斑马鱼视觉敏锐度的定量测量：视动反应

摘要

斑马鱼已成为许多研究领域的重要工具。本文演示了一种诱导成年斑马鱼产生视觉反应并计算其功能性视敏度的方法。

摘要

斑马鱼是视觉研究中已被证实的模型，但早期的许多方法通常集中于幼鱼，或仅展示简单的反应。近年来，成年斑马鱼的视觉行为逐渐受到关注，但用于测量特定反应的方法尚处于发展初期。为填补这一空白，我们致力于建立一种可重复且准确利用视动反应（OKR）来测量成年斑马鱼视觉敏锐度的方法。本文展示了成年斑马鱼的视觉敏锐度可被测量，包括双眼和单眼的敏锐度。由于该过程不会对鱼类造成伤害，因此可在短期或长期内多次测量并比较视觉敏锐度。此处描述的视觉敏锐度测量方法操作迅速，可实现高通量检测，并可根据需要与其他视觉实验联合进行。此类分析适用于药物干预研究或疾病进展的探究。

引言

斑马鱼（Danio rerio）是研究视觉生理学的良好模型，因其视网膜与其他脊椎动物相似、生命周期短，且存在多种基因改造突变体^1,2。视动反射/反应/眼震（OKR）由平滑追踪和快速扫视眼动组成。60多年来，临床医生已证实OKR可用于客观测量患者的视力，尤其适用于评估婴儿的视觉能力^3-5。首次记录的动物OKR实验是在20世纪50年代使用鸽子完成的⁶。近年来，OKR已成为评估幼年斑马鱼视觉功能的重要工具，常用于筛选具有视觉障碍的基因突变体^1,2。尽管OKR已被广泛用于测定幼年斑马鱼的视觉功能，但在成年斑马鱼中的应用直到最近才被实现^7-10。Tappeiner et al. 近期发表的一篇论文使用了一种 commercially available 的视动系统（传统上用于小鼠的OptoMotry），证明成年斑马鱼的视觉敏锐度即使在不同角速度下也保持相对稳定，约为0.59 周/度（cpd）⁷。

尽管视动反应（OKR）在幼体斑马鱼研究中已被证明非常有用，但其他视觉行为检测方法也已用于成年斑马鱼，并取得了不同程度的成功。逃避反应实验表明，在强光条件下，两种色素突变体——白化（albino）和红宝石（ruby）斑马鱼的视觉反应均有所减弱^11,12。同样的逃避反应实验也成功鉴定了“夜盲d”（night blindness d）突变体，尽管鉴定时鱼龄已达2年¹³。然而，逃避反应实验并非没有缺陷。该方法难以精确归因于特定的视觉功能，仅能对视觉变化进行粗略估计——这意味着只有当视觉发生显著变化时，才能被检测到。

另一种用于鉴定具有视觉障碍的成年斑马鱼的方法是视动反应（optomotor response, OMR）¹¹。在该实验中，将斑马鱼置于一个中央带有不透明柱体的圆形水箱中，黑白条纹在水箱周围旋转，鱼会被测试是否朝条纹运动的方向游动。与逃避反应类似，OMR 也聚焦于成年斑马鱼的视觉-运动能力。然而，该方法已成功用于识别具有视觉障碍的斑马鱼，例如 lrp2/bugeye 突变体¹⁴。lrp2/bugeye 斑马鱼表现出大眼球症（buphthalmos）、眼内压升高、OMR 减弱以及进行性视网膜退化^14,15。

许多研究利用了成年斑马鱼的视觉运动能力，但这些方法通常具有主观性，无法进行定量分析。通过使用视动反应（OKR），可以更客观地研究成年斑马鱼的视觉敏锐度。我们自行构建了一套OKR装置，其设计参考了最初用于幼体研究的装置¹。在本研究中，我们证明了OKR可用于计算斑马鱼的单眼和双眼视觉敏锐度。

方案

所有动物饲养和实验均应获得批准，并依照各机构动物护理和使用委员会或其他法律法规所制定的指南进行。

1. 斑马鱼饲养

1. 在标准条件下饲养斑马鱼，温度为 28.5 °C，光照周期为 10 小时黑暗-14 小时光照¹⁶。
2. 成年斑马鱼的饲养密度约为每升水体 3 条鱼。

2. 视动反应（OKR）

1. 使用一个直径为 14.5 cm 的旋转鼓、一台带有可调光强度设置（300–8,000 lux）的立体显微镜和一台计算机搭建定制的 OKR 记录装置（图 1a）。
   1. 将摄像头连接至显微镜，以在相邻显示器上提供实时画面，并实现图像捕捉和录像。
   2. 通过连接至计算机的微控制器控制旋转鼓，以便选择不同的转速和旋转方向。
2. 用 0.016% 三卡因将鱼麻醉 2–3 分钟，然后将其放置在一个小型平台上，使眼睛和鳃悬于平台边缘之外。
3. 用一块薄海绵或毛巾覆盖鱼体，并在鱼身上方固定 2–3 块根据鱼体型裁剪的泡沫块，以保持鱼体固定。限制鱼尾部的活动被发现是实现有效固定且不造成鱼体损伤的关键因素，使用一块扁平泡沫效果最佳（图 1b）。
4. 将鱼置于一个圆柱形注水容器中，该容器可放入 OKR 记录装置的旋转鼓内。利用平台上的磁铁将鱼保持直立姿势，使眼睛距离鼓边缘约 7.3 cm。鱼应在数分钟内从麻醉状态恢复——恢复正常呼吸，并可观察到随机的眼球运动。
5. 将空间频率为 0.07 周/度（cpd）的基础光栅放入旋转鼓中，并通过计算机控制系统启动旋转和视频采集（本文采用 12 rpm 的转速，但 8–16 rpm 的转速应可获得类似结果）。
6. 当基础光栅成功诱发初始 OKR 后，短暂暂停旋转，更换为更细密的光栅（更高的空间频率）。
7. 重复此过程，直至无法再诱发 OKR。采用改进的阶梯法，对最后能诱发 OKR 的最小光栅进行复测，然后使用未能诱发反应的光栅再次测试，以确认 OKR 的消失。若最终确定的最小可检测光栅相对于首次反应消失时发生变化，可重复该过程以确认真实反应。
8. 通过在对侧眼附近的条纹上放置一块黑色塑料遮挡板，获取单眼视锐度测量值。重复上述步骤（步骤 2.6–2.7）。
9. 通过重新放置遮挡板并再次重复步骤 2.6–2.7，获取对侧眼的视锐度。
10. 在测试过程中，利用鱼缸下方的参考测量条记录每只眼睛与条纹之间的距离，以便在后续步骤中准确计算视锐度。

3. 计算视觉敏锐度

1. 通过计算每度视角的周期数（cpd）来获得视锐度：，其中 a 为透镜中心到光栅的距离，h 为观察到OKR反应时最小光栅一个周期的长度（图1c）。
2. 对于联合视锐度测量，采用左眼和右眼的 a 值的平均值。

结果

OKR 设备功能

如上所述并如图1所示，OKR装置运行稳定，所需维护极少。如步骤2.3中所述，固定尾部对于在记录过程中保持斑马鱼的稳定至关重要。若固定充分，斑马鱼可在OKR装置中维持较长时间的稳定状态。因此，在初始固定步骤中应格外小心，以便对每条斑马鱼获取更多的数据。

视力测量

正常成年斑马鱼可轻易诱发出双眼视动反应。通过遵循上述步骤，可以测定多种年龄斑马鱼的视觉敏锐度（图2）。我们记录到的最佳双眼空间视觉敏锐度为0.74 cpd。如图2所示，双眼视觉敏锐度总体随年龄增长而提高（n=46；p = 0.002，使用SPSS v14进行方差分析），但在约12月龄后趋于稳定。当我们比较5月龄野生型斑马鱼与同龄的lrp2/bugeye突变型斑马鱼的视觉敏锐度时，发现lrp2/bugeye斑马鱼的视觉敏锐度显著降低（p < 0.001；野生型：0.49±0.05 cpd；n=8；lrp2/bugeye：0.35±0.06 cpd；n=10；使用Excel进行Student's T检验）。

通过遮盖右眼可测定左眼的视力，反之亦然。与双眼视力相比，可观察到类似于人类视觉的双眼视锐度叠加效应¹⁷ （图3）。双眼视力通常比单独测量的右眼（OD）或左眼（OS）视力高5-10%。对于某些个体鱼类，差异可达25%的提升。

图1. OKR记录。A) OKR装置由一个直径为14.5 cm的旋转鼓和一台具有可调光强设置（300–8,000 lux）的显微镜组成。摄像头将实时画面传输至相邻的显示器上。旋转鼓可在顺时针和逆时针方向以多种速度旋转，并可根据需要插入或移除不同的空间频率光栅。B) 将斑马鱼固定后置于旋转鼓中心位置。C) 每度周期数（cpd）通过公式 cpd= 计算得出。点击此处查看高分辨率图像。

图 2. 视力随年龄的变化。该图显示了在5至15个月龄期间测得的独立视力值。在发育的第一年内，视力总体呈上升趋势，到15个月龄时略有下降（使用SPSS v14进行ANOVA分析，p = 0.002）。每个数据点可能代表一条或多条鱼。视力以周期/度（cpd）为单位进行测量。（n = 46，总计；5个月龄8条；6个月龄4条；8个月龄7条；9个月龄6条；10个月龄11条；11个月龄2条；12个月龄2条；15个月龄6条）。点击此处查看高分辨率图像。

图3. 双眼视觉敏锐度叠加效应。双眼（OU）视觉敏锐度通常高于右眼（OD）或左眼（OS）的视觉敏锐度。在本组受试者中，左眼（OS）的视觉敏锐度显著较低。（* p=0.006，N=8）点击此处查看高分辨率图像。

讨论

有时鱼可能会逃入水箱中。固定鱼尾至关重要。此外，我们发现，在鱼体上覆盖一层薄海绵或毛巾，对于长时间保持鱼体悬浮也极为有效。采用此方法，我们能够在不伤害鱼的情况下使其保持静止超过30分钟。这一时长已完全足以完成双眼及单眼视力的检测。

光栅的呈现可以通过物理旋转鼓实现，也可通过数字显示来完成，具体方法如本文及其他文献所述^18-22。这两种方式各有特定的优缺点。我们选择物理旋转方式，主要是出于成本和技术规格的考虑。除计算机和成像设备外，本文所述的OKR装置的构建成本约为150美元。

视动反应（OKR）是一种用于测定成年斑马鱼视觉敏锐度的客观方法。尽管以往实验中已使用过多种其他视觉运动检测方法，甚至已在成年斑马鱼眼睛上成功实施视网膜电图检测，但后者尚未被广泛采用。而成年斑马鱼的OKR为大量新的实验条件提供了可能²²。本研究已证明OKR在测量视觉敏锐度随时间变化、识别眼病模型中的视觉敏锐度差异以及测定单眼视觉敏锐度方面的实用性。

有趣的是，成年斑马鱼的视力与人类视力（20/20）相比，大约为20/1,000（当0.60 cpd转换为-0.3 logMAR时）。尽管这看似较差，但斑马鱼的眼睛非常适应其生存环境。尽管存在穿过6.5厘米水层、几毫米聚碳酸酯材料以及另外1厘米空气所带来的视觉挑战，这些鱼类的表现仍然相当出色！我们发现，成年斑马鱼的视锐度约为根据其感光细胞间距所预测值的70%²³。相比之下，人类最佳视觉表现约为20/12，接近预测值20/10的80%，由此可见，利用视动反应（OKR）技术测量成年斑马鱼视觉能力的结果令人印象深刻^24,25。

测量单眼独立视力的技术可用于开展单眼接受处理而另一只眼作为对照的研究。此外，对于存在双眼发育不对称的鱼类（例如lrp2/bugeye突变体）或发生白内障的鱼类，该技术可实现更精确的监测。需要注意的是，必须准确测量眼睛到条纹图案之间的距离，并完全遮蔽非测试眼的整个视野。该技术将有助于实现对斑马鱼视觉功能更精确、更特异的评估。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超低照度黑白视频监控摄像头	Super Circuits	PC164CEX-2	可使用任何低照度摄像头
Arduino Duemilanove 微控制器	Adafruit Industries		Arduino Uno 也兼容该速度控制软件。
三卡因甲磺酸盐（Tricaine Methanesulfonate）	VWR	101107-950