本研究采用多孔板微流控系统，显著提高了在生理相关剪切流条件下细胞滚动研究的通量。鉴于细胞滚动在多步细胞归巢级联反应中的重要性，以及在外源性细胞群体经系统性递送至患者后细胞归巢的关键作用，该系统有望作为筛选平台，用于优化细胞治疗策略。
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本文内容
摘要
摘要
细胞治疗面临的主要挑战之一是在静脉或动脉内输注后，无法高效地将大量有活力的细胞系统性地靶向至目标组织。因此，目前正将增强细胞归巢能力作为改进细胞治疗的一种策略进行研究。细胞在血管内皮上的滚动是细胞归巢过程中的重要步骤，可通过相关方法进行检测 体外 使用平行板流动室（PPFC）进行实验。然而，该方法极为繁琐，通量低，且流动条件控制不佳。相比之下，我们采用了一种多孔板微流控系统，可在精确控制、符合生理相关性的剪切流条件下，实现对细胞滚动特性的高通量研究。1,2本文展示了如何便捷地检测HL-60（人早幼粒细胞白血病）细胞在P-和E-选择素包被表面以及细胞单层包被表面上的滚动特性。为了更好地模拟炎症条件，微流控通道表面被包被内皮细胞（ECs），随后用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）激活，显著增强了在动态条件下与HL-60细胞的相互作用。高通量检测结合集成的多参数软件分析平台，可快速分析滚动速度和滚动轨迹等参数，是评估细胞滚动特性的关键优势 体外该平台可快速、准确地分析旨在影响细胞滚动和归巢的工程学方法，有望推动外源性细胞治疗技术的发展。
引言
细胞治疗成功实现临床转化的主要挑战之一，是系统性输注的细胞难以有效递送或靶向至目标部位3,4因此，人们一直在不断探索改善细胞归巢、特别是细胞滚动的方法，以此作为提高细胞治疗效果的策略。细胞在血管上的滚动是细胞归巢级联反应中的关键步骤，这一过程最初是针对被招募至疾病部位的白细胞而定义的5. 此步骤由内皮选择素之间的特异性相互作用所调控， 即 P-和E-选择素（P-和E-sel）及其在白细胞表面的相应配体5,6更好地理解并提高细胞归巢效率，特别是滚动步骤的效率，对于开发新型细胞治疗平台具有重要意义。迄今为止，这一目标主要通过使用平行板流动室（PPFCs）实现，该装置由两块平板和中间的垫片组成，上板设有进流和出流孔，通过注射泵将细胞悬液经此系统灌注7,8 ,9底部平板的表面可包被相关的细胞单层/基质，随后在剪切流条件下研究灌注细胞与表面之间的相互作用7然而，PPFC是一种通量低、试剂消耗大且相当繁琐的方法，气泡形成、泄漏以及流速控制不佳是其主要缺点。
一种替代传统平行板流动室（PPFC）的技术是多孔板微流控系统，该系统可在精确的计算机控制剪切流条件下进行细胞实验，通量更高（比PPFC高至多10倍），且试剂消耗量低1,10。细胞滚动实验在微流控通道内进行，通道表面可包被细胞单层或工程化基底，并通过显微镜成像，利用合适的软件对滚动特性进行....
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方案
1. 细胞培养
- 人早幼粒细胞白血病（HL-60）细胞
- 在75 cm2 培养瓶中加入15 ml含20%（v/v）胎牛血清（FBS）、1%（v/v）L-谷氨酰胺和1%（v/v）青霉素-链霉素的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM），培养HL-60细胞。
- 每3天更换一次培养基，吸除一半细胞悬液后，补充等体积的新鲜完全IMDM培养基。
- 进行羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）染色时，将HL-60细胞悬液离心（400 × g，5分钟），弃上清后重悬于预热PBS中配制的1 μM CFSE溶液，37 °C孵育15分钟。随后离心细胞，吸除上清液，将细胞重悬于新鲜预热培养基中孵育30分钟。用PBS洗涤细胞后，用于滚动实验（参见图1B，显示CFSE标记的HL-60细胞在P-选择素包被表面的代表性图像）。
注意：CFSE 染色为可选步骤，此处展示旨在说明微流控通道中的滚动现象。本文所呈现的滚动参数分析是利用标准明场成像对未染色细胞进行的。
- 肺微血管内皮细胞（LMVECs）
- 用0.1%明胶溶液（PBS中v/v）包被100 mm培养皿，在37 °C下孵育至少30分钟。
- 在经明胶包被的100 mm培养皿中，使....
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结果
HL-60 细胞在 P-选择素和 E-选择素表面发生滚动，但在纤连蛋白表面不发生滚动
HL-60 细胞被认为是“滚动”行为的金标准模型，因其表达多种归巢配体，包括滚动配体 P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）和唾液酸化路易斯X（SLeX）5,14（图1A）。表面蛋白 PSGL-1 作为四糖 SLeX 的支架，介导与 P-选择素（P-sel）和 E-选择素（E-sel）的特异性相互作用，而 P-sel 和 E-sel 在炎症期间于内皮细胞表面表达上调5,6,15。为测试多孔板微流控系统的性能，多个微流控通道被同时包被不同底物，并对 HL-60 细胞在这些表面的滚动相互作用进行了分析。HL-60 细胞在 P-sel 包被的表面表现出显著的滚动行为，细胞首先从流动中被捕获，随后呈现明显的滚动运动。如图1C所示，并与文献报道一致，HL-60 细胞在 E-sel 表面也表现出类似的滚动行为，但在纤维连接蛋白（fibronectin）包被的底物上则无此现象14,16-19
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讨论
外源性细胞治疗成功转化的主要挑战之一是无法高效地将细胞递送至损伤和炎症部位，并实现高的植入效率3。细胞滚动是细胞归巢过程中的关键步骤，可促进细胞在血管壁上减速，最终导致其牢固黏附并穿过内皮进入组织5。深入理解候选细胞类型的滚动过程，可能有助于开发增强细胞归巢的技术，从而显著推动细胞治疗的发展。
平行板流动室（PPFC）是一种广泛用于研究细胞滚动以及其他在剪切流条件下细胞行为的工具。1987年，Lawrence et al. 首次研究了将PPFC应用于检测中性粒细胞在内皮上的黏附，此后已开发出多种商业化产品8,9。PPFC由两块平板组成，中间通过垫片隔开，以控制腔室的尺寸7。上板包含进液口和出液口，通过使用注射泵可实现细胞悬液在腔室内的灌注7,8。此外还有一个额外的端口用于施加负压（真空），以确保上下板紧密贴合7。尽管平行板流动室已被有效用于研究包括细胞滚动在内的多种细胞响应，但在剪切流条件下的应用仍存在诸多限制，影响其有效性。流动室的.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
CHO-P 细胞由 Barbara Furie 博士（哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心）惠赠。本研究工作获得了美国国立卫生研究院资助项目 HL095722（资助对象：J.M.K.）的支持。此外，本工作还部分得到了 Movember-前列腺癌基金会挑战奖（资助对象：J.M.K.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人肺微血管内皮细胞 | Lonza | CC-2527 | |
| 表达P-选择素的中国仓鼠卵巢细胞（CHO-P） | 由Barbara Furie博士惠赠11,12 | ||
| HL-60细胞 | ATCC | CCL-240 | |
| 细胞培养试剂 | |||
| 内皮基础培养基 | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2培养基 | Lonza | CC-3156 | |
| 内皮基础培养基添加剂 | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM - 伊氏改良杜尔贝科培养基 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) 营养混合物（Ham） | Gibco | 11765-054 | |
| 青霉素-链霉素（P/S） | Gibco | 15140 | |
| L-谷氨酰胺（L/G）200 mM | Gibco | 25030 | |
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| 培养皿 | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm细胞培养皿，组织培养处理聚苯乙烯 | |||
| 离心管（15 ml聚丙烯锥形管） | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75培养瓶 | BD Falcon | 353136 | |
| 明胶溶液（2%） | Sigma | G1393 | |
| dPBS（不含氯化钙和氯化镁） | Sigma | D8537 | |
| 胰蛋白酶-EDTA溶液（10x） | Sigma | T4174 | |
| 抗体 | |||
| 抗人E-选择素/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC标记的小鼠IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| 抗人P-选择素 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC标记的小鼠IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC小鼠IgG1 κ同型对照 | BD Bioscience | 555748 | |
| 抗SLeX /CD15s抗体，克隆：5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC标记 | Santa Cruz | SC70545 | |
| 正常小鼠IgM-FITC同型对照 | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE标记的小鼠抗人CD162，克隆：KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE标记的小鼠IgG1 k同型对照 | BD Pharmingen | 550617 | |
| 抗P-选择素抗体（AK4） | Santa Cruz | SC19996 | |
| 抗E-选择素抗体，克隆P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| 小鼠IgG1同型对照 | Santa Cruz | SC3877 | |
| 其他试剂 | |||
| 重组人TNF-α | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE细胞增殖检测试剂盒 - 用于流式细胞术 | Invitrogen | C34554 | |
| 人P-选择素-Fc重组蛋白 | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| 人E-选择素-Fc重组蛋白 | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| 人纤维连接蛋白，血浆来源 | Invitrogen | 33016-015 | |
| 设备 | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage为用于运行实验和分析数据的软件 | |
| BioFlux 48孔板 | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6流式细胞仪 | BD Bioscience | CFlow Plus为用于运行实验和分析数据的软件 | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD相机 | Photometrics |
参考文献
- Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C.
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重印与许可
