法学扰动。我们的方法提供了一种简单的方法，可以最大限度地减少物理作、试剂量和成本。恒河猴肺部的完全脱细胞和绝育仅需三天;此外，我们的脱细胞组织可以在 4 °C 下储存数周，而不会出现污染或支架降解的迹象。我们最近报告了对脱细胞猕猴肺支架的详细表征，其中我们发现 Triton X-100/脱氧胆酸方法（修改自 Price 等人。⁴）有效去除细胞，同时对肺基质的影响最小^4,19。

我们的内部生物反应器由生物实验室中常见的部件组成。生物反应器的消耗品或可更换部件的总估计成本为 500 <。虽然该生物反应器是“基础模型”，但它可以安装各种组件来监测或改进其功能（例如压力、流量、温度和 pH 传感器）。根据我们在对猕猴肺支架进行再细胞化的经验，对于气道室中的骨髓和脂.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
硝普钠	Sigma-Aldrich	71778-25G
肝素钠盐	Fisher	BP2425
Triton X-100	Fisher	BP151-100
脱氧胆酸钠	Fisher	BP349-100
氯化钠	Fisher	7647-14-5
牛胰腺 DNase	Sigma-Aldrich	DN25	制备原液，分装并冷冻
硫酸镁	Fisher	10034-99-8
氯化钙	Fisher	C614-500
PBS（无钙/毫克）	Gibco， Life Technologies	10010-031
抗生素-抗真菌剂	Gibco Life Technologies	15240062
细胞培养基
Alpha MEM	Gibco Life Technologies	12561-072
培养基 199	Gibco Life Technologies	11150067
优质胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150
L-谷氨酰胺 100x	Gibco Life Technologies	25030-081
内皮细胞生长添加剂 （ECGS）	ScienCell	1052
抗生素-抗真菌剂	Gibco Life Technologies	15240062
细胞接种和生物反应器培养
止回阀	Cole-Parmer	EW-98553-20
Y 型接头	Cole-Parmer	ED-30614-08
3 通旋塞阀	Harvard Apparatus	721664
MasterFlex L/S 14 管	Cole-Parmer	96420-14
MasterFlex L/S 16 管	Cole-Parmer	96420-16
外螺纹锁 Luer 1/8 in	Cole-Parmer	EW-45505-04
内螺纹 Luer 1/8	in Cole-Parmer	SI-45502-04
外螺纹 Luer 锁塞	Cole-Parmer	EW-45505-56
注射口	Medi-Dose EPS	IV2004
乳胶管	St. Louis Medical Suppy	HN10910
软管夹	Cole-Parmer	EW-06832-02
2 L 广口罐	Fisher	05-719-276
60 ml 注射器	Fisher	NC9035364