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利用平板扫描仪采集拟南芥根向重力反应的高分辨率时间序列图像

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DOI：

10.3791/50878

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2014年1月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Doane College, 2Department of Physics, Doane College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用市售平板扫描仪快速采集拟南芥幼苗对重力刺激响应图像的方法。该方法能够以较低成本大量获取高分辨率图像，适用于后续分析算法处理。

摘要

生物学研究日益需要采用能够大量收集高分辨率数据的方法。实验室可能面临的一个挑战是如何开发并获得这些方法。观察研究基因功能的实验室所关注过程中的表型，是其典型目标，而这一目标通常通过成像来实现。一个特别适合利用成像技术进行观察的过程是：当幼苗根部偏离重力矢量方向后，其发生的纠正性生长。用于测量根部向重力性反应的成像平台可能价格昂贵、通量相对较低，或需要大量人力。这些问题已通过开发一种高通量图像采集方法得到解决，该方法使用成本低廉但分辨率高的平板扫描仪。利用此方法，可每几分钟以4,800 dpi的分辨率获取一次图像。当前的设置每天可收集216个独立的反应数据。所获得的图像数据质量足以满足图像分析应用的需求。

引言

采集高分辨率的表型数据在旨在理解遗传与环境相互作用如何介导生物体功能的研究中具有重要意义1,2。此类研究本身通常规模较大，因此在该背景下用于测量表型的方法还需具备高通量特性3,4。在建立面向表型组学规模的研究方法时，通量与分辨率之间存在权衡。通量较高的方法往往分辨率较低，从而更难检测到遗传或环境的微小效应5。相反，能够更精确测量目标表型的方法通常通量较低，难以广泛评估遗传和环境的影响。此外，人工量化表型的方法（包括视觉观察）可能因人类感知差异而引入变异6。

成像技术在获取表型观察结果时，能够在通量和分辨率之间提供有效的桥梁作用7-9。通常情况下，图像相对容易获取，有利于提高通量；当分辨率足够高时，可以检测到细微的表型变化1,2,7。成像技术通常可针对特定的研究系统或过程进行调整，并且普遍具有可扩展性10-12。因此，成像技术非常适合用于开展大规模的生物体功能研究。

主根对重力刺激的响应是一个复杂的生理过程，发生在形态结构简单的器官内。该响应涉及信号通路的激活，这些信号在根器官内传播，其进程受环境和遗传因素共同调控，包括受环境影响的遗传因素12-14。主根对重力刺激的响应研究至少可追溯至达尔文时代，但关于其作用机制，特别是在早期信号事件以及介导响应可塑性的因素方面，仍有许多未知之处12,14,15。深入理解该响应的动态过程，对于探索提高幼苗在特定环境中成功定植能力的方法具有重要意义16。此外，根的形态特征使其适用于图像处理技术的应用8,12,17。综上所述，根的向重力性响应是开发高通量成像技术的理想体系，可用于开展生物体功能的基因组水平研究。

本报告介绍了一种利用廉价且市售的平板扫描仪，对根的向重力反应进行高通量、高分辨率图像采集的方法。该实验方案的总体流程见图1。将种植在琼脂平板上的幼苗置于垂直放置的平板扫描仪上，扫描仪配备定制的有机玻璃平板支架。每几分钟在4,800 dpi分辨率下采集一次图像，并保存至本地驱动器或数据服务器。每组图像相关的元数据存储于数据库中，随后对存储的图像进行处理。该方法采用VueSCAN软件进行图像采集。VueSCAN可在Windows、Mac或Linux操作系统上驱动超过2,100种不同型号的扫描仪（参见材料表）。本应用采用4,800 dpi的扫描分辨率，以与先前使用固定CCD相机研究所达到的分辨率保持一致1,8,12。由于VueSCAN软件具有高度灵活性，并且对所支持的各类扫描仪均采用统一的操作界面，用户可轻松地将几乎任何具备足够分辨率的扫描仪硬件应用于本文所述的实验方案。目前的通量可实现每天采集216个独立的反应数据。 该技术具有良好的适应性和可扩展性，适用于从中学到研究型大学各级科研机构。此外，所采集的图像质量足以满足图像分析应用的需求。

方案

1. 图像采集方案

注意事项：

该实验方案由两人协作完成效率最高，但单人操作也是可行的。本实验室中效果最佳的安排是：一人负责准备用于扫描的平板，另一人同时进行扫描仪的设置，随后两人共同将平板放入扫描仪并启动扫描过程。

还需注意，本项目中使用的扫描仪为垂直放置，扫描仪盖位于扫描仪后部。已定制一个支架，用于在该垂直位置固定培养皿，并使用 3M Command 贴条将其固定在扫描仪平板表面（图2）。本方案所用扫描仪（Epson V700）附带的可拆卸文档盖，其一侧衬有黑色毛毡。使用弹力绳将文档盖固定在平板扫描仪上，以固定培养板并提供图像对比度（图3）。

任何具有足够分辨率的扫描仪均可用于图像采集。选择爱普生Perfection V700是因为其方形外形（便于垂直放置）、高分辨率，以及能够从扫描仪床面和上盖进行扫描并使用红外通道的附加功能。本实验方案未使用这些附加功能。

一旦将培养板从生长室中取出，必须立即继续执行方案直至结束。

培养板制备

使用标准的培养皿，每皿中含10 ml 透明培养基，并在每个平板中央区域种植9粒种子。有关平板标记、培养基制备和种植的操作步骤可参见：http://www.doane.edu/doane-phytomorph

  1. 取出第一个琼脂平板，用无尘纸（Kimwipe）吸干平板盖子及盖子边缘收集的冷凝水。
  2. 用无尘纸将Triton X-100（一种去垢剂）涂抹在盖子上——用量要充足。
    （注意：Triton X-100有助于防止平板在扫描过程中盖子上产生冷凝水。充分涂抹（足以在盖子表面形成一层薄膜）可确保整个扫描过程中盖子始终保持透明。）
  3. 用微孔胶带（micropore tape）将平板包裹，以固定盖子并允许通风。

扫描仪设置与图像采集

本方案假定使用了多台扫描仪，并提供从一台计算机启动多台扫描仪的操作说明。

  1. 为存储每个扫描仪的图像创建文件夹。每个扫描仪将放置两块培养板，因此在创建文件夹时需考虑这一情况。可以考虑将元数据作为文件名的组成部分，例如每块培养板的唯一编号、幼苗年龄、种子大小以及所种植品系的编号。在数据收集中，一个包含上述元数据的文件夹命名示例如下 "1652-2-sm-9-92-17-1653-2-lg-88-79-161".
  2. 为指定收集时间设置出水口定时器（本实验室使用9小时）。确保额外预留准备时间（约1小时）。
    （注意，扫描仪应插入带定时器的电源插座，以便设定采集时间。虽然 VueScan 软件允许用户重复采集图像，但无法设置采集图像的数量或采集时长。）
  3. 打开第一台扫描仪，等待约10秒，使扫描仪完成初始预热。
  4. 打开 VueScan 程序一次。本实验方案使用的是 VueScan 9.0.20 版本（见材料表），但更新的版本也可使用，且几乎无需修改。请确保已按下用户界面底部面板上的“更多”按钮，以显示下述菜单选项。
  5. 设置 自动重复下拉框到 无 在……之下 输入 标签和下方 作物 标签组 预览区：用于 最大值 (图4）。点击“预览”。
  6. 使用鼠标在预览图像上点击并拖动，创建一个裁剪框以捕获目标区域。可对目标区域的设置进行调整。 作物 裁剪框通常使用的设置参数为: x偏移量0.675，y偏移量1.924英寸，但根据每台扫描仪的具体情况进行了调整，以完整捕获幼苗区域。所使用的裁剪框尺寸为宽7.246英寸、高1.1英寸（图5).
  7. 移动裁剪框时，按住 shift 键并用鼠标拖动。确保裁剪框包含所有待扫描的幼苗，以及标签上可能包含的任何所需元数据图5).
  8. 在……之下 作物 标签，设置 预览区域： 到 裁剪框 并点击“预览”。
  9. 前往 输出 选项卡并为扫描仪选择正确的文件（图5).
  10. 对一台计算机上的所有扫描仪重复执行步骤 1.7–1.12。选择 是 当询问是否打开多个 VueScan 实例时，选择相应选项。
  11. 逐一检查每个选项卡，确认设置正确。（注意：所有参数均可根据各实验室的具体需求进行调整，包括图像颜色、分辨率） 等等然而，由于 VueScan 软件具有通用接口，本方案中使用的设置可直接应用于特定实验室的扫描硬件。请参考所附的参数列表，查看本项目中使用的具体参数（使用 VueScan 版本 9.0.20）。
  12. 在……之下 输入 标签选择 连续的 在 自动重复： 字段，或根据需要选择更长的图像采集时间间隔。时间间隔是指扫描仪在保存上一幅图像后，到开始采集下一幅图像前暂停的时间长度。在 连续的 模式下，在4,800 dpi时可获得3-4分钟的分辨率。
  13. 对连接到同一台计算机的其余扫描仪重复步骤 1.14–1.15。
  14. 将准备好的培养皿放入正确的扫描仪中，并使幼苗水平放置（避免重力刺激）。
  15. 将黑色毛毡背景暂时贴在平板上，以防止其从聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）模板上掉落。对所有扫描仪重复此步骤。
    (注意：在本项目中，为防止反光并增强根组织的对比度，在设备附带的文件封面贴上了黑色毛毡。具体使用的背景颜色将取决于被成像组织的颜色。
  16. 一人将培养皿旋转90°（本方案中为逆时针方向），并立即更换毛毡背景。
  17. 另一个人应站在计算机旁，以便能够立即按下 扫描 按钮。
  18. 使用弹力绳将扫描仪背景固定图3）。一人固定背景板，另一人安装弹力绳。
    (注意：重力刺激后（将培养板旋转90°）并放置毛毡背景后，应立即点击“Scan”（扫描）。
  19. 在单台计算机上对剩余的扫描仪重复执行步骤 1.17–1.21。
  20. 如有必要，对下一组扫描仪重复执行步骤 1.6–1.22。
  21. 在采集到若干图像以确认其正确保存之前，请勿离开扫描仪。
  22. 将扫描仪置于在指定扫描时间内无干扰的区域最为理想。同时，应审慎考虑扫描区域的环境条件，以确保获得理想的表型响应。
  23. 数据采集完成后，按下每个与扫描仪对应的 VueScan 窗口中的绿色中止按钮。
  24. 关闭计算机上的所有程序。
  25. 重启计算机并在开始下一轮图像采集前关闭所有扫描仪。

结果

代表性图像

该方法能够快速生成拟南芥幼苗生长的高分辨率时间序列图像。图7A和图7B展示了扫描仪一次运行的首尾图像。图7C和图7D展示了完整扫描图像一半区域的最优结果。图7A和图7B中显示了一些可能影响图像质量的问题，包括种子萌发的差异、运行开始时幼苗生长轨迹的差异，以及扫描过程中冷凝水的积聚。通过增加涂抹在培养皿盖内表面的Triton X-100用量，可在很大程度上解决冷凝问题。其他可能影响图像准确采集的因素包括：裁剪框相对于培养皿位置的配置不正确，以及培养皿放置时相对于裁剪框发生倾斜。

图像分析应用：图像压缩
在获取一系列扫描图像后，必须以可网络访问的安全方式存储，以便进行图像分析。单次扫描运行所产生的图像文件会占用大量硬盘空间。以 4,800 dpi 分辨率采集的一幅 TIFF 文件约为 220 MB，而一次典型的扫描运行通常生成 200 个图像文件，因此每次运行约需 44 GB 的硬盘空间。为了降低图像分析过程中与存储和网络传输相关的成本，有必要在尽量减少数据丢失的前提下，减少存储图像数据所需的空间。后续分析将涉及识别实验运行中连续图像文件里的每一株幼苗，因此，从扫描图像中分割出单株幼苗可促进后续分析。由于将幼苗从图像其余部分分割出来还能显著减少对无用背景像素的存储，该方法也可大幅降低数据量。此外，若后续分析聚焦于根组织，则可能无需保留颜色信息，因为根部像素在其色彩空间中范围较窄。目前已开发出一套计算机图像处理流程与代码，通过分割出单株幼苗并将图像转换为灰度图，实现数据量的压缩。该方法可使存储空间需求减少 60%。

实现此数据压缩所采用的工作流程如下所述：

  1. 将扫描仪图像文件的时间序列统一存放在一个文件夹中。
  2. 对每幅图像，将其从 RGB 模式转换为灰度图像（图8，顶部）。
  3. 将图像分割为左侧和右侧两部分。
  4. 从图像中提取每株幼苗，并保存为独立的文件（图8）。具体操作为：应用阈值将像素转换为黑色或白色，然后计算每行图像的总像素强度。确定强度最高的行，并根据邻近像素的强度将该行中每个像素分类为“植株”或“非植株”。找到该行中每个“植株”的中心位置，并以此为中心，按预设尺寸裁剪出图像区域（图8，底部）。
  5. 为图像的每一侧（左侧和右侧）分别创建独立文件夹，并为每株幼苗建立单独的子文件夹，用于存储各自的时间序列图像文件。
  6. 将生成的文件夹归档为一个压缩的 ZIP 文件。

已使用编程语言 Python20 开发出实现上述步骤的代码。该算法可将数据量减少约 60%，并在迄今分析的 90% 扫描图像文件中成功识别出所有单株幼苗。这些代码依据 GNU 通用公共许可证第 3 版免费提供下载（见材料表）。

种子萌发追踪；示意图；垂直培养皿生长、扫描、数据存储、图像分析。
图1. 扫描流程从种子播种（每板最多九粒拟南芥种子）开始，到数据存储和图像处理结束。点击此处查看高清图像。

Plexiglas design diagram with circle diameters and dimensions, featuring measurement annotations.
图2. T培养皿支撑架的构建模板。 Plexiglas 被裁剪成宽度适合平板床（此处为 227 mm），长度为 128 mm。从剩余材料上切割出两个直径为 88 mm 的圆孔，沿支撑板的宽度和长度方向均匀分布。使用 3M Command® 条带将支撑板固定在平板床上。 单击此处查看大图.

静态平衡，ΣF=0，装置示意图，通过机械装置演示力的平衡。
图3. 幼苗经过重力刺激处理且文档盖板已定位后的扫描仪配置。 此为“扫描仪设置与图像采集”步骤1.21中的扫描仪配置。点击此处查看大图。

扫描仪设置界面；输入和裁剪选项的对话框；数字图像处理。
图 4. 扫描仪设置与图像采集第 1.8 步所选设置的屏幕截图。点击此处查看高清图像。

扫描校准软件界面示意图，显示裁剪尺寸、偏移设置和预览可视化。
图 5. 扫描仪设置与图像采集步骤 1.9 和 1.10 中 VueScan 软件的屏幕截图。 红框标示出裁剪区域的尺寸，蓝框标示出用于捕获幼苗和标签信息的 x 和 y 方向偏移的具体设置。预览区域中以虚线显示将要扫描的平板区域。点击此处查看大图。

扫描软件设置、默认文件夹选择对话框；用户界面教程；文件管理。
图6. 扫描仪设置与图像采集第1.12步的目标文件夹选择。 点击默认文件夹对话框旁的 @ 按钮（红色箭头所示），用户可选择合适的目标文件夹。 点击此处查看大图。

种子萌发实验结果；四图对比，显示在琼脂平板上的根系生长模式。
图7 (A-D)。 上述图像为采用本文所述方法采集的示例。 图中A、B和C、D分别为单次扫描周期的初始与最终图像。A、B显示了完整的扫描区域，而C, D为扫描区域的裁剪部分，展示单个平板。可观察到若干不一致现象。图A显示种子萌发及生长轨迹存在差异。图B（与图A为同一批幼苗，9小时后）显示平板可能产生冷凝水。图C和D因幼苗生长健壮且整个实验过程中图像质量良好，被视为理想结果。点击此处查看高分辨率图像。

幼苗生长比较；萌发实验结果；不同条件下的生长阶段。
图8. 所开发的图像压缩算法将扫描图像转换为灰度图像（上方）。将图像分为左右两半，并去除图像边框（未显示）。通过寻找像素总强度最大的行，确定每半部分中单个幼苗的位置。这些位置用于定义新的裁剪区域，并应用于培养皿中的所有幼苗（下方）。 点击此处查看高清图像。

讨论

准确的表型观察对于理解基因功能在生物体内的表现至关重要。获取表型信息的一种方法是采集高分辨率的图像数据。所开发的基于扫描仪的平台能够在数小时内以高分辨率（4,800 dpi）采集大量图像（每次扫描周期可获取200幅图像）。此外，由于VueSCAN软件具有通用接口，可支持数千种不同型号的扫描仪，该平台可轻松适应多种实验室和课堂教学环境18。

本文介绍的方法填补了高通量图像采集技术的空白，该技术可适用于大规模表型分析设施，也可在单个实验室中实现自动化系统。目前可用的高通量平台通常采用专用成像硬件，包括安装在机器人支架上的相机，用于获取植物地上部分组织的高分辨率图像（例如，植物整合技术中心和LemnaTec公司的Scanalyzer HTS）20,21。此外，已开发出基于X射线和磁共振成像（MRI）技术的专用成像系统，可在土壤环境中以极高的分辨率对植物地下组织进行成像（例如，植物整合技术中心）11,22,23。然而，这些更专业化技术的发展通常以通量降低为代价，使得动态表型研究更加困难。更重要的是，这些高端平台的成本高昂且基础设施需求复杂，使其在小型实验室中难以实施。

还开发了一些平台，采用更标准的图像采集技术，非常适合测量根系对重力刺激等动态响应。例如，已使用CCD相机以高空间和时间分辨率捕捉单个幼苗对光和重力刺激的响应1,8,12。此外，还开发了其他系统，可从单幅图像中同时测量多条根尖的取向（例如iPlant协作项目开发的RootTipMulti）17,24。在前一种情况下，由于每台相机每次仅成像一株幼苗，通量相对较低；而在后一种情况下，通量较高，但通常以牺牲分辨率为代价。

本文所述方法提供了一个利用广泛可得且相对经济的设备与软件进行高通量、高分辨率成像的平台。采用该系统，一个配备六台扫描仪的实验室每周可采集1,080个独立的根系响应数据。在为期15个月的研究中，平均每周采集864个独立样本，共扫描了41,625株幼苗，用于基因组学研究。约15%的样本采集失败，原因包括设置错误、网络故障或设备故障；另有22%的样本因种子未萌发或根系生长不足而无法产生可检测的生长响应。最终数据集包含来自163个重组自交系和99个近等基因系的27,475个幼苗个体对重力刺激的响应结果。所有数据均在同一个实验室采集，表明该方法具有极高的通量。尽管所用设备成本较低，但在高强度使用条件下已稳定运行两年以上。

尽管本方案对该研究团队的研究目标非常有用，但仍存在一些局限性。由于每天会产生约 50 GB 的未压缩图像数据，显然需要大量存储空间来保存这些图像，除非能够开发出有效的压缩方案。存储问题最初通过为每台计算机购买外接硬盘得以暂时解决，此外还购置了两台 10 TB 的网络附属存储设备。随后，如上所述开发了压缩算法，可将数据量减少多达 60%（图 8）。需要注意的是，将数据保存到网络附属存储设备的速度取决于网络连接的速度。同时，由于需要避免图像数据丢失，压缩方案的应用也受到一定限制。

针对基于扫描仪的成像系统，还有一些特定的局限性正在被考虑。例如，在基于扫描仪的方法中，幼苗在每次扫描过程中会暴露于高强度的白光甚至可能包括红外光范围内，这可能会影响幼苗的生长，尽管仍可观察到幼苗对重力刺激产生显著的反应（图7）。未来的一个改进方向可能是对扫描仪进行编程，使其仅激活红外LED。当前正在积极发展的另一个方向是，开发与这些图像数据的分辨率和通量相匹配的分析算法。利用该基于扫描仪的方法生成的大量数据集，非常适合用于开发稳健的高通量幼苗表型分析工具。如图7所示，所采用的图像压缩算法支持这些图像适用于图像分析应用的结论。此外，若以较低分辨率（低于1,200 dpi）采集图像，并在分析前使用上述压缩算法将单个幼苗从图像中分割出来，则这些图像也可由先前发表的算法RootTrace17,24进行分析。在降低至1,200 dpi的图像中可提取根生长数据，而在降低至900 dpi的图像中可提取根尖角度数据（未发表观察结果）。

本文所述方法在根系成像领域具有独特的地位，因其兼具高通量与高分辨率，同时仍具有相对较低的成本。该方法的另一优势在于，可轻松定制以满足特定研究团队的成像需求。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由美国国家科学基金会资助（资助号 IOS-1031416），并与威斯康星大学的 Nathan Miller、Logan Johnson 和 Edgar Spalding，以及内布拉斯加大学 Holland 计算中心的 Brian Bockelman、Carl Lundstedt 和 David Swanson 合作完成。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
爱普生 Perfection V700 照片扫描仪EpsonB11B178011-
有机玻璃扫描模板--定制制作。见图2。
Smart Strap 弹力绑带SmartStrapsWal-Mart 1079478
Brinks 数字户外定时器BrinksWal-Mart 42-1014-2
VueScan 软件Hamrick Softwarehttp://www.hamrick.com
分割软件Chris Wentworth, Doane Collegehttps://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation
3M 微孔胶带Fisher Scientific19-061-655-
固定架--通过将两个饼干架粘合在一起定制制作。

参考文献

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