提取与分析皮质醇从人与猴的毛

Summary

皮质醇（CORT）积聚在人类和非人类灵长类动物的生长的头发轴。我们描述了用于提取和分析头发CORT以高精度和灵敏度的方法。是特别适合用于评估慢性压力过周时期到几个月头发CORT的测量。

Abstract

应激激素皮质醇（CORT）正在慢慢融入人类，非人灵长类动物和其他哺乳动物的生长的头发轴。我们开发并验证了CORT的提取和分析，从猕猴毛发的方法，并随后与人类头发适合使用这种方法。相反，从血浆或唾液获得CORT"点样"，头发CORT提供了一个集成的测量下丘脑 - 垂体 - 肾上腺皮质（HPA）系统的活性，从而生理应激，激素过程中掺入的时期。因为人的头皮头发生长以1厘米/月的平均增长率，从头发段获得CORT水平长度数厘米有可能成为应激经历了数月的生物标志物。

在我们的方法中，每个头发样品首先洗涤两次，在异丙醇中，以从已经沉积的汗或皮脂发轴的外侧除去任何CORT。干燥后，将样品研磨成细粉末，打破了头发的蛋白质基质和增加表面积进行萃取。 CORT从毛发轴的内部被提取到甲醇中，将甲醇蒸发，将提取物重新溶解在测定缓冲液中。提取CORT，随着标准和质量控制，然后由一个敏感和特异的市售的酶免疫测定（EIA）试剂盒进行分析。从环评读数转化为每毫克粉末状毛重量皮克CORT。这种方法已经被用在我们的实验室进行分析头发皮质醇的人类，几种猕猴，狨猴，狗和北极熊。无论是从我们的实验室和其他研究小组已经有很多研究表明头发CORT的广泛适用性评估慢性应激暴露在自然以及实验室的设置。

Introduction

CORT血浆，唾液，或偶尔在尿液或粪便的测量已被用作生理应激自Selye的发现HPA轴中应力的作用¹的索引。虽然众多的论文已发表有关HPA活性，急性紧张的情况下，该领域已经阻碍了缺乏慢性生理应激的一种简单而可靠的指标。这个问题的产生是因为HPA的活动是受昼夜节律变化，可以通过环境干扰羞愧血浆和唾液两者屈服"点"的估计。尿和粪便样品，得到跨越若干小时到一整天在某些情况下，皮质醇和/或代谢物排泄的测量。收集使用任何这些矩阵可以提供CORT水平的粗略综合指数随时间的多个样品的，然而，没有这些方法提供了HPA活性和本学年的响应真正的长期指数干以慢性压力。

头发中测量CORT已经开始填补这一重要的需要在应力文学。几个实验室最初的研究表明CORT在人类毛发的存在，但是并没有调查是否毛发皮质醇水平改变应力²的函数。由于我们的实验室已经拥有多年在恒河猴HPA轴的各种社会和行为因素³的调控，我们开始着手建立和验证提取的恒河猴毛⁴和分析方法。基于的前提是血源性皮质醇缓慢和连续地加入到生长的头发，这种新的方法的目的是要使用的头发源性皮质醇水平的HPA活性的综合指数比周的期间，以月。

有几个方法上的挑战是在开发本议定书遇到的问题。首先，以往的研究表明，少量Øf循环CORT被排泄在汗和皮脂，因此可以涂在头发轴²的外侧。为了消除这种潜在的....

Protocol

1。样品采集和存储

1. 人发
   1. 固定头发进行采样（最高铅笔宽度，直径），用橡皮带或夹子的整个长度。剪下头发紧贴头皮的可能（注意不要刻痕的皮肤），用干净的剪刀。注:标准取样面积是颅骨的后部顶点。
   2. 一些研究者已经报道在人的头发CORT水平的下降与从头皮^6，这可能是由于反复暴露于水和香波⁷被洗出的距离（虽然看Manenschijn 等人 ⁸和Thomson 等人在⁹为相反的结果没有下降段观察），其中为了尽量减少这种潜在的"冲洗效应"的影响，我们建议近端收集头发段的长度不超过3厘米（假设为1厘米/ ¹⁰个月的平均增长速度，更大的头皮3厘米段包包含了C口服补液疗法，已沉积在过去大约3个月）。要做到这一点，用一把尺子来衡量3厘米从第一刀，切再次产生3厘米的样品。注意:一旦头发被切成需要的长度，它不再是必要的，以保持链对齐，除非该研究涉及切割样品放入单独的长1厘米段，建立CORT沉积回顾展在日历的时间段之前的采样^6。
   3. 将头发样品在由铝箔制成，干净的纸信封，或用于样品洗涤的类型的15毫升螺旋盖聚丙烯离心管中的一个小袋。作为CORT是在毛发²极其稳定，样品可无限期地贮存于-20℃，如果需要，在环境温度下运送过夜。
   4. 毛发收集过程应实行志愿者和实践样本应着手全面研究之前进行权衡。注意:....

Results

图1显示了一组人的头发样本（成年男性和女性人类受试者）的代表打印输出使用方法2研磨和萃取处理。计算机软件被用来产生数据输出，并以适合的4参数S形曲线的皮质醇水平（ 图2）。从这个板孔之间的简历介乎0.01-5.73％与1.34％的平均批内CV。来自九个最近的人的头发化验用的QC值是4.41％，批间CV测定。在这个板块分析的37个​​样品产生了一系列从3.1-650皮克/毫克的头发CORT值（中位数为10.2皮克/毫克;平均值±标准差= 36.0±110皮克/毫克）。

方法1用在我们的实验室来处理来自非人类灵长类动物和其他大型动物毛发样本。成年恒河猴毛（主要来自女性）代表法产生了一系列CORT值从50.1-102皮克/毫克（中位数= 75.0;平均值±标准差= 75.8±14.0皮克/毫克）。平均批内CV为这个实验为2.08％，而来自九个最近的猴毛试验使用的QC值是4.63％，批间CV测定。

Discussion

上述的头发CORT手续简单执行，是相对便宜的，利用了现成的化学品，试剂和耗材，需要的设备，有一个例外，很可能是出现在一个典型的分析实验室。唯一的例外是一个研磨装置如球磨机或mini-beadbeater。我们注意到，一些研究小组讳言头发样品切成小碎片大约1毫米的长度为^12，但根据我们的观察，我们建议进行研磨，而不是如果在所有可能切碎。在文献中的方法的变化的另一个领域涉及是否毛发洗之前CORT萃取^13，如果是这样，使用哪种洗涤条件。如果不进行洗涤，再一个风险，该甲醇提取物将包含不仅慢慢在数周或生发月并入CORT而且出汗和/或皮脂源性皮质醇沉积最近的可能性在头发的表面上。研究北极熊样品支持两个CORT部分头发的存在:一个松散结合的可移动部分由完好的头发大概主要是指表面污染简短的异丙醇洗涤，更紧密结合的部分就是由大量的甲醇提取的访问粉状头发样品^14。同样的结论可以从CORT的反复异丙醇洗涤（见引言）从猴子和人的头发中提取的金额递减绘制。另一方面，如果进行水洗，则溶剂的选择和洗涤条件可对所得到的CORT值的显著影响。头发测试协会出版的准则来选择适当的溶剂中，以减少头发从发矩阵的洗.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC 级异丙醇	Fisher	A451
HPLC 级甲醇	Fisher	A452
唾液皮质醇检测试剂盒	盐度学	1-3002	有关检测灵敏度和特异性的信息，请参阅制造商的试剂盒说明书
15 ml 聚丙烯螺旋盖离心管	Max Scientific	10-9151
1.5 mlSafe-Lock 微量离心管	Fisher	05-402-25
2.0 ml Safe-Lock 微量离心管	Fisher	05-402-7
2.0 ml XXTuff 增强型微量样品瓶	BioSpec	330TX	与微型打珠器
3.2 mm 铬钢珠	BioSpec	11079132c	与微型打珠器
10 ml 不锈钢研磨罐	Retsch	02.462.0061	与混合型研磨仪 12
mm 不锈钢研磨球	Retsch	05.368.0037	与混合型研磨仪
Savant 活性炭滤芯	Fisher	DTK120R	与 Savant 化学捕集器 用于
15 ml 离心管的旋转器	Fisher	S02135
离心管旋转器	Fisher	NC9854190
台式离心机 用于微量离心管	Fisher	13-100-675
MM 200 混合型研磨机	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant 制冷型蒸汽阱	Fisher	RVT400-115
Savant 化学捕集阱	Fisher	SCT120	制冷型蒸汽阱替代品
酶标仪
洗板机
微孔板混合器
多通道移液器
分析天平