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方法文章

系统分析 体外 使用多孔板微流控系统进行细胞滚动实验

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DOI：

10.3791/50866

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2013年10月16日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women's Hospital, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Harvard Stem Cell Institute, Harvard University, 5Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, 6Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

本文内容

摘要

本研究采用多孔板微流控系统，显著提高了在生理相关剪切流条件下细胞滚动研究的通量。鉴于细胞滚动在多步细胞归巢级联反应中的重要性，以及在外源性细胞群体经系统性递送至患者后细胞归巢的关键作用，该系统有望作为筛选平台，用于优化细胞治疗策略。

摘要

细胞治疗面临的主要挑战之一是在静脉或动脉内输注后，无法高效地将大量有活力的细胞系统性地靶向至目标组织。因此，目前正将增强细胞归巢能力作为改进细胞治疗的一种策略进行研究。细胞在血管内皮上的滚动是细胞归巢过程中的重要步骤，可通过相关方法进行检测 体外 使用平行板流动室（PPFC）进行实验。然而，该方法极为繁琐，通量低，且流动条件控制不佳。相比之下，我们采用了一种多孔板微流控系统，可在精确控制、符合生理相关性的剪切流条件下，实现对细胞滚动特性的高通量研究。1,2本文展示了如何便捷地检测HL-60（人早幼粒细胞白血病）细胞在P-和E-选择素包被表面以及细胞单层包被表面上的滚动特性。为了更好地模拟炎症条件，微流控通道表面被包被内皮细胞（ECs），随后用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）激活，显著增强了在动态条件下与HL-60细胞的相互作用。高通量检测结合集成的多参数软件分析平台，可快速分析滚动速度和滚动轨迹等参数，是评估细胞滚动特性的关键优势 体外该平台可快速、准确地分析旨在影响细胞滚动和归巢的工程学方法，有望推动外源性细胞治疗技术的发展。

引言

细胞治疗成功实现临床转化的主要挑战之一，是系统性输注的细胞难以有效递送或靶向至目标部位3,4因此，人们一直在不断探索改善细胞归巢、特别是细胞滚动的方法，以此作为提高细胞治疗效果的策略。细胞在血管上的滚动是细胞归巢级联反应中的关键步骤，这一过程最初是针对被招募至疾病部位的白细胞而定义的5. 此步骤由内皮选择素之间的特异性相互作用所调控， 即 P-和E-选择素（P-和E-sel）及其在白细胞表面的相应配体5,6更好地理解并提高细胞归巢效率，特别是滚动步骤的效率，对于开发新型细胞治疗平台具有重要意义。迄今为止，这一目标主要通过使用平行板流动室（PPFCs）实现，该装置由两块平板和中间的垫片组成，上板设有进流和出流孔，通过注射泵将细胞悬液经此系统灌注7,8 ,9底部平板的表面可包被相关的细胞单层/基质，随后在剪切流条件下研究灌注细胞与表面之间的相互作用7然而，PPFC是一种通量低、试剂消耗大且相当繁琐的方法，气泡形成、泄漏以及流速控制不佳是其主要缺点。

一种替代传统平行板流动室（PPFC）的技术是多孔板微流控系统，该系统可在精确的计算机控制剪切流条件下进行细胞实验，通量更高（比PPFC高至多10倍），且试剂消耗量低1,10。细胞滚动实验在微流控通道内进行，通道表面可包被细胞单层或工程化基底，并通过显微镜成像，利用合适的软件对滚动特性进行快速分析。在本研究中，我们通过分析人早幼粒细胞白血病（HL-60）细胞在不同表面上的滚动特性，展示了该多孔板微流控系统的功能。研究分析了HL-60细胞在P-和E-选择素等基质以及表达不同滚动受体的细胞单层上的滚动行为。此外，采用抗体（Ab）阻断实验，验证了特定选择素在介导HL-60细胞在这些表面上滚动过程中的直接作用。滚动实验以更高的通量进行，剪切流稳定，试剂和细胞消耗极少，从而可高效分析关键的滚动参数，如滚动速度、滚动细胞数量及滚动轨迹特性。

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方案

1. 细胞培养

  1. 人早幼粒细胞白血病（HL-60）细胞
    1. 在75 cm2 培养瓶中加入15 ml含20%（v/v）胎牛血清（FBS）、1%（v/v）L-谷氨酰胺和1%（v/v）青霉素-链霉素的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM），培养HL-60细胞。
    2. 每3天更换一次培养基，吸除一半细胞悬液后，补充等体积的新鲜完全IMDM培养基。
    3. 进行羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）染色时，将HL-60细胞悬液离心（400 × g，5分钟），弃上清后重悬于预热PBS中配制的1 μM CFSE溶液，37 °C孵育15分钟。随后离心细胞，吸除上清液，将细胞重悬于新鲜预热培养基中孵育30分钟。用PBS洗涤细胞后，用于滚动实验（参见图1B，显示CFSE标记的HL-60细胞在P-选择素包被表面的代表性图像）。

注意：CFSE 染色为可选步骤，此处展示旨在说明微流控通道中的滚动现象。本文所呈现的滚动参数分析是利用标准明场成像对未染色细胞进行的。

  1. 肺微血管内皮细胞（LMVECs）
    1. 用0.1%明胶溶液（PBS中v/v）包被100 mm培养皿，在37 °C下孵育至少30分钟。
    2. 在经明胶包被的100 mm培养皿中，使用完全内皮细胞生长培养基（内皮基础培养基-2（EBM-2））培养LMVECs，并添加特定生长补充剂试剂盒（参见试剂部分）。每隔一天更换一次培养基，当细胞融合度达到80–90%时进行传代培养。
    3. 传代时，先用PBS洗涤细胞，然后加入4 ml 1× 胰蛋白酶-EDTA，在37 °C下消化3分钟，再用等体积的完全EBM-2培养基中和。将细胞悬液转移至15 ml离心管中，离心（400 × g，5分钟）。离心后，将沉淀重悬于1 ml完全内皮细胞培养基中，用血细胞计数板计数细胞。避免过度传代，因为这会影响细胞的形态和功能——所有实验仅使用传代次数低于7代的细胞。
  1. 中国仓鼠卵巢-P-选择素（CHO-P）细胞
    1. CHO-P 细胞是稳定转染以表达人 P-选择素（P-sel）的 CHO 细胞，由合作者提供（哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心）11,12。
    2. 在 T175 cm2 培养瓶中加入 25 ml F-12 培养基培养 CHO-P 细胞。
    3. 传代时，用 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞 4–5 秒，随后在 37 °C 下用 10 ml 1× 胰蛋白酶-EDTA 消化 3 分钟，接着用完全培养基中和。
    4. 将细胞悬液离心（400 × g，5 分钟），小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 1 ml 完全培养基中，并用血细胞计数板计数细胞。

2. 集成多孔板微流控系统的操作

  1. 确保所有设备正确连接，并开启各个模块：计算机、控制器、倒置显微镜和CCD相机。
  2. 打开成像软件；确保屏幕上正确显示多孔板模块和成像模块。
  3. 将管路连接至蒸气捕集器（连接至控制器），并同时将其连接至压力接口。
  4. 将多孔板放入板加热器/适配器中。向孔中加入试剂（如下所述），并在板上方安装接口。将板放置于自动载物台上进行成像。
  5. 该接口安装在板的顶部，通过控制器向各孔顶部施加气动压力，从而以设定的流速推动液体流经微流控通道，流速可通过多孔板模块界面的手动模式轻松控制。
  6. 试剂在通道中流动，经过位于孔之间的观察区域。微流控通道尺寸为350 μm宽 × 70 μm高。线性通道长度为1 mm，通道底部由180 μm的盖玻片玻璃构成，适用于明场、相差、荧光和共聚焦显微镜观察。
  7. 使用CCD相机（连续采集，11帧/秒）采集视频，并通过兼容软件进行分析。

3. 蛋白质基质或细胞单层对微流控通道的包被

  1. 用纤连蛋白或 P-/E-选择素包被微流控通道
    1. 在 PBS 中配制 1 ml 浓度为 20 μg/ml 的纤连蛋白溶液。根据需包被的通道数量调整体积（每个通道使用 25–50 μl 纤连蛋白）。
    2. 向每个入口孔中加入 25–50 μl 纤连蛋白溶液。施加 2 dyn/cm2 的剪切力，灌注通道 5 分钟。请注意观察出口孔中出现的液滴。室温下孵育 30–45 分钟。
    3. 从孔中吸除溶液（切勿直接从为通道供液的中间孔吸液）1,13。向出口孔中加入 200–500 μl PBS，并施加 2 dyn/cm2 的剪切流 5 分钟，以 PBS 洗涤通道。此时通道已成功包被纤连蛋白，可直接使用。
    4. 若需使用 P-或 E-选择素包被，将所需的人重组蛋白溶于 PBS，配制成 5 μg/ml 的溶液，并按上述步骤包被通道，于 37 °C 孵育 1 小时，以完成表面包被。
  2. 在微流控通道内形成 CHO-P 或 LMVEC 单层
    1. 将细胞从培养皿中轻柔消化 3 分钟，用两倍体积的完全培养基终止消化，离心（400 × g，5 分钟）。用 10 ml 完全培养基重悬细胞，再次离心（400 × g，5 分钟）。
    2. 计数细胞以确定悬液中的细胞浓度。为确保通道内形成融合的 LMVEC 单层，将细胞浓度调整至 1500–2000 万个细胞/ml；对于融合的 CHO-P 细胞单层，则使用 5000–6000 万个细胞/ml。每个通道使用 25–50 μl 细胞悬液——根据此参数确定实验所用的初始细胞数量。
    3. 将适当浓度的 25–50 μl 细胞悬液加入入口孔。将培养板置于显微镜载物台上，以 2 dyn/cm2 的流速将细胞引入通道，直至显微镜视野中观察到细胞完全充满通道，随后停止流动。
    4. 向出口孔和入口孔均加入 200 μl 完全 LMVEC 培养基或 CHO 培养基。将培养板放入培养箱中（37 °C，5% CO2），静置 3 小时，使细胞沉降并贴壁。
    5. 3 小时孵育后，用完全培养基以 2 dyn/cm2 的剪切流洗涤通道 10–15 分钟，以去除未贴壁的细胞。此时细胞应已完全融合，通道可直接用于后续实验。根据初始接种密度，可能需要额外 2–3 小时的静置时间，以确保细胞完全覆盖通道表面。

4. 肺微血管内皮细胞的促炎性激活及P-/E-选择素的抗体阻断

  1. 在LMVEC基础培养基中配制TNF-α溶液（10 ng/ml）。
  2. 为诱导通道内LMVEC的炎症活化，向入口孔中加入100 μl TNF-α溶液，并施加2 dyn/cm2的剪切流5分钟，使溶液进入通道。对于对照通道（非活化内皮细胞），向入口孔中加入100 μl LMVEC基础培养基，并以2 dyn/cm2剪切流作用5分钟引入通道。此时通道已准备好进行滚动实验。
  3. 为阻断LMVEC和CHO-P细胞上的P-选择素和E-选择素，将中和性P-选择素抗体（克隆AK4，5 μg/ml溶于基础培养基）或E-选择素抗体（克隆P2H3，5 μg/ml溶于基础培养基）引入通道，在37 °C孵育1小时。随后，用基础培养基清洗通道（2 dyn/cm2，5分钟）。此时通道已准备好进行滚动实验。

5. 在底物/细胞单层包被的微流控通道中进行 HL-60 细胞滚动实验

  1. 在显微镜下仔细检查通道，确认通道已正确包被（若为细胞包被，则应观察到完全融合的单层细胞）。
  2. 为准备用于滚动实验的HL-60细胞悬液，将HL-60细胞悬液以400 × g离心5分钟，并用基础培养基洗涤一次。计数细胞后，重悬于IMDM（基础培养基，含Ca2+和Mg2+）中，制备浓度为500万个细胞/mL的HL-60细胞悬液。每个通道使用25–50 μl细胞悬液进行滚动实验。
  3. 将25–50 μl细胞悬液加入出口孔中，将培养板放入温控板架（37 °C）内，并置于显微镜载物台上。随后施加2 dyn/cm2的剪切力，使细胞进入通道（应在10–15秒内观察到细胞从出口流向入口）。
  4. 为研究不同剪切应力下的滚动反应，将剪切力降低至0.25 dyn/cm2，并在每个目标剪切力下（从0.25逐步增加至5 dyn/cm2，也可使用更高的剪切力）使用"流式采集"功能采集20–30秒的视频。
  5. 使用CCD相机（流式采集，每秒11帧）采集视频，并通过兼容软件分析细胞滚动轨迹和滚动速度。

6. 流式细胞术检测表面分子的表达

  1. 胰酶消化后，用 PBS (-/-) 制备所需细胞类型（HL-60、CHO-P 或 LMVECs）的细胞悬液（每样本使用 1–2 × 105 个细胞），并添加 2% FBS。用相同缓冲液洗涤细胞两次，并将样本体积调至 50 μl。
  2. 每份样本加入相应荧光素标记的抗体（详细信息见附表），在 4 °C 孵育 20 分钟（用铝箔覆盖避光）。
  3. 用相同缓冲液洗涤细胞两次，并将染色后的细胞悬液终体积调至 200 μl。使用流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况。

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结果

HL-60 细胞在 P-选择素和 E-选择素表面发生滚动，但在纤连蛋白表面不发生滚动

HL-60 细胞被认为是“滚动”行为的金标准模型，因其表达多种归巢配体，包括滚动配体 P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）和唾液酸化路易斯X（SLeX）5,14（图1A）。表面蛋白 PSGL-1 作为四糖 SLeX 的支架，介导与 P-选择素（P-sel）和 E-选择素（E-sel）的特异性相互作用，而 P-sel 和 E-sel 在炎症期间于内皮细胞表面表达上调5,6,15。为测试多孔板微流控系统的性能，多个微流控通道被同时包被不同底物，并对 HL-60 细胞在这些表面的滚动相互作用进行了分析。HL-60 细胞在 P-sel 包被的表面表现出显著的滚动行为，细胞首先从流动中被捕获，随后呈现明显的滚动运动。如图1C所示，并与文献报道一致，HL-60 细胞在 E-sel 表面也表现出类似的滚动行为，但在纤维连接蛋白（fibronectin）包被的底物上则无此现象14,16-19

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讨论

外源性细胞治疗成功转化的主要挑战之一是无法高效地将细胞递送至损伤和炎症部位，并实现高的植入效率3。细胞滚动是细胞归巢过程中的关键步骤，可促进细胞在血管壁上减速，最终导致其牢固黏附并穿过内皮进入组织5。深入理解候选细胞类型的滚动过程，可能有助于开发增强细胞归巢的技术，从而显著推动细胞治疗的发展。

平行板流动室（PPFC）是一种广泛用于研究细胞滚动以及其他在剪切流条件下细胞行为的工具。1987年，Lawrence et al. 首次研究了将PPFC应用于检测中性粒细胞在内皮上的黏附，此后已开发出多种商业化产品8,9。PPFC由两块平板组成，中间通过垫片隔开，以控制腔室的尺寸7。上板包含进液口和出液口，通过使用注射泵可实现细胞悬液在腔室内的灌注7,8。此外还有一个额外的端口用于施加负压（真空），以确保上下板紧密贴合7。尽管平行板流动室已被有效用于研究包括细胞滚动在内的多种细胞响应，但在剪切流条件下的应用仍存在诸多限制，影响其有效性。流动室的...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

CHO-P 细胞由 Barbara Furie 博士（哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心）惠赠。本研究工作获得了美国国立卫生研究院资助项目 HL095722（资助对象：J.M.K.）的支持。此外，本工作还部分得到了 Movember-前列腺癌基金会挑战奖（资助对象：J.M.K.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
人肺微血管内皮细胞LonzaCC-2527
表达P-选择素的中国仓鼠卵巢细胞（CHO-P）由Barbara Furie博士惠赠11,12
HL-60细胞ATCCCCL-240
细胞培养试剂
内皮基础培养基LonzaCC-3156
EBM-2培养基LonzaCC-3156
内皮基础培养基添加剂LonzaCC-4147
EGM-2 MV SingleQuotsLonzaCC-4147
IMDM - 伊氏改良杜尔贝科培养基 1xGibco12440
F-12 (1x) 营养混合物（Ham）Gibco11765-054
青霉素-链霉素（P/S）Gibco15140
L-谷氨酰胺（L/G）200 mMGibco25030
胎牛血清（FBS）Atlanta BiologicalsSa550
培养皿BD FalconBD-353003
100 mm细胞培养皿，组织培养处理聚苯乙烯
离心管（15 ml聚丙烯锥形管）MedSupply PartnersTC1500
T75培养瓶BD Falcon353136
明胶溶液（2%）SigmaG1393
dPBS（不含氯化钙和氯化镁）SigmaD8537
胰蛋白酶-EDTA溶液（10x）SigmaT4174
抗体
抗人E-选择素/CD62ER&D SystemsBBA21
FITC标记的小鼠IgG1R&D SystemsBBA21
抗人P-选择素R&D SystemsBBA34
FITC标记的小鼠IgG1R&D SystemsBBA34
FITC小鼠IgG­1 κ同型对照BD Bioscience555748
抗SLeX /CD15s抗体，克隆：5F18Santa CruzSC70545
FITC标记Santa CruzSC70545
正常小鼠IgM-FITC同型对照Santa CruzSC2859
PE标记的小鼠抗人CD162，克隆：KPL-1BD Pharmingen556055
PE标记的小鼠IgG1 k同型对照BD Pharmingen550617
抗P-选择素抗体（AK4）Santa CruzSC19996
抗E-选择素抗体，克隆P2H3MilliporeMAB2150
小鼠IgG1同型对照Santa CruzSC3877
其他试剂
重组人TNF-αPeproTech300-01A
Cell Trace CFSE细胞增殖检测试剂盒 - 用于流式细胞术InvitrogenC34554
人P-选择素-Fc重组蛋白R&D Systems137-PS-050
人E-选择素-Fc重组蛋白R&D Systems724-ES-100
人纤维连接蛋白，血浆来源Invitrogen33016-015
设备
Bioflux 1000Fluxion BiosciencesBioflux Montage为用于运行实验和分析数据的软件
BioFlux 48孔板Fluxion Biosciences
BD Accuri C6流式细胞仪BD BioscienceCFlow Plus为用于运行实验和分析数据的软件
Nikon Eclipse Ti-SNikon
CoolSnap HQ2 CCD相机Photometrics

参考文献

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HL-60细胞P-选择素E-选择素TNF-α内皮细胞剪切流滚动速度平行板流动腔
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