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使用十字型荧光探针定性鉴定羧酸、硼酸和胺

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DOI：

10.3791/50858

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2013年8月19日

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1Organisch-Chemisches Institut, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, 2Department of Chemistry, University of Houston

本文内容

摘要

基于1,4-二苯乙烯-2,5-双(芳基乙炔基)苯和苯并双噁唑核的交叉共轭十字形荧光分子可用于定性识别多种路易斯酸性和路易斯碱性分析物。该方法依赖于加入分析物后十字形分子发射颜色的变化。结构上相近的物种可由此相互区分。

摘要

分子十字结构（cruciform）是一类X形体系，其中两个共轭轴在中心核心处相交。若将这类分子的一个轴用给电子基团取代，另一个轴用吸电子基团取代，则其HOMO主要定域于富电子轴上，而LUMO则定域于缺电子轴上。这种前线分子轨道（FMOs）在空间上的分离特性对于其作为传感器的应用至关重要，因为分析物与十字结构结合后总会改变其HOMO-LUMO能隙以及相关的光学性质。基于这一原理，Bunz和Miljanić课题组分别开发了1,4-二苯乙烯基-2,5-双（芳基乙炔基）苯和苯并二噁唑十字结构，它们可作为金属离子、羧酸、硼酸、酚类、胺类及阴离子的荧光传感器。当这些十字结构与分析物混合时，所观察到的发射颜色对分析物结构的细微差异极为敏感，并且由于十字结构具有电荷分离的激发态，还对观测发射时所用的溶剂敏感。在多个分析物类别中，结构上密切相关物种可实现定性区分：（a）羧酸；（b）硼酸；以及（c）金属离子。通过使用由苯并二噁唑十字结构与硼酸添加剂组成的混合传感体系，我们还能够区分结构相似的：（d）小分子有机和无机阴离子；（e）胺类；以及（f）酚类。用于这种定性区分的方法极为简便。将十字结构溶解于数种市售溶剂中，配制成稀溶液（通常为10-6 M），置于紫外/可见光样品瓶中。然后直接加入固体分析物或其浓溶液。荧光变化几乎即时发生，可在暗室中使用半专业数码相机通过标准数字摄影记录。经过简单的图像处理，可将代表性的发光颜色照片裁剪并排列成图版，从而实现肉眼快速区分不同分析物。为进行定量分析，可从这些照片中提取红/绿/蓝（Red/Green/Blue）数值，并对所得数字数据进行统计处理。

引言

分子十字结构被定义为X形交叉共轭分子，其中两个共轭体系在中心核心处相交。1,2,3 通过适当的给体-受体取代，这些分子可以 空间定位 其前沿分子轨道（FMOs），使得最高占据分子轨道（HOMO）主要分布在分子的富电子轴上，而最低未占据分子轨道（LUMO）的大部分电子密度则位于分子的缺电子臂上。这种FMOs的空间分离特性对于此类十字形分子作为小分子传感器的应用至关重要，因为分析物与十字形分子结合 invariably 会改变其HOMO-LUMO能隙及相关的光学性质。该行为已在基于1,4-二苯乙烯基-2,5-双(芳基乙炔基)苯的十字形分子中得到证实。1 1,2,4,5-四乙炔基苯4 苯并二噁唑5,6 结构基序。由于这三类分子本身具有荧光性，该方法使其可作为小分子传感器使用。在这三个例子中，十字形分子均被路易斯碱性的吡啶和二烷基苯胺基团取代，因此能够响应路易斯酸性分析物，如质子和金属离子。1,4,5,7,8,9

2011年，Bunz 及其同事已证明10 1,4-二乙烯基-2,5-双(芳基乙炔基)苯十字架分子1-3的荧光响应图1) 的变化程度显著，具体取决于用于诱导十字交叉结构质子化的羧酸的结构。随后，Miljanić 等 已证明，诸如化合物4的苯并双噁唑十字架分子图1也对结构相似的羧酸表现出高度特异的荧光发射响应，并且在非常相似的有机硼酸之间也能观察到类似的区分能力。11 目前尚不清楚这种高度选择性发射颜色变化的起源，其机制很可能较为复杂——电子缺乏型分析物导致的荧光猝灭、分析物残留荧光以及质子化引起的十字交叉分子发射最大值位移等因素均可能发挥作用。然而，区分结构相似分析物的能力具有重要意义，尤其在于无需对十字交叉分子对分析物的光学响应进行详尽的紫外/可见吸收或荧光表征，仅凭发射颜色的简单照片即可实现具有统计学意义的区分。若在不同溶剂中拍摄照片或使用多种十字交叉传感器，对结构高度相似的分析物的分辨能力将进一步增强。采用这一快速方法，可在一下午内快速分析数十种分析物（见图中各面板） 图3-5），而若采用严格的光谱学方法进行相同分析则需要数周时间。此外，由于硼酸是动态物种，可通过硼原子的空轨道与亲核试剂配位 p-轨道，Miljanić 利用这一特性开发了由苯并双噁唑十字架分子 4 和简单的非荧光硼酸添加剂 B1 与 B5 组成的杂化传感器（图4).11,12 该方法学的作用机制如下：十字形分子4与硼酸形成一个瞬时复合物4·nB1（或 4·nB5）；该复合物的精确结构目前尚不清楚，但其荧光特性与单纯的十字形结构不同。若将此溶液暴露于路易斯碱性分析物中，这些分析物可取代硼酸上的一个或两个-OH基团。13 从而显著改变硼的电子性质，进而影响整个复合物的荧光特性。利用这一 "间接感知" 方法学，可实现对酚类、有机胺类和脲类，以及小分子有机和无机阴离子的检测。

本文介绍了一种利用直接和间接传感方法快速定性区分结构相关化合物的教程，包括（a）羧酸（图3）、（b）硼酸（图4），以及间接检测的（c）有机胺（图5）。为说明所报道方案的广泛适用性，我们采用Bunz的十字形分子检测羧酸，采用Miljanić的化合物检测硼酸，并通过一种杂合传感器检测小分子有机胺。我们推测，这些传感器可轻易互换，而不会显著影响待测物区分的质量。

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方案

1. 利用二乙烯基双（芳基乙炔基）苯十字架形分子检测羧酸

  1. 用二氯甲烷（DCM）配制浓度为 1.0 × 10-3 mol/L 的十字形分子 1-3 的新鲜储备液。无需使用光谱纯溶剂，分析纯（ACS 试剂级）即可满足要求。
  2. 利用步骤 1.1 中的储备液，分别配制 100 ml 浓度为 2.0 × 10-6 M 的十字形分子 1-3 溶液，溶剂包括二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EtOAc）、乙腈（AN）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、异丙醇（iPrOH）和甲醇（MeOH）。无需使用光谱纯溶剂，分析纯（ACS 试剂级）即可满足要求。
  3. 在 5 ml 小玻璃瓶中准确称取 0.65 mmol（88.2–124.2 mg）的待测羧酸 A1–A10，加入 5 ml 步骤 2.1 中配制的溶液，并振荡混合。若出现非均相体系，应静置使其沉降（无需过滤）。最终羧酸的总浓度为 0.13 M（31 g/L）。
  4. 在暗室中无环境光条件下拍摄样品荧光的数码照片。摄影装置（图 2）包括一台数码相机（Canon EOS 30D），配备镜头（EFS 18–55 mm 变焦镜头）和两盏紫外灯（激发波长 365 nm）。将未加盖的小瓶置于两盏紫外灯下充分照射，相机镜头与样品瓶之间的距离为 60 cm。根据不同溶液调节曝光时间，以获得准确反映发射颜色的图像（曝光时间范围为 0.25–15 秒）。

2. 使用苯并二恶唑十字架分子检测硼酸

  1. 在二氯甲烷（DCM）中配制浓度为 1.0 × 10-4 M 的十字形分子 4 溶液。无需使用光谱级溶剂，分析纯（ACS 试剂级）即可满足要求。
  2. 分别将每种硼酸分析物 50 mg（0.24–0.41 mmol）溶于 3 ml 的乙腈（AN）、1,2,4-三氯苯（TCB）、二氯甲烷（DCM）、环己烷（CH）和氯苯（CB）中，为每种硼酸分析物配制五份独立的溶液。所得各分析物浓度约为 16.7 g/L。无需使用光谱级溶剂，分析纯（ACS 试剂级）即可满足要求。
  3. 将步骤 2.2 中配制的每种分析物溶液各 1.8 ml 转移至五个独立的 10 × 10 mm 石英比色皿中（常用于紫外-可见光谱测定）。然后向每个比色皿中加入 20 μl 步骤 2.1 中配制的十字形分子溶液，并混合均匀。若观察到沉淀，可静置溶液使其自然沉降（无需过滤）。
  4. 将五个比色皿置于玻璃板上，并使用手持式紫外灯（365 nm）从上方照射。紫外灯的位置应确保五个比色皿受到均匀照射。
  5. 确保实验环境处于黑暗状态（关闭灯光，遮挡窗户及其他自然光和人工光源），立即拍摄溶液发光颜色的数码照片。Miljanić et al. 使用了两种数码相机型号：富士胶片 FinePix S9000 和佳能 EOS Rebel T3i，相机镜头与样品比色皿之间的距离为 45 cm，曝光时间为 0.5 秒。

3. 使用苯并二恶唑十字架/硼酸杂化传感系统检测胺类分析物

  1. 分别准备至少 80 ml 的十字形分子 4 在乙腈（AN）、1,2,4-三氯苯（TCB）、环己烷（CH）、二氯甲烷（DCM）和氯仿（CF）中的 1.0 × 10-6 M 溶液。
  2. 将 B1（152.6 mg，0.80 mmol）溶解于步骤 3.1 中制备的每种溶液各 40 ml 中。
  3. 将 B5（97.6 mg，0.80 mmol）溶解于步骤 3.1 中制备的每种溶液各 40 ml 中。
  4. 在完成步骤 3.2 和 3.3 所述溶液的配制后，立即取每种溶液 2 ml 用于溶解目标胺类分析物（40 mg，0.19–0.47 mmol）。针对每种胺类分析物，应制备十份溶液：其中五份添加 B1，另五份添加 B5。无需使用光谱级溶剂；ACS 试剂纯度即可满足要求。
  5. 对于每种分析物，将所制备的十份分析物/硼酸/十字形分子 4 溶液分别等分转移至十个独立的石英比色皿中。将这两组五比色皿（一组用于 4/B1，一组用于 4/B5）放置于玻璃板上，用便携式紫外灯在 365 nm 下照射，并立即按照上述 2.5 中所述设置进行拍照。

4. 图像处理与数值分析物区分

  1. 使用 Adobe Photoshop 或类似的图像处理程序，从每个试管发射颜色的数字照片中裁剪出具有代表性的方形区域。将这些裁剪出的图像整理成类似于图3B、图4和图5中的图版。在许多情况下，这些图版可实现通过肉眼快速区分不同分析物。
  2. 若需对发射颜色的差异进行量化，可从4.1步骤所得图版中提取红/绿/蓝（R/G/B）值，并进行统计分析。可免费下载的Colour Contrast Analyzer14可用于此目的。为获得一种分析物相对于另一种分析物的发射颜色相对标准偏差（例如化合物B1与B2，图4），使用以下公式：
    颜色差异方程；静态平衡概念；公式分析；教学示意图。
  3. 步骤4.2中的公式也可用于鉴定未知的羧酸分析物。因此，需计算该未知分析物与校准数据集中所有物质之间的每项偏差。最小的偏差即指示其对应的物质。

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结果

为了展示十字型荧光探针在传感和区分结构相似分析物方面的潜力，本文展示了三类实验结果。首先，采用1,4-二苯乙烯-2,5-双(芳基乙炔基)苯类十字型探针1-3（图1）对结构相似的羧酸A1-A10（图3所示）进行区分。接着，使用基于苯并双噁唑的十字型探针4（图1）分析硼酸B1-B9（图4所示）。最后，将十字型探针4与硼酸B1和B5联用，用于分析图5所示的胺类分析物。

使用十字形荧光团1-3在六种不同溶剂中，荧光响应依赖于羧酸的浓度及其结构特征。图3B展示了所有荧光团、溶剂和羧酸组合的数字记录发射颜色。该阵列对每种分析物呈现出18种特征性发射颜色，可用于对分析物进行唯一表征。通过发射颜色的红/绿/蓝（R/G/B）值，可将所有分析物相对于羧酸A1-A10进行区分，并如图3C中的自相关图所示实现鉴定。

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讨论

本文和视频中描述的定性区分方案在常规质量分析中具有重要意义，即使仅接受过最低限度培训的操作人员也能识别出成分差异或与明确定义的配方之间的偏差。通过使用简单的手机摄像头，该技术的实用性可进一步增强，结合Google Goggles等模式识别和图像识别软件，可将记录的发射颜色与已知成分数据库进行匹配。对发射颜色进行简单摄影的速度比严格的荧光发射光谱分析快约两个数量级，在许多情况下其区分不同分析物的能力可与光谱分析相媲美。

尽管所展示的方案在区分分析物的结构差异方面具有高度选择性，但其灵敏度较低。通常需要每升数克的分析物浓度才能调节十字形结构的发射颜色。因此，这些方法不太可能用于痕量成分的分析。然而，它们的优势在于分析那些来源丰富但易分解或易被伪造的物质：如药品、食品添加剂、基础化学品或酒精饮料。

然而，原则上可以通过增强对分析物的结合亲和力来提高荧光团1-4的灵敏度。由于其吡啶和胺官能团具有碱性，将吡啶环或苯胺修饰为更具特异性或碱性的官能团，是降低检测限的一个有前景的起点。例如，2-甲基吡啶和2,6-二甲基吡啶比吡啶更具碱性，因此...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

乔治亚理工学院Bunz实验室的工作部分得到了美国国家科学基金会（NSF-CHE 07502753）的支持；海德堡大学Ruprecht-Karls-Universität的工作由巴登-符腾堡州“结构与创新基金”资助。休斯顿大学Miljanić实验室的工作由美国国家科学基金会CAREER项目（CHE-1151292）、Welch基金会（资助号E-1768）、休斯顿大学（UH）及其小型资助项目以及休斯顿大学德克萨斯超导中心资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
环己烷 (CH)Mallinckrodt4878-02
氯苯 (CB)JT Baker9179-1
1,2,4-三氯苯 (TCB)Alfa Aesar19390
二氯甲烷 (DCM) - MiljanićMallinckrodt4879-06
乙腈 (AN)Mallinckrodt2856-10
氯仿 (CF)Mallinckrodt4440-19
二氯甲烷 (DCM) - BunzSigma Aldrich24233
乙酸乙酯 (EtOAc)Brenntag10010447额外蒸馏
乙腈 (AN)Sigma Aldrich34851
二甲基甲酰胺 (DMF)Sigma Aldrich38840
2-丙醇 (iPrOH)Ruprecht-Karls Universität Heidelberg, Zentralbereich Neuenheimer Feld69595
甲醇 (MeOH)VWR20847.295
4-羟基苯甲酸 (A1)Fluka54630
(4-羟基苯基)乙酸 (A2)Sigma AldrichH50004
布洛芬 (A3)ABCRAB125950
阿司匹林 (A4)Sigma AldrichA5376
苯乙酸 (A5)Sigma AldrichP16621
4-氯苯乙酸 (A6)Sigma Aldrich139262
苯甲酸 (A7)Merck8222571000
3,5-二羟基苯甲酸 (A8)Sigma AldrichD110000
2,4-二氯苯甲酸 (A9)Sigma Aldrich139572
2-羟基-5-碘苯甲酸 (A10)Sigma AldrichI10600
2,6-二氯苯基硼酸 (B1)TCID3357
3,5-双(三氟甲基)苯基硼酸 (B2)Sigma Aldrich471070
4-巯基苯基硼酸 (B3)Sigma Aldrich524018
4-甲氧基苯基硼酸 (B4)TCIM1126
苯基硼酸 (B5)Alfa AesarA14257
环己基硼酸 (B6)Sigma Aldrich556580
3-吡啶基硼酸 (B7)Sigma Aldrich512125
4-硝基苯基硼酸 (B8)Sigma Aldrich673854
五氟苯基硼酸 (B9)Sigma Aldrich465097
三乙胺 (N1)Alfa AesarA12646
哌啶 (N2)JT Baker2895-05
哌嗪 (N3)AldrichP45907
1,4-二氨基苯 (N4)Alfa AesarA15680
1,3-二氨基苯 (N5)Eastman
1,2-二氨基苯 (N6)TCIP0168
4-甲氧基苯胺 (N7)Alfa AesarA10946
苯胺 (N8)Acros22173-2500
4-硝基苯胺 (N9)Alfa AesarA10369
N,N-二苯基脲 (N10)Alfa AesarA18720
N,N-二甲基脲 (N11)Alfa AesarB21329
脲 (N12)Mallinckrodt8648-04
佳能 EOS 30D（EFS 18-55 mm 变焦镜头）Canon
佳能 EOS Rebel T3i（EFS 18-55 mm 变焦镜头）Canon
富士 FinePix S9000Fuji

参考文献

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