高通量海胆合子显微注射

摘要

显微注射是一种常用技术，用于将DNA构建体、mRNA、吗啉代反义寡核苷酸或其他处理物质导入多种物种的卵细胞、胚胎和细胞中。

摘要

向细胞和胚胎中进行显微注射是一种常用的技术，用于研究多种生物学过程。该方法将少量处理溶液装入显微注射针中，通过物理方式直接注射到固定化的单个细胞或胚胎内。尽管该操作需要经过初步培训才能实现高通量递送，但显微注射具有递送效率高、重复性好等优点，可稳定地将多种处理溶液（包括复杂的样品混合物）递送至细胞、卵子或胚胎中。显微注射的应用包括递送DNA构建体、mRNA、重组蛋白，以及实现基因功能获得或功能缺失的试剂。在注射溶液中加入荧光或比色染料，可即时可视化递送效果，并作为准确归一化递送溶液体积的工具。本方法可在10至15分钟内完成100至400个海胆合子的显微注射。

引言

高效且可重复的处理递送是研究人员面临的主要方法学挑战之一。目前已建立多种方法，用于将处理溶液瞬时递送至卵子、胚胎和细胞中。这些方法包括电穿孔（利用短暂的电脉冲在细胞膜上形成瞬时孔隙）^1,2、脂质体转染（通过含处理剂的脂质体与细胞膜融合实现递送）¹、微粒轰击法¹（将DNA沉淀于微米级金属颗粒表面，随后以高速穿透细胞），以及转导（利用病毒作为外源基因的递送载体）。目前，显微注射是唯一能够以100%效率递送任意溶液且所需试剂最少的方法。此外，单次注射溶液可包含多种处理剂组成的复杂混合物。该技术已成功应用于多种物种的卵子和胚胎显微注射，如海胆^3,4、斑马鱼⁵、小鼠⁶、青蛙⁷和牛⁸，以及组织培养中的单个细胞⁹。在发育后期阶段对单个卵裂球进行注射也已有报道^10-12。

目前的显微注射方法基于Hiramoto最初描述的压力注射法¹⁰，但该技术已取得显著优化进展。其他文献中已详细描述了优秀的显微注射技术¹¹，本文则介绍一种目前用于显微注射紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）新受精卵的具体方法。一个多世纪以来，海胆一直是一种重要的实验模型^15,16。在进化上，海胆与脊索动物（包括人类）关系密切，对其基因组的分析表明，它们拥有与人类相同的主要基因家族¹⁷。海胆可产生大量同步发育且透明的胚胎，易于进行实验操作。利用海胆作为模式生物，科研界已在受精过程^18-21、细胞生物学过程^22-24以及基因调控网络（GRNs）^25-28的研究方面取得了重要进展。

对海胆合子进行显微注射需要多个步骤。首先，在注射前需将卵细胞固定（如下所述）。显微注射培养皿经鱼精蛋白硫酸盐（protamine sulfate, PS）包被处理，形成带正电荷的表面，以便带负电荷的卵细胞能够附着³。通过将卵细胞在酸性海水（pH 5.15）中孵育10分钟以去除胶状层，随后用天然海水或人工海水（pH 8.0）清洗两次。去胶后的卵细胞需在含1 mM 3-氨基三唑（3-aminotriazole, 3-AT）的PS包被培养皿中小心排列成一条直线，3-AT的作用是抑制因受精而从卵细胞皮层颗粒分泌的卵过氧化物酶活性²⁹。此步骤对于防止受精膜硬化、便于显微注射针头穿入至关重要。作为1 mM 3-AT的替代方案，也可使用10 mM对氨基苯甲酸（paraminobenzoic acid, PABA）。将注射溶液使用专用的微量上样吸头装入显微注射针，并安装至连接于显微操作仪和压力装置的针夹上（图1）。每根注射针可在不同实验日多次用于对多个合子进行显微注射。显微注射操作可持续进行10至15分钟，直至合子开始硬化。随后用海水清洗合子，并在15 °C条件下培养。当胚胎发育至孵化囊胚阶段时，会释放孵化酶，降解受精膜的组分³⁰，从而自然脱离PS包被的培养皿。如有需要，可通过口吸管或巴斯德吸管向胚胎轻轻吹入海水，温和地将胚胎从培养皿上分离。该方法可在单个培养皿上高效且可靠地完成对100至400个新受精卵的显微注射，为后续分析提供了高通量的技术手段。

方案

1. 鱼精蛋白硫酸盐（PS）包被培养皿的制备

1. 将0.5 g硫酸鱼精蛋白（PS）加入50 ml去离子蒸馏水（ddH₂O）中，配制1%的硫酸鱼精蛋白溶液。₂在50 ml锥形管中加入O）。在室温下使用台式摇床高速振荡1-2小时，确保PS完全溶解。该溶液可在4 °C保存至少3个月（每次使用前需确保凝胶状沉淀物完全溶解）。³.
2. 取一套直径60 mm、高度15 mm的聚苯乙烯培养皿，将皿盖和皿底分别平放在实验台上。
3. 在每个培养皿中加入1% PS溶液（皿底和皿盖均可使用），用量以覆盖表面为宜，静置至少2分钟。剩余的PS溶液在4 °C保存条件下可在3个月内重复使用多次。
4. 将经 PS 处理的培养皿放入盛有蒸馏水（dH₂O）的烧杯中₂O）。将烧杯置于流动的 dH₂O 下冲洗₂至少静置 10 分钟。
5. PS包被的培养皿可立即使用，或晾干后储存。应加盖以防止灰尘积聚。可在室温下保存1个月。³.

2. 获取海胆配子并将卵固定在PS包被的培养皿上以进行显微注射

1. 通过轻轻摇晃海胆或向其体腔内注射不超过 1 ml 的 0.5 % KCl 溶液，诱导平滑肌收缩以排放配子³ （图 2）。
2. 若动物为雄性（表现为白色精子），将精子直接从个体表面干燥收集至 1.5 ml 离心管中。干燥的精子可在 4 °C 下保存一周，且生物学功能无明显损失。
3. 若动物为雌性（由于卵黄含量呈现黄色），将生殖孔浸入盛满海水的烧杯中以收集其配子。卵子将从生殖孔释放，并依靠重力沉降到底部。
4. 使用 80 μm 尼龙滤网过滤卵子，去除如动物棘刺等杂质。若在排卵后 5–7 小时内使用卵子，可获得最佳实验结果。
5. 去除卵子胶状外膜：
   1. 为约 1 ml 卵子准备 100 ml 酸化海水。使用 0.5 M 柠檬酸将海水 pH 从 8.0 调节至 5.1–5.2。pH 过低会降低受精率，而 pH 过高则会导致卵子无法附着于聚苯乙烯（PS）包被的培养板上。
   2. 将卵子（不超过 1 ml）加入酸化海水中，并在冰上静置 10 分钟使其沉降。或者，在处理过程中可轻轻旋转混匀卵子以促进胶膜去除。采用此方法可在 3–4 分钟内有效去除 S. purpuratus 卵子的胶膜。
   3. 小心倾去酸化海水，加入新鲜海水，并再次将卵子置于冰上静置沉降。去胶膜后的卵子可在冰上保存长达 6 小时，且不会影响后续受精。

3. 排列卵子

1. 配制 3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT，分子量 = 84.08）的 1 M 储存液：将 0.84 g 3-AT 溶解于 10 ml 去离子水（ddH₂O）中。该溶液可在 4 °C 下保存最多 6 个月。
2. 通过将 50 μl 的 1 M 储存液加入 50 ml 预冷的海水，配制 1 mM 的 3-AT 工作液。将溶液置于冰上保存。
3. 准备口吸管（图 3），用于轻柔操作卵子：
   1. 使用玻璃微量移液管（100 x 外径 1.09 mm）手工拉制移液管尖端。用双手握住移液管，在明火上加热。当玻璃开始熔化时，小心地朝相反方向拉伸移液管两端。
   2. 将一根拉好的移液管连接至一段塑料管（内径 1.14 mm），并用 Parafilm 密封。塑料管长度应约为 50–70 cm。
   3. 在与玻璃管相对的塑料管末端插入一个无菌过滤的 P20 或 P200 吸头，作为口含部分。
   4. 用剪刀剪切玻璃微量移液管的末端，以调节尖端直径。最佳直径略大于卵子直径（80 μm）。
4. 向每个聚苯乙烯（PS）包被的培养皿（底部或盖子）中加入 4 ml 的 1 mM 3-AT 海水溶液。
5. 取出口吸管，将 P20/P200 吸头放入口中，并用牙齿固定。吸取卵子前，先吸取少量海水。在吸取卵子之前保持一段液柱，有助于最大程度地控制口吸管操作技术。
6. 将微量移液管尖端靠近卵子，轻柔地吸取数百个卵子进入移液管中，并将卵子限制在玻璃微量移液管内。
7. 在培养皿中，沿直线排列去胶膜卵子：一边缓慢吹出卵子，一边沿直线移动移液管尖端。应在注射前立即排列卵子，因为长时间暴露于 3-AT 海水中可能导致受精问题³。此外，阳离子粘附剂（如 PS）可能对卵子具有毒性，尤其在已去除受精膜的情况下，不建议长时间将胚胎暴露于此类试剂中。
8. 使用玻璃移液管在排列卵子的附近划一道划痕。该划痕可用于折断注射针尖，以按需调节溶液流出量。或者，也可在向培养皿中加入 3-AT 海水前预先制作划痕。

4. 海胆受精卵的显微注射

1. 打开显微注射工作站。此处我们描述的是使用 FemtoJet 注射系统。
2. 使用拉针仪制备注射毛细管。一根理想的针尖示例如图4所示。注意：对于 RNA 注射，注射毛细管应预先处理以避免 RNase 污染³¹：
   1. 将注射毛细管放入 50 ml 锥形管中，并加入 50 ml 过滤的甲醇/盐酸混合液（9:1）。充分震荡后，静置过夜，但不超过 10 小时。
   2. 倒去甲醇/盐酸溶液，并用过滤的甲醇在同一管中冲洗毛细管两次。
   3. 尽可能排尽甲醇，并将毛细管在真空冷冻干燥机中干燥过夜，以确保甲醇完全去除。
3. 小心地将毛细管安装到上样夹持器上，并使用微量移液吸头加入<0.5 μl 样品溶液。样品溶液通常含有 20% 甘油，具体比例取决于所注射的材料³。
4. 将装有成列卵子的培养皿放置在显微镜载物台上（通过目镜观察时，卵子应呈垂直排列），并对焦于卵子。
5. 小心地将已上样的毛细管安装至显微注射夹持器上，并调整针的位置，使针尖在视野中央清晰对焦。
6. 按下按钮施加最大压力以清洗针头，溶液应从针尖流出。必要时调节压力：注射压力应在 90–360 hPa 范围内，补偿压力约为注射压力的 1/3。
7. 通过向未受精卵中注射来调节溶液流速。使用操纵杆显微操作器，将注射针尖引导至未受精卵。为便于针头进入，可用螺丝刀等硬物轻轻敲击载物台，使针尖产生轻微颤动。应在卵内观察到注射液团的形成（图5）。
8. 若未观察到注射液团，可将针尖略为抬高至卵子上方，找到培养皿上的划痕标记，并将其调整至视野中央。轻触针尖至划痕处，以打断注射针尖。调节注射压力和补偿压力，确保注射液团直径不超过卵子直径的 1/5（1–2 pm）。
9. 完成注射液团校准后，通过加入稀释精子（1:1,000）或 1–2 μl 精子进行卵子受精。轻轻混匀，避免打乱成列的卵子。
10. 一旦观察到受精膜形成，立即开始注射（图5）。使用载物台控制器沿卵列移动，利用操纵杆显微操作器控制针头穿刺尽可能多的受精卵进行注射。
11. 10–15 分钟后，新受精的卵子将变硬，无法继续注射。从载物台上取下培养皿，并使用塑料巴氏吸管在 3-AT 海水中小心吸除精子。
12. 切勿让受精卵干燥。迅速加入新鲜预冷的海水以覆盖培养皿。将胚胎在 15 °C 下孵育。

结果

GFP 和 mCherry 报告基因载体 体外 转录后显微注射到新受精的卵中。胚胎在 15 °C 24小时（直至囊胚阶段），并使用Zeiss Observer Z1显微镜进行成像。报告基因构建体的注射未导致任何发育缺陷。图6）。为了定量分析荧光信号，以低倍率（100X）进行图像采集，以最大程度地捕获荧光像素（图6D-F). 使用 Axiovision 4.8.2.0 对荧光信号进行定量分析。在 100–200 个囊胚的群体中，荧光信号强度的标准误差未超过 1.5%（数据未显示）。

讨论

显微注射是一种强大的技术，可用于将多种物质（如DNA、mRNA、重组蛋白、基因功能缺失和功能获得试剂、染料及其组合）递送至多种生物的卵细胞、胚胎和细胞中^1-7。然而，在设计显微注射实验时，应考虑若干重要因素。

必须充分考虑所递送处理物的溶解度以及注射体积。如果显微注射溶液容易形成即使轻微的沉淀，也会导致显微注射针头堵塞。通常建议在将溶液装入针头前，对其进行超过15分钟的离心处理，以确保去除溶液中任何可能的沉淀物³。另一种方法是将溶液通过Millipore离心柱过滤。如果无法避免堵塞，可通过再次轻轻折断针尖来尝试疏通针头，但若针尖过宽，则难以控制溶液的流出量。注射过量溶液可能对胚胎产生毒性；此外，过宽的针尖会导致注入各个胚胎的溶液体积差异增大。向新受精卵中注射的体积也必须进行适当调整。可通过在不同拉制参数下制备针头，并将溶液注入油中形成液滴，从而校准注射体积。该方法可通过测量液滴的直径（进而计算体积）实现定量³²。我们发现，在新受精卵中注射的溶液量不应超过合子直径的1/5，如图5所示。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃巴斯德吸管	VWR	14673-043
倒置显微镜  Axiovert 40 °C	Zeiss	4109431007990000	注射显微镜
微量加样器吸头（Microloader tips）	Eppendorf	5242 956.003	用于加载注射溶液
尼龙滤网 80 μm	Amazon.com	03-80-37	过滤卵以去除碎片
P20 或 P200 气溶胶阻隔移液器吸头	Fisher Scientific	02707432 或 02707430	口吸移液装置的组成部分
Parafilm 封口膜	Fisher Scientific	13 374 12	口吸移液装置的组成部分
聚乙烯管	Intramedic	PE-160	口吸移液装置的组成部分
硫酸鱼精蛋白	MP Biomedicals, LLC	194729	将去胶膜的卵固定在注射培养皿上
海胆 S. purpuratus	Pt. Loma 海洋无脊椎动物实验室	N/A
海水	任意宠物商店	Instant Ocean
无菌 60 mm × 15 mm 聚苯乙烯培养皿	Fisher Scientific	0875713A	注射用培养皿
三轴粗调微操作仪 MMN-1	Narishige	9124	操控注射针
三轴操纵杆式油压精细微操作仪 MMO-202ND	Narishige	9212	操控注射针
转移吸管	Fisher Scientific	13-711-9AM
垂直  玻璃微电极拉制仪	Narishige	PC-10	拉制注射针