的系统分析体外细胞滚动使用多孔板微流控系统

Summary

本研究采用多孔板微流体系统，根据有关生理剪切流显著增加通量细胞滚动研究。定小区轧制的多步骤细胞归巢级联和细胞归巢的下列全身递送的细胞的患者的外源性群体的重要性的重要性，该系统提供了潜在的作为筛选平台，以提高基于细胞的疗法。

Abstract

细胞为基础的治疗的一个主要挑战是无法系统地针对大量活菌，高效率的兴趣组织下静脉或动脉内注射。因此，增加细胞归巢目前正在研究作为一项战略，以改善细胞疗法。细胞滚动对血管内皮是在细胞归巢的过程中的重要一步，可以使用平行板流室（PPFC） 在体外进行探测。然而，这是一个非常繁琐的，低通量的检测，控制不良的流动条件。相反，我们使用了一个多穴板的微流体系统，可以使蜂窝轧制性能研究在更高的吞吐量下精确控制的，生理学相关的剪切流动^1,2。在本文中，我们表明HL-60（人早幼粒细胞白血病）上的P-和E-选择蛋白包被的表面，以及对细胞单层涂层表面细胞的轧制性能如何可以readilŸ检查。以更好地模拟炎性病症，所述微流体通道的表面上涂布的内皮细胞（EC），然后将其与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）激活时，在动态条件下显著增加与HL-60细胞的相互作用。增强的吞吐量和集成的多参数分析的软件平台，允许的参数，如轧制速度和轧路径的快速分析，对评估体外细胞滚动属性重要的优点。使工程设计方法来影响细胞的滚动和归巢的快速，准确的分析，这个平台可以帮助推进外源性细胞为基础的治疗。

Introduction

一种在基于细胞的疗法的成功临床翻译的主要挑战是低效的交货或全身性输注的细胞靶向至期望的位点^3,4。因此，人们不断寻求方法来改善细胞的归巢，并且特别是信元轧制，作为一个策略，以改善细胞疗法。细胞滚动血管在细胞归巢级联，经典的定义被招募到发病部位⁵白细胞的关键一步。这一步是由内皮细胞选择素之间的特异性相互作用制约， 即 P-和E-选择素（P-和E-SEL），和他们的白细胞^5,6表面上柜台的配体。更好地了解和细胞归巢的提高效率，特别是轧制工序，是在寻求新的平台，以提高细胞为基础的治疗具有重要意义。迄今这​​已经通过使用平行平板流动腔（PPFCs），包括两个平板型实现ES与它们之间的垫圈，与位于上板的流入和流出端口，通过该细胞悬浮液是通过使用注射器泵^7,8，9灌注。底板的表面可以涂覆有一个相关的细胞单层/基板和下剪切流灌注细胞和表面之间的相互作用，然后探讨^7。然而，PPFC是低吞吐量，试剂消耗，以及相当繁琐的方法，用泡沫形成，泄漏，控制不佳的流量呈现主要缺点。

一种替代技术对传统PPFC是一个多穴板的微流体系统中，根据精确的，计算机控制的剪切流动，允许细胞分析的更高的吞吐量性能（比PPFCs高10倍），具有低试剂消耗^1,10。细胞轧制实验内的微流体通道中进行的，它可以涂覆有细胞单层或工程衬底和成像USI吴显微镜，采用滚动属性，使用适当的软件易于分析。在本研究中，我们证明此多孔板的微流体系统的通过研究人早幼粒白血病在不同的表面（HL-60）细胞的滚动性能的能力。 HL-60轧像P-和E-SEL，以及对表达不同的轧制受体细胞单层，分析底物。此外，抗体（抗体）阻断被用于证明特定选择素介导的那些表面上的HL-60的滚动运动的直接参与。轧制实验，以增加吞吐量进行的，在稳定的剪切流动，以最少的试剂/细胞消耗，从而允许键滚动参数，如轧制速度，轧细胞的数目，并且滚道特性有效的分析。

Protocol

1。细胞培养

1. 人类早幼粒细胞白血病（HL-60）细胞
   1. 培养HL-60细胞在75cm ²培养瓶中用15毫升的Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基（IMDM），补充有20％（V / V）胎牛血清（FBS），1％（V / V）L-谷氨酰胺和1个％（体积/体积）青霉素 - 链霉素。
   2. 通过吸一半的细胞悬液体积和完整的IMDM培养基取代它改变媒体每3天。
   3. 为羧基二乙酸酯，琥珀酰亚胺酯（CFSE）染色，离心机的HL-60细胞悬浮液（400×g离心5分钟），重悬在1μM的CFSE溶液（在PBS中预温制得）并孵育15分钟，在37℃下然后离心细胞，吸出上清，重悬的细胞在新鲜培养基中预热30分钟。在PBS中洗涤细胞，然后用对轧制实验（参见图1B为CFSE染色的HL-60细胞上的P-SEL-涂覆的表面的代表图像）。

注意:CFSE染色是可选的，并在这里提出，以证明在微流体通道的滚动现象。使用标准的明场成像未染色的细胞进行的这个手稿提出轧制参数分析。

2. 肺微血管内皮细胞（LMVECs）
   1. 清漆100毫米培养皿用0.1％明胶溶液（在PBS中的体积/体积）并在37℃下进行至少30分钟。
   2. 在明胶包被的100毫米培养皿中完全内皮细胞生长培养基中培养LMVECs（内皮基础培养基-2（EBM-2）），补充有特定生长添加剂套件，请参阅试剂）。改变媒体在达到80-90％汇合每隔一天和子培养细胞。
   3. 次级培养，在37℃下用PBS洗涤细胞，然后分离细胞用4ml 1X胰蛋白酶-EDTA的3分钟，中和在完整的EBM-2介质的等体积。细胞悬液转移到15毫升管和centrifugE（400×g离心5分钟）。离心后，沉淀重悬在1ml完整内皮的介质，并用血细胞计数器计数细胞。不要过度通道的细胞，因为这会影响他们的形态和功能使用的通道下7只电池的所有实验。

3. 中国仓鼠卵巢-P-选择素（CHO-P）细胞
   1. CHO-P细胞，这是CHO细胞稳定转染表达人类的P-SEL，由合作者（贝斯以色列女执事医疗中心，哈佛大学医学院^）11,12提供。
   2. 文化的CHO-P细胞的T175厘米²瓶25毫升的F-12介质。
   3. 用于传代，洗涤细胞，用10ml的PBS中为4-5秒，然后胰蛋白酶消化在10ml 1X胰蛋白酶-EDTA的为3分钟，在37℃，随后通过中和在完全介质。
   4. 离心细胞悬液（400×g离心5分钟），小心吸出上清液，重悬细胞沉淀1毫升全媒体，并与细胞计数血球。

2。集成多孔板微流控系统的操作

1. 确保所有的设备已正确连接并开启不同的模块:计算机，控制器，倒置显微镜和CCD摄像头。
2. 打开成像软件;确保多孔板模块和成像模块被正确显示在屏幕上。
3. 管子连接到蒸汽疏水阀（连接到控制器），并​​把它们连接到压力接口。
4. 将多孔板在板加热器/适配器。添加试剂到井（在下面描述），并连接接口上的板的顶部。将板成像的自动化阶段。
5. 接口附加到所述板的顶部和施加一个气动压力从控制器到孔的上方，驱动通过所述微流体通道中的流体在定义的流率，很容易地控制使用多井板在手动模式下模块屏幕。
6. 试剂在整个观察区域，位于所述孔之间的通道流动。微流体通道尺寸为350μm宽×70微米高。线性通道的长度为1毫米，通道的底部包括一个180微米的玻璃盖玻片上，这与明场，相位，荧光和共聚焦显微镜兼容。
7. 使用CCD摄像头（流采集，11帧/秒）视频采集，并通过兼容的软件进行分析。

3。微流体通道与蛋白质底物或细胞单层涂层

1. 涂层微流体通道与纤连蛋白或P-/E-selectin
   1. 制备将1ml 20微克/毫升纤连蛋白在PBS中的溶液。基于信道要被涂敷的数量（使用25-50微升每通道的纤连蛋白）改变音量。
   2. 加入25-50微升的纤维连接蛋白的解决方案，以每口井。申请的2达因/厘米²的剪切力5分钟灌注的通道。请注意，液体出现在出口以及胎圈。孵育在室温下30-45分钟
   3. 吸从孔中的溶液（不要直接从中间的圆圈，饲料通道吸^）1,13。加入200-500微升PBS为出口良好，通过施加2达因/厘米²的剪切流5分钟洗净通道用PBS。该频道现在正确涂有纤维连接蛋白，随时可以使用。
   4. 涂布用的P-或E-SEL，制备5μg/ ml的溶液在PBS中的所希望的人重组蛋白，和外套，如上所述，用1小时培养，在37℃，以允许表面涂层的通道。
2. 创作的微流体通道内的CHO-P或LMVEC单层
   1. 轻轻的胰蛋白酶消化细胞从培养皿中3分钟，淬火用完全介质和离心机的2倍体积（5分钟，在400×g离心）。悬浮细胞10毫升全媒体和离心机（5分钟400 XG）agaiÑ​​。
   2. 计数细胞，以确定在悬浮液中的细胞浓度。以确保形成一个融合LMVEC单层的通道内，使细胞浓度为15〜20百万个细胞/ ml。对于一个铺满的CHO-P的细胞单层，用50-60百万细胞/ ml。用25-50微升细胞悬浮液为每个信道的 - 用于实验据此确定初始细胞数。
   3. 添加25-50微升细胞悬浮液中的适当的浓度，以进井。将板在显微镜载物台上，并引入细胞进入通道（2达因/厘米^2），直到细胞中观察到的画面充满整个通道上，然后停止流动。
   4. 用200微升的要么是完全LMVEC或CHO媒体既填补出口和入口。让细胞沉淀，坚持3个小时的孵化器_{（37℃，5％CO2）。}
   5. 继3小时培养，洗净通道与全媒体（2达因/厘米^2，10〜15分钟），除去独立的细胞。电池现在应该会出现完全融合和渠道，现在可以使用了。取决于初始细胞接种密度，可能需要额外的2-3小时的稳定时间，以确保该表面的完全覆盖的细胞。

4。 LMVEC促炎性激活和P-/E-selectin的抗体阻断

1. 在LMVEC基础培养基制备以下的TNF-α溶液（10纳克/毫升）。
2. 以诱导炎症活化LMVEC在通道中，添加100微升的TNF-α溶液的入口以及与通过施加2达因/厘米²的剪切流5分钟，该溶液引入到通道中。对于控制通道（非活化内皮细胞），加入100μl的LMVEC基本培养基的入口以及与引入通道（2达因/厘米² 5分钟）。通道现在可以滚动试验。
3. 要阻止P-SEL和LMVECs和CHO-P细胞的E-SEL，引入中和P-SEL（克隆AK4，5微克/毫升巴中SAL媒体）或E-SEL（克隆P2H3，5微克/毫升的基础培养基）抗体的进入通道，并培育1小时，在37℃下接着，用基础培养基洗涤通道（2达因/厘米^2，5分钟）。渠道现在已经准备好了轧制试验。

5。 HL-60轧含量对基板/细胞单层包覆的微流体通道

1. 仔细检查显微镜下通道，以确认信道被适当地涂覆（在涂层与细胞的情况下，一个完全汇合的细胞单层，应观察到的）。
2. 以制备的HL-60细胞悬浮液的轧制实验，离心机的HL-60细胞悬浮液（5分钟，在400×g离心），并用基础培养基洗涤一次。计数细胞，重悬在IMDM（基本培养基，含Ca ^{2 +，Mg 2 +}的）来创建一个HL-60细胞悬液500万细胞/ ml。用25-50微升的细胞悬浮液对每个信道进行轧制试验。
3. 加入25-50微升细胞suspe的nsion到出口良好，现浇板温度控制的板夹（37°C）和里面的地方显微镜舞台上。接着，通过施加2达因/厘米²的剪切力（细胞应在10-15秒从出口到入口流被观察到的）引入细胞进入通道。
4. 检查轧制响应作为剪切应力的函数，减少剪切到0.25达因/厘米^2，并获得20-30秒的视频（使用"流采集"功能）在每个所需的剪切力（从0.25逐渐增加剪切高达5达因/厘米^2，它也可以使用较高的剪）。
5. 使用CCD摄像头（流采集，11帧/秒）视频采集，并通过兼容的软件分析滚动路径和滚动速度。

6。流式细胞术检测表达表面分子

1. 以下胰蛋白酶消化，制备所需的细胞类型（HL-60，CHO-的细胞悬浮液（使用1-2×10 ⁵细胞/样品）P或LMVECs）的PBS（ - / - ），补充有2％FBS中。洗涤细胞两次，并把样品体积至50μl（使用相同的缓冲液中）。
2. 孵育各样品具有所需荧光团共轭抗体（参见详细信息附表），在4℃下进行20分钟（用铝箔覆盖）。
3. 洗涤细胞两次（相同的缓冲区），并把染色的细胞悬浮液终体积为200微升。使用流式细胞仪来检测表面分子的表达分析的样品。

Results

HL-60细胞滚上的P-和E-选择素面，但不能在纤维连接蛋白

HL-60细胞被认为是金标准"辊"，因为它们表达多种归巢的配体，包括轧制配体的P-SEL糖蛋白配体-1（PSGL-1）和唾液酸-路易斯X（SLEX）的^5,14（ 图1A ）。表面蛋白PSGL-1作为一个支架的四糖SLEX，介导特异性相互作用与P-和E-SEL，这是炎症^5,6,15中上调的内皮。为了测试多穴板的微流体系统的功能，许多微流体通道均具有不同的底物和HL-60细胞的轧制相互作用的那些表面进行分析同时涂布。 HL-60细胞显示出强大的滚动行为上的P-SEL-涂覆的表面上，细胞首先从流捕获，随后是截然不同的滚动运动。 如图1C所示 ，并且由耳鼻喉科与文献，HL-60细胞表现出对E-SEL表面类似的滚动行为，尚未对纤维连接蛋白包被的基质^14,16-19。细胞的速度，通过兼容软件进行分析，作图对剪切应力，表现出细胞的鲁棒轧制响应P-和E-SEL以1-12微米/秒之间的平均速度。

Discussion

其中外源性细胞为基础的治疗成功翻译的主要挑战是无法有效地提供细胞损伤和炎症，高效率的植入³的站点。细胞轧制代表在细胞归巢的过程中的一个关键步骤，促进血管壁上的细胞的减速，通过血管内皮细胞进入组织⁵最终导致其牢固粘附和轮回。轧制过程中对候选小区类型的更好的理解可能导致的技术的开发，提高细胞的归巢和朝着改善的基于细胞的疗法显著贡献。

PPFC是一种广泛使用的工具，以探索在剪切下的流动池轧制，以及其它细胞的行为。 PPFC的审查中性粒细胞粘附于血管内皮细胞的应用是首次研究了劳伦斯等人于1987年，从那时起市售生产TS已经开发了^8,9。 PPFCs包括通过控制所述腔室⁷的尺寸的垫圈隔开的两个平坦的板。上板包含一个流入和流出端口，它通过使用注射器泵使细胞悬浮液的灌注通过室^7,8。还有应用于负压（真空），以保持板压在一起⁷额外的端口。虽然平行板流动腔已经被有效地用于研究细胞反应，包括细胞轧制，剪切流动条件下，有许多限制，降低其有效性。流室的一个...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
人肺微血管内皮细胞	Lonza	CC-2527
表达 P-选择素的中国仓鼠卵巢细胞 （CHO-P）	Barbara Furie 博士的善意礼物11,12
HL-60 细胞	ATCC	CCL-240
细胞培养试剂
内皮基础培养基	Lonza	CC-3156
EBM-2 培养基	Lonza	CC-3156
内皮基础培养基补充剂	Lonza	CC-4147
EGM-2 MV 单引号	Lonza	CC-4147
IMDM - Iscove 改良 Dulbecco 培养基 1x	Gibco	12440
F-12 （1x） 营养混合物（火腿）	Gibco	11765-054
青霉素链霉素 （P/S）	Gibco	15140
L-谷氨酰胺 （L/G） 200 mM	Gibco	25030
胎牛血清 （FBS）	亚特兰大生物制剂	Sa550
培养皿	BD Falcon	BD-353003
100 mm 细胞培养皿，经组织培养处理的聚苯乙烯
离心管（15 ml 聚丙烯锥形管）	MedSupply Partners	TC1500
T75 培养瓶	BD Falcon	353136
明胶溶液 （2%）	Sigma	G1393
dPBS（不含氯化钙和氯化镁）	Sigma	D8537
胰蛋白酶-EDTA 溶液 （10x）	Sigma	T4174
抗体
抗 hE-选择素/CD62E	R& 抗体D Systems	BBA21
FITC 偶联小鼠 IgG1	R&D Systems	BBA21
抗 hP 选择素	R&D Systems	BBA34
FITC 偶联小鼠 IgG1	R&D Systems	BBA34
FITC 小鼠 IgG­1 κ同种型对照	BD Bioscience	555748
抗 SLeX /CD15s 抗体，克隆：5F18	Santa Cruz	SC70545
FITC 偶联	Santa Cruz	SC70545
正常小鼠 IgM-FITC 同种型对照	Santa Cruz	SC2859
PE 小鼠抗人 CD162，克隆：KPL-1	BD Pharmingen	556055
PE 小鼠 IgG1 k 同种型对照	BD Pharmingen	550617
抗 P-选择素抗体 （AK4）	Santa Cruz	SC19996
抗 E-选择素抗体，克隆 P2H3	小米	MAB2150
IgG1 同种型对照	Santa Cruz	SC3877
其他试剂
重组人 TNF-α	PeproTech	300-01A
细胞痕量 CFSE 细胞增殖试剂盒 - 用于流式细胞术	Invitrogen	C34554
人 P-选择素-FC 重组蛋白	研发D Systems	137-PS-050
人 E-选择素-FC 重组蛋白	R&D Systems	724-ES-100
人纤连蛋白，血浆	Invitrogen	33016-015
设备
Bioflux 1000	Fluxion Biosciences	Bioflux Montage 是用于运行实验和分析数据
BioFlux 48 孔板	Fluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow细胞仪	BD Bioscience	CFlow Plus 是用于运行实验和分析数据
尼康 Eclipse Ti-S	尼康
CoolSnap HQ2 CCD 相机	光度学