从cDNA拯救重组新城疫病毒

摘要

近年来，为了开发新的疫苗和治疗载体等应用，人们对新城疫病毒（NDV）进行了广泛研究。这些研究得以实现，得益于从cDNA中拯救重组病毒的技术，例如本文所描述的方法。

摘要

新城病毒（Newcastle disease virus，NDV）是副黏病毒科（Paramyxoviridae）Avulavirus 属的代表种¹，是一种非分段、负链、单股、有包膜的RNA病毒（图1），具有作为疫苗载体以及人类疾病治疗载体的潜力。只有在建立了反向遗传学技术以从编码其完整基因组cDNA的质粒中拯救出重组病毒之后^2-5，对这些应用的深入探索才成为可能。通过标准的克隆方法，可在体外（in vitro）方便地对病毒cDNA进行修饰，以改变病毒的基因型和/或插入新的转录单元。拯救此类基因修饰病毒为研究影响感染多个阶段的因素提供了有力工具，同时也促进了用于抗原表达与递送的疫苗和治疗载体的开发与优化。本文中，我们描述了一种拯救重组NDV的实验方案。

引言

新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）是一种属于Avulavirus属的禽副黏病毒¹，是一种具有重要经济意义的人畜共患病原体，因此在全球范围内受到广泛研究和监测，可对世界各地的家禽养殖业造成严重影响。尽管NDV并非人类致病原，但它在兽医学领域之外也得到了深入研究，既作为副黏病毒的模型，也因其显著且天然的溶瘤特性而备受关注⁶。对NDV的研究极大地受益于单股不分节段负链RNA病毒反向遗传学技术的发展，该技术最初由Conzelmann及其同事在狂犬病病毒中首次报道²。自那时以来，多种携带外源基因或对其野生型基因组进行修饰的基因改造NDV已被广泛研究。这些重组病毒的研究对于鉴定NDV以及其他重要人类病原体（如甲型流感病毒⁷或新发的尼帕病毒⁸）的不同毒力因子至关重要。此外，已有大量研究探索利用这些技术增强NDV固有的抗肿瘤活性^6,9,10，主要是通过提高病毒的免疫刺激特性来实现。重组NDV的另一重要研究方向是开发针对其他病毒性疾病的疫苗候选物，例如流感^5,11,12、HIV¹³、麻疹¹⁴、SARS¹⁵以及呼吸道合胞病毒（RSV）引起的疾病¹⁶。NDV具备多种显著优势，包括人类群体中无预先存在的免疫力、外源基因插入片段的稳定性、缺乏重组活性，以及总体较高的....

方案

1. 哺乳动物细胞的准备（图4A，第1天）

转染前一天，在6孔板中接种分裂的HEp-2或A549细胞。次日细胞密度应达到80%-90%融合度。通常，一个完全融合的100 mm培养皿可分种至8个孔（每孔约1 × 10⁶个细胞）。每种需要拯救的病毒应设置2-4个不同的孔，同时额外设置2个对照孔，分别用于转染效率和MVA-T7感染效率的监测，即pCAGGs-GFP和pCITE-GFP¹⁸。

2. 用表达噬菌体T7 RNA聚合酶的重组改良安卡拉痘苗病毒（MVA-T7）感染哺乳动物细胞（图4A，第2天）

1. 将 PBS 1x/BA/PS 和培养基预热至 37 °C。
2. 用 1 ml PBS 1x/BA/PS 洗涤细胞两次。
3. 在室温下，用 MVA-T7 病毒以感染复数（moi）为 1 pfu/细胞的条件，在 200 μl PBS/BA/PS 最终体积中感染培养的哺乳动物细胞，孵育 1 小时。
4. 在病毒感染孵育期间，按步骤 3 所述制备转染混合物。

3. 哺乳动物细胞转染（图4A，第2天）

1. 脂质体转染试剂的制备：每次拯救实验取1-2 μg LPF2000与250 μl OptiMEM混合，室温孵....

结果

新城疫病毒（NDV）的拯救是一种成熟且常规的技术，通常在具备病毒完整cDNA的实验室中进行。然而，该方法本身具有随机性，因此难以实现100%的拯救效率。监测该过程的早期步骤，特别是转染效率以及MVA-T7的感染情况，有助于识别潜在问题。图5A展示了足以成功拯救NDV的标准转染效率及转染/感染效率。在禽-哺乳动物共培养体系和鸡胚中经过多轮扩增后，可通过血凝（HA）试验中出现阳性孔来检测拯救病毒的存在。NDV通过连接红细胞引起血凝，从而阻止红细胞沉降到V型孔底部。因此，缺乏血凝活性时可在孔底观察到红色圆形红细胞沉淀，易于识别（图5B）。HA试验结果呈阴性可能是由于羊水中病毒滴度不足：通常需要至少约10⁶ pfu/ml的最低滴度才能获得阳性HA结果。对于较低的病毒滴度，可使用特异性抗NDV抗体通过免疫荧光试验（IFA）进行检测。在此类情况下，建议将首次接种鸡蛋中含有的病毒再次接种鸡胚进行传代扩增。

讨论

为了成功拯救新城疫病毒（NDV），需要考虑多个因素以获得良好的结果。首先，所使用的全长cDNA构建体必须经过合理设计，以确保外源基因/修饰能够功能性地整合到NDV基因组中。这意味着，如上所述：（i）在必要时需添加适当的基因终止（GE）、基因间区（IG）和基因起始（GS）序列；（ii）外源基因内部不应含有潜在的GE或GS序列；（iii）全长重组基因组必须符合"六的规则"。

在拯救过程中，质粒制备的质量、MVA-T7 病毒储备液以及细胞的正常培养至关重要。大多数情况下，使用标准的质粒大提纯化方法即可满足要求，但对于因转基因片段过大或性质特殊而导致较难克隆和拯救的情况，可通过氯化铯密度梯度离心法进一步纯化DNA以提高效率。使用Lipofectamine进行转染通常足以实现成功的病毒拯救，尽管也可采用其他转染方法如核转染。无论采用何种方法，不同质粒之间的转染比例必须严格保持（NP、P、L、pNDV的比例分别为0.4:0.2:0.2:1）。由于病毒拯救过程较为繁琐且具有一定的随机性，每种待拯救的构建体应至少转染2-4个不同的孔，并应对同一构建体的不同克隆进行检测分析。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	任何供应商
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% 牛血清白蛋白（BA）	Sigma	232-936-2	任何供应商
胰蛋白酶-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	任何供应商
青霉素/链霉素（PS）100倍浓缩液	CORNING Cellgro	30-002-CI	任何供应商
胎牛血清（FBS）	Hyclone	SH30070.03	任何供应商
细胞系 A549 细胞（目录号 CRL-185）、HEp-2 细胞（目录号 CRL-185）、鸡胚成纤维细胞（目录号 CRL-12203）和鸭胚成纤维细胞（目录号 CCL-141）可从美国模式培养物集存库（ATCC，10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA）获得。所有细胞系均在 37 °C 含 5% CO₂ 的培养箱2 在含10% FBS、1% PS的DMEM中 鸡胚蛋 受精鸡胚可从美国康涅狄格州北富兰克林诺斯富兰克林32号公路106号富兰克林公地（邮编06254）查尔斯河实验室公司特定病原体阴性禽类供应部（SPAFAS）禽类产品与服务部获取，并于37 °C. 使用照蛋器评估胚胎的存活情况。当鸡蛋发育至8-10日龄时进行感染。感染及收获尿囊液均在无菌条件下进行。所有鸡蛋在实验结束后均按照标准实验室生物安全规程进行高压灭菌后丢弃。 鸡红细胞（RBC） 鸡红细胞可从 Truslow Farms（201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA）购买，并在 4 ℃ 保存 °C. 准备血凝（HA）试验用红细胞（RBC）：取5 ml商品化红细胞储备液，加入45 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS），于50 ml锥形管中混匀。在1,000 rpm转速下离心5分钟，小心弃去上清液。将沉淀的红细胞用1×PBS按1:1,000比例稀释，终浓度为0.5–1.0%。洗涤后的红细胞可于4℃保存 °持续数天。 质粒 质粒制备采用任何市售的质粒大提试剂盒，按照生产商提供的说明进行's 指示，用 ddH20 至最终浓度为 1 μ克/μl，并于 -20 保存 °C. 通过在260 nm和280 nm处进行分光光度法测定DNA浓度和纯度。260/280比值高于1.8的样品被视为符合拯救实验的质量要求。质粒DNA的质量还常规通过琼脂糖凝胶电泳进行二次验证。 病毒 用于拯救 lentogenic 型新城疫病毒株 Hitchner B1 的所述方案可在生物安全等级（BSL）2 条件下进行。表达 T7 RNA 聚合酶的修饰安卡拉痘苗病毒（MVA-T7）已有描述34 并由 Bernard Moss 博士提供。该病毒在鸡胚成纤维细胞融合单层中培养，并在哺乳动物（A549 或 HEp-2）细胞中进行滴定。NDV 毒种在受精鸡胚中增殖，通过免疫荧光法（IFA）使用针对纯化病毒颗粒制备的多克隆血清进行滴定。所有受污染的材料应按照标准生物安全程序进行安全灭菌和处理。 组织培养基与溶液： DMEM 10% FBS 1% PS： 杜尔贝科'改良的伊格尔's 培养基（DMEM），添加 10% 胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（P/S）：445 ml DMEM，50 ml 热灭活 FBS，5 ml 100 倍浓度的商品化 P/S 溶液。4 ℃ 保存 °C. 10倍磷酸盐缓冲液（PBS）： 80 g NaCl，2 g KCl，11.5 g Na2高通量筛选4.7H2O, 2 g KH₂PO₄2PO4. 加入ddH₂O2加水至1 L，调节pH至7.3，高压灭菌，室温保存。 1× PBS： 用 ddH₂O 将 10x PBS 按 1:10 比例稀释2O. 高压灭菌，室温保存。 100x Ca/Mg： 1.327 g CaCl20.2小时2O，2.133 g MgCl2.6H2O并加入ddH2最多至 100 ml。高压灭菌后室温保存。 1x PBS/BA/PS： 50 ml 10x 磷酸盐缓冲液（PBS）加入 437 ml ddH₂O 中2O. 高压灭菌，冷却至室温后，加入 5 ml 100x 青霉素/链霉素、3 ml 35% 牛血清和 5 ml 100x 钙/镁溶液。4 ℃ 保存 °C.