成年小鼠腹内侧下丘脑神经元膜电位染料成像用于研究葡萄糖感应

摘要

通过从成年小鼠特定脑区分离神经元，并利用荧光膜电位染料成像技术，可研究成年小鼠单个神经元的活动。通过检测神经元对葡萄糖浓度变化的反应，该技术可用于研究成年小鼠腹内侧下丘脑神经元对葡萄糖的敏感性。

摘要

对神经元活动的研究通常使用出生不到2个月的啮齿类动物神经元，因为随着年龄增长，结缔组织增多以及神经元存活能力下降，导致实验技术难度增加。在此，我们描述了一种从成年小鼠下丘脑中分离健康神经元的方法。能够研究成年小鼠的神经元，使得可以利用那些在较晚年龄才显现的疾病模型，并可能在某些研究中更符合发育实际情况。对分离神经元进行荧光成像可用于研究一群神经元的整体活动，而不是像电生理学那样仅研究单个神经元。当研究的神经元群体具有异质性且目标神经元类型稀少时（例如下丘脑葡萄糖感应神经元），这种方法尤其有用。我们采用膜电位染料成像技术，研究成年小鼠腹内侧下丘脑神经元对细胞外葡萄糖浓度变化的反应。葡萄糖感应神经元被认为在能量平衡的中枢调控中发挥重要作用。能够在成年啮齿类动物中研究葡萄糖感应功能尤为重要，因为与能量平衡失调相关的疾病（例如 肥胖）的发病率随年龄增长而升高。

引言

大脑通过神经内分泌系统和自主神经系统调节能量稳态。腹内侧下丘脑（VMH）由腹内侧核（VMN）和弓状核（ARC）组成，在能量稳态的中枢调控中具有重要作用。VMH内的特化葡萄糖感应神经元将神经元活动与外周葡萄糖稳态相联系¹。葡萄糖感应神经元分为两种类型：当细胞外葡萄糖浓度升高时，葡萄糖兴奋性（GE）神经元的活动增强，而葡萄糖抑制性（GI）神经元的活动减弱。通常采用电生理学或钙离子/膜电位敏感性染料成像技术来研究VMH中的葡萄糖感应神经元。

膜片钳电生理技术被认为是研究离子通道功能的金标准 离体 神经元活动。该技术通过高阻抗（GΩ）封接将玻璃微电极贴附于细胞膜上。膜片钳电极可实时记录单个神经元的动作电位频率（电流钳）或离子电导（电压钳）的变化。尽管膜片钳技术能够提供关于特定离子通道电导变化的详细信息，但其主要局限在于每次只能观察一个神经元。整个过程大约需要30–45分钟 记录以验证在开始任何特定实验处理之前，是否正在记录葡萄糖感应神经元。此外，GI 和 GE 神经元包括 <下丘脑腹内侧核（VMH）神经元群体的20%。更为复杂的是，许多情况下缺乏可用于识别这些神经元的特异性细胞标记物。因此，尽管膜片钳技术能够提供其他方法无法获得的宝贵电生理信息，但其操作繁琐、耗时较长且产出率低。

对分离的腹内侧下丘脑（VMH）神经元进行荧光成像，可实现同时研究数百个神经元。利用钙敏感性染....

方案

1. 动物

1. 所有实验程序均经新泽西州医科大学机构动物照护与使用委员会批准。
2. 将雄性C57BL/6小鼠按群体饲养，置于12小时光照/12小时黑暗循环环境中，并允许 随意摄取 可自由获取水和食物。在4至5月龄时处死动物。 对小鼠实施安乐死时，采用外科麻醉深度并结合第二种安乐死方法（即 通过膈肌进行胸腔穿透性切口）。这与美国兽医协会（AVMA）的安乐死指南一致。

2. 灌流液、盖玻片、玻璃移液管和培养基的制备

1. 配制1升灌流液，包含2.5 mM KCl、7 mM MgCl₂、1.25 mM NaH₂PO₄、26 mM NaHCO₃、10 mM葡萄糖、92 mM蔗糖、30 mM HEPES和119 mM NaCl₂，1.25 mM NaH₂PO₄，28 mM NaHCO₃₃，0.5 mM CaCl₂，7 mM 葡萄糖，1 mM 抗坏血酸，3 mM 丙酮酸，溶于蒸馏水 dH₂O. 使用约 80 g/L 蔗糖将渗透压调节至约 300 mOsm。用 95% O₂₂ /5% CO₂₂ 并调节pH至7.4。每次实验大约需要200 ml 灌流液。分装后可在 -20 °C 保存长达....

结果

精确地将腹内侧下丘脑（VMH）与其他下丘脑区域分离对于获得一致的结果至关重要。若包含其他区域，可能会稀释VMH神经元群体，从而改变所计算的去极化神经元百分比。此外，其他下丘脑区域（如外侧下丘脑）也已鉴定出存在葡萄糖感应神经元，这些神经元在功能和机制上可能与VMH的葡萄糖感应神经元不同。 图1 展示了正确解剖位置以进行精确解剖。按照上述方案操作后，可分离出包含正确腹内侧下丘脑（VMH）区域的脑组织。进一步精细分离腹内侧核（VMN）与弓状核（ARC），同时完整保留各亚群全部结构，可能无法实现。 图2 显示了健康的离解下丘脑腹内侧核（VMH）神经元的一个示例。通过免疫细胞化学方法，我们证实了我们的制备样本 >90%为神经元。仅应使用健康的神经元进行数据分析，含有过多不健康神经元的培养皿应予以弃用。不健康的神经元通常边缘颜色较深，对MPD的摄取程度更高，且形态不规则。此外，神经元接种密度应控制在记录期间大多数神经元互不接触的水平。用于分析的神经元不应与其他细胞或碎片接触。

来自GI神经元和非GI神经元记录的数据如

讨论

能够研究成年小鼠神经元活性的关键在于获得健康的离散神经元。与幼年小鼠相比，从成年小鼠分离下丘脑神经元在实验方案的多个关键步骤上更为困难。我们已通过多种方式克服了这一问题。制备较厚的500 µm脑切片，相较于通常用于幼鼠脑组织的250–350 µm切片，可显著减少对神经元的机械损伤。然而，较厚的切片需要更加注意心脏灌注以及脑组织的木瓜蛋白酶（papain）消化。若在脑组织上观察到血液残留，应评估右心房切口位置及左心室插针的准确性。灌注液的流速和用量也可相应调整。充分的灌注至关重要，因为血液对神经元具有毒性，会导致健康神经元得率降低。木瓜蛋白酶的消化必须足够充分，以实现轻柔的吹打操作，并使单个细胞易于从脑组织中释放。若消化结束时腹内侧下丘脑（VMH）组织迅速沉降，或在第二次吹打时仍存在较大组织块，则提示木瓜蛋白酶消化不充分。在消化良好的情况下，第三次吹打时肉眼几乎无法察觉组织碎片。若吹打操作不够轻柔，将损害神经元的健康状态。若怀疑木瓜蛋白酶消化不充分，可将木瓜蛋白酶浓度提高5 U/ml ，或更换新瓶木瓜蛋白酶。但木瓜蛋白酶浓度不应超过30 U/ml ，否则可能损害神经元健康。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal-A 培养基（定制）	Invitrogen	0050128DJ	定制无葡萄糖
Hibernate-A 培养基（定制）	BrainBits		定制无葡萄糖
青霉素-链霉素（20,000 U/ml）	Invitrogen	15140	其他供应商亦可接受
Stericup 真空滤器装置（0.22 μm)	Millipore		其他供应商可接受
25 mm 玻璃盖玻片	沃纳	#1 25毫米圆形
18 mm 玻璃盖玻片	沃纳	#1 18毫米圆形
GlutaMAX	Invitrogen	35050
B27 去胰岛素（50倍浓缩）	Invitrogen	0050129SA
剃刀刀片	VWR	55411
振动切片机 &和冷却室	振动切片机	1000 系列切片系统
振动切片机刀片	Polysciences	22370	注射器或其它供应商的双刃刀片可接受
木瓜蛋白酶，悬液	沃辛顿	LS003124
BSA，适用于细胞培养	Sigma		其他供应商可接受
DNA酶，用于细胞培养	Invitrogen		其他供应商可接受
克隆环，6 mm × 8 mm	贝尔科玻璃	2090-00608
膜电位染料（蓝色）	Molecular Devices	R8042
在线加热器	沃纳	SF-28
注射泵	WPI	sp100i	其他供应商可接受
封闭室	沃纳	RC-43C
聚乙烯管	沃纳	PE-90
Metamorph	Molecular Devices		可接受的替代图像分析软件
显微镜	奥林巴斯	BX61 WI	与10X联用 目的
相机	光度测量	Cool Snap HQ
窄带Cy3滤光片组	色度	41007a
照明系统	Sutter Instruments	Lambda DG-4