可视化单细胞伤口愈合过程中喇叭虫（Stentor coeruleus）的胞质流动

摘要

大型纤毛虫Stentor coeruleus是研究单细胞再生与伤口愈合的经典体系。 通过同时在低倍和高倍镜下对Stentor细胞进行成像，可测量损伤前、损伤中及损伤后的胞质流动。

摘要

尽管伤口愈合通常是在组织整体水平上进行研究的，但在许多情况下，单个细胞自身也能够实现伤口修复，在细胞内容物泄漏之前重新修复破裂的细胞膜。Stentor coeruleus 是一种巨型单细胞生物，其细胞大小可超过一毫米，长期以来被用作研究单细胞伤口愈合的经典模式生物。Stentor 细胞即使被切成两半也不会丧失活力，甚至可以被切割后重新嫁接。然而，这种对切割的极高耐受性引发了一个问题：为何细胞质不会从切口处直接流出？本文介绍了一种在切割 Stentor 细胞的同时，以高空间和时间分辨率成像切口附近细胞质运动的方法。本方法的关键在于采用一种“双层”（"double decker"）显微镜配置，即在解剖显微镜下进行手术操作，该显微镜聚焦于一个样品腔，而同一腔体同时通过倒置显微镜配合高数值孔径（NA）镜头从下方进行高分辨率观察。该装置可在精确控制手术过程的同时，实现对细胞质动态的高分辨率追踪。

引言

再生与伤口愈合是重要的生物学过程，其机制仍是当前活跃的研究领域。事实上，愈合伤口和再生受损部分的能力是生命体区别于无生命物体的特征之一。通常认为，再生过程由干细胞分化为重建受损或断裂的生物体部分所需的多种细胞类型所介导，而伤口愈合则表现为新细胞侵入伤口以重建完整的上皮层。因此，这两个过程似乎均由单个细胞的群体活动所介导，因而属于典型的多细胞过程。因此，在某些情况下，单个细胞能够修复伤口并再生缺失组分，这一现象可能令人意外¹。单个细胞内的伤口愈合可涉及多种途径，包括伤口周围肌动蛋白-肌球蛋白束的收缩作用以及通过胞吐囊泡的快速融合实现膜的修补^1-3。尽管许多细胞类型均具备一定程度的伤口愈合能力^4-6，但最显著的例子或许是巨型纤毛虫Stentor coeruelus⁷，如图1所示。Stentor单个细胞长达1 mm，表面覆盖成排的纤毛。Stentor细胞呈圆锥形，一端具有由数千根纤毛组成的口器结构，另一端则为狭窄的固着结构。Stentor曾是研究再生的经典模式生物，因为其细胞的任何部分被切除后均能实现再生⁷。例如，在一系列经典实验中，Thomas Hunt Morgan⁸证明，将一个Stentor细胞切成两半后，每一半均能在数小时内再生为比例正常的完整细胞⁸。然而，Stentor中负责再生的分子通路至今完全未知。

能力 喇叭虫 细胞作为再生模型系统依赖于这些细胞在被切割后能够自我修复的惊人能力。为什么细胞质在被切割后不会 喇叭虫 细胞被切割时会发生泄漏吗？伤口愈合并非由细胞皮层立即收缩引起，因为可以将两个 喇叭虫 细胞，切割它们，然后以不同的构型将两个被切割的细胞连接在一起⁷在进行此类移植实验时，两个细胞的细胞质必须保持暴露状态，因为当细胞被推到一起时，细胞质会发生融合。某种情况下，细胞质暴露于周围培养基的程度足以允许移植操作，但又不会从细胞中流出。那么，细胞质是否 喇叭虫 具有足够的弹性，以至于即使细胞膜上出现较大的孔洞，细胞质也无法流出？细胞是否会通过增加伤口周围细胞质的黏度来防止其外流？细胞质是一种高度复杂的活性物质^9-11，以及 喇叭虫 伤口愈合反应为研究单细胞伤口愈合过程中的细胞质流动和力学特性提供了一个独特的机会。然而，使用手术方法在 喇叭虫 提出了一个技术难题。为了使用玻璃针这种传统手术方法切割一个1毫米长的细胞，必须在低倍率和长工作距离的条件下进行操作。在这样的成像条件下，无法追踪细胞质的流动情况，只能判断细胞质是否保留在细胞内。而我们真正希望探究的问题是：在切割和愈合过程中，细胞质的运动性和黏度可能发生怎样的变化。这需要高分辨率成像。本文介绍了一种对Tartar切割方案的改进方法 喇叭虫⁷ 可在较低放大倍数的光学条件下进行切割，以便观察整个细胞 同时以高分辨率观察细胞质流动，使该系统可作为研究单细胞伤口愈合机制的平台。

方案

1. 细胞培养与收集

1. 获取 喇叭虫 coeruleus 来自自然池塘的细胞，如 Tartar 所述⁷ 或从商业供应商处获取（参见试剂）。
2. 在20 ºC避光条件下培养以维持培养物 喇叭虫 培养基（MSM），其配方改良自 Tartar 所描述的方法⁷ 和 De Terra¹² 含 0.75 mM Na₂CO₃，0.15 mM KHCO₃₃，0.15 mM NaNO₃，0.15 mM KH₂PO₄，0.15 mM MgSO₄₄，0.5 mM CaCl₂，以及 1.47 mM NaCl。
3. 在MSM培养基中加入活体猎物作为碳源。培养菌液。 莱茵衣藻 采用标准培养方法的TAP培养基¹³喂食前，清洗 衣藻 MSM 中的细胞。添加 300 ml 培养基 喇叭虫 培养物约 3 × 10⁷ 莱茵衣藻 细胞每2-3次 周
4. 收集 喇叭虫 使用移液管将细胞用于手术。 喇叭虫 倾向于贴附在培养皿底部和侧壁，因此收集细胞时，需通过移液管尖吹入气泡，轻轻搅动培养液，直至细胞开始脱落并自由游动。
5. 使用带有宽口吸头的移液器捕获游动的细胞，以避免对细胞造成剪切损伤。
6. 用新鲜的MSM洗涤收集的细胞。

2. 显微外科手术器械的准备

1. 将两根玻璃搅拌棒置于本生灯或其他火焰上加热，直至末端开始熔化。
2. 将两根搅拌棒的熔融端相互接触，使熔融玻璃融合在一起。
3. 当两根搅拌棒之间形成一小滴熔融玻璃后，将其移离火焰，冷却1-2秒，然后迅速拉开，使其干净断裂。理想情况下，玻璃在冷却过程中会拉伸出细丝并平滑断裂，形成一根长约1-2 cm、末端具精细尖端的玻璃针（图2）。
4. 若所得玻璃针不理想，可将尖端折断并弃入玻璃废料容器中，搅拌棒可重复使用。

3. 显微手术与观察用细胞的制备（常规手术）

1. 使用涂有凡士林的方形橡胶印章在玻璃盖玻片上压出一个方形的凡士林围栏，制备成方形的凡士林腔室。
2. 向该方形凡士林腔室内加入含2%甲基纤维素的MSM培养基。
3. 将盖玻片放入塑料适配器中，使盖玻片可安装在配有标准载物片夹持器的显微镜上（图3）。
4. 将步骤1.6中洗涤后的细胞加入含甲基纤维素的MSM中，以减缓喇叭虫（Stentor）细胞的运动，使其在手术过程中保持固定位置。
5. 在甲基纤维素中调整细胞分布，使其均匀间隔，并推动细胞靠近盖玻片表面，以便成像时处于焦平面内。

4. 活体伤口愈合的高分辨率成像 喇叭虫

为了在低倍镜下对 Stentor 细胞进行手术切割的同时，以高分辨率对其进行成像，可构建一个"双层"显微镜系统，将解剖显微镜连接至倒置显微镜的目镜镜筒上，使解剖显微镜聚焦于载玻片上表面，而倒置显微镜则从载玻片下方进行聚焦。

1. 将载玻片置于倒置显微镜上（可使用蔡司Axiovert 200M或奥林巴斯IX80）。
2. 从支架上取下体视显微镜主体，确定其在倒置显微镜目镜上方的合适位置，以便通过体视显微镜以低倍率观察载玻片。
3. 改造一个纸板箱，使其厚度等于倒置显微镜目镜筒与体视显微镜之间的所需间距，然后使用实验室胶带将其固定在倒置显微镜上，实验结束后可轻松移除。根据倒置显微镜目镜头的具体结构和体视显微镜的尺寸调整纸板箱的厚度，确保样品位于视野范围内，且在安装后无需移动体视显微镜。
4. 将体视显微镜紧贴纸板箱并移动至载玻片成像清晰，再用实验室胶带将其固定在纸板箱上。最终装置如图4所示。
5. 使用微分干涉差（DIC）光学系统和20倍物镜通过倒置显微镜观察细胞。采用长工作距离DIC聚光镜，以便从上方留出足够空间进行显微手术操作。
6. 使用512 x 512 CCD相机以每秒2帧的速率采集图像 。
7. 在开始切割细胞前即启动图像采集，以记录初始的胞质流动模式，并观察损伤及伤口愈合过程的各个阶段。
8. 当细胞恢复正常的形态和/或活跃运动能力时停止采集，以便可视化并测量整个再生过程中的胞质运动。

5. 分析伤口愈合过程中的胞质流动

使用粒子图像测速法（PIV）测量胞质流动。该技术在流体动力学研究中已常规应用，能够在流体中不存在可单独追踪的颗粒时生成流动场。PIV 已被用于通过透射光显微镜成像细胞质中可见的亚细胞囊泡及其他结构，进而测量胞质流动¹⁴。

1. 从网站 http://pivlab.blogspot.com/ 下载用于粒子图像测速（PIV）的 MATLAB 软件包 PIVLab。
2. 在 MATLAB 中的 PIV 程序内加载每个视频序列的 tiff 图像栈。
3. 为每个图像栈手动生成掩膜，以遮蔽 Stentor 体外原始数据中的区域。
4. 将 PIVLab 设置为使用快速傅里叶变换模式，并将像素分块大小设为 64 × 64 像素，从而将每帧中的像素合并为更大的方形像素块。
5. 运行 PIVLab，计算每帧中像素与下一帧中邻近像素之间的互相关，从而得到以每个像素块为中心、时间分辨率为原始数据水平的时变流速矢量。
6. 对生成的矢量场输出结果进行时间平均，以生成流线图，用于比较切割前及伤口愈合过程中 Stentor 的数据，并计算流速直方图（用于研究流动强度）以及特定像素处流速随时间的变化（用于研究流动波动）。
7. 对于被切成两半且胞质明显泄漏至周围缓冲液中的 Stentor 图像序列，通过将平均流速乘以胞外胞质泡基部的横截面积，计算胞质回流至细胞主体的总通量。

结果

使用上述描述的实验方案，发现细胞质中的 喇叭虫 在切割前后均表现出显著的动态性。 视频 1 显示了未切割细胞中存在的大量胞质流动。尽管我们最初的预期是 喇叭虫其在切割后仍能存活的能力可能涉及细胞质的硬化或凝胶化，事实上当 喇叭虫 细胞被剧烈切割以致细胞质被拉出细胞外，但细胞质仍保持高度动态，并能以高度定向的方式流回细胞内（视频 2).

除了揭示伤口愈合过程中此前未被察觉的细胞质运动程度外，该检测方法的高分辨率成像还可用于通过粒子图像测速技术定量分析流动速率。实现此类测量的能力将有助于严格检验化学抑制剂的作用效果。

图1. 活体Stentor细胞的形态。 活体Stentor细胞的暗视野图像，该细胞已按步骤1.3所述喂食Chlamydomonas，图中可见食物泡内的绿色物质。细胞摄食的口器可见为图像顶部的一圈纤毛。 点击此处查看大图。

图 2. 手术用玻璃针的制备。 （A）玻璃针由实心玻璃棒末端拉制而成。 （B）针尖的高倍放大图像，显示手术所需的长度和锐利程度。 点击此处查看高清大图。

图 3. 用于显微手术的定制盖玻片架。 为了在允许开放手术操作的同时实现最佳成像条件，细胞被接种在盖玻片上，而非较厚的载玻片上。为了使盖玻片能够适配显微镜载物台，可使用3D打印机制造一个塑料支架。该支架的外形尺寸与标准显微镜载玻片相同，其中央凹槽的尺寸则与盖玻片匹配。一个角落处的孔洞设计便于将盖玻片从支架中弹出。 点击此处查看高清图像。

图4. 双层显微镜配置。 将体视显微镜的镜筒安装在倒置显微镜目镜筒的上方。实验结束后，利用实验室胶带可快速组装或拆卸该装置。 点击此处查看大图。

视频 1. 活体 Stentor 细胞中观察到的胞质流动示例。 使用10倍物镜配合暗视野光学系统成像，成像速率为每秒2帧。

视频 2。使用玻璃针切割并破坏Stentor细胞时的成像过程。在切割过程中，大量细胞质被从细胞主体中拉出，但这些细胞质迅速回流至细胞内。

讨论

该方法最重要的应用将是利用它来确定在喇叭虫（Stentor）伤口愈合过程中调控胞质流动的分子通路。目前已有大量化学抑制剂可用于靶向运动蛋白以及细胞骨架的组分，钙信号通路的抑制剂也可能成为候选药物。此外，研究去除或减少含有蓝色色素喇叭虫素（Stentorin）的色素颗粒（即胞吐颗粒）也将具有重要意义，因为这些颗粒在细胞受到应激时会被释放，可进一步探究Stentorin的胞吐释放如何影响邻近胞质的流动。色素颗粒可通过简单的漂白处理¹⁵进行耗竭，该处理可在切割前立即进行。由于细胞需要逐个进行切割和成像，目前似乎没有简单的方法可并行开展伤口愈合实验。因此，使用一台显微镜，操作和测量细胞的速度大约为每0.5小时1个细胞，在单日工作中即可获得足够数量的数据点，以判断某种化合物是否对该过程产生具有统计学意义的影响。尽管该方法在任何意义上都不属于高通量方法，但针对少数精心选定的靶向通路，筛选一组特定候选化合物仍是完全可行的。

当前方法的一个主要局限在于组装双层显微镜的方式相对粗糙。假设用于成像的倒置显微镜是一台通用仪器，其他研究人员还需将其用于其他用途，那么装置能否方便地拆卸和重新组装便成为一个重要的考虑因素。尽管目前使用实验室胶带的方法确实快速且易于拆卸，但在每次组装时都需要用户仔细进行对准。因此，一个重要的改进方案是设计一个可定制的、可拆卸的支架，带有用于倒置显微镜目镜头和解剖显微镜机身的插槽。利用现代3D打印技术，该支架应易于制造。

该方法的第二个局限性在于依赖微分干涉差（DIC）成像来观察细胞内细胞器作为流动的标记物。由于目前尚不清楚显微镜下观察到的这些细胞器的具体身份，因此无法获知它们的大小或其与其他细胞组分之间可能存在的相互作用。因此，引入外源性示踪剂（如荧光微珠）并利用其追踪流动可能更具优势。然而，这种方法需要在实验前额外增加一步微注射操作，从而进一步延长实验耗时。

最后一个关键局限是数据采集依赖于单一图像平面。本实验方法的主要意义在于，它不仅能够判断伤口是否愈合，还能获得流动模式的详细分析结果。在这方面，将成像技术扩展至三维成像显得尤为重要。当前方法仅对单一焦平面进行成像，因此在进行PIV分析时，所得结果仅为完整三维流场的一个切片。这一信息虽具价值，但并不完整。若能在每个时间点获取三维图像，则有望获得完整的三维流场数据。这对于精确观察细胞质在伤口周围区域的运动方式尤为关键。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Stentor coeruleus 活体培养	卡罗来纳生物公司	131598
甲基纤维素，1,500 cP	Sigma	M0387
设备：
材料名称	公司	目录编号
5 英寸长软质玻璃搅拌棒	Fisher Scientific	11-380A
培养皿 4.5 英寸，250 毫升 玻璃	卡罗来纳生物公司	741004
IX81 倒置显微镜	奥林巴斯
Axiovert 200M 倒置显微镜	Zeiss
Stemi 2000 体视显微镜	Zeiss
Evolve 512 x 512 EMCCD 相机	Photometrics
Plan Apo 20倍物镜	Olympus	UPLSAPO