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方法文章

从人类和猴毛发中提取和分析皮质醇

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DOI：

10.3791/50882

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2014年1月24日

 ,  ,  , 
1Department of Psychology, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst

本文内容

摘要

皮质醇（CORT）会在人类和非人类灵长类动物毛发的生长期中逐渐累积。本文介绍了高精度、高灵敏度提取和分析毛发中CORT的方法。毛发中CORT的测定特别适用于评估数周至数月期间的慢性应激状态。

摘要

应激激素皮质醇（CORT）会缓慢地整合到人类、非人灵长类及其他哺乳动物正在生长的毛发中。我们建立并验证了一种从恒河猴毛发中提取和分析CORT的方法，并进一步将该方法改进用于人类头皮毛发。与从血浆或唾液中获取的CORT"单次样本"不同，毛发中的CORT能够综合反映激素整合期间下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）系统的活动状态，从而体现生理应激水平。由于人类头皮毛发平均每月生长1 cm，因此从数厘米长的毛发段落中测得的CORT水平，有可能作为过去数月内所经历应激的生物标志物。

在本方法中，每份毛发样本首先用异丙醇清洗两次，以去除汗液或皮脂沉积在毛干外部的皮质醇（CORT）。干燥后，将样本研磨成细粉，以破坏毛发的蛋白质基质并增加提取的表面积。毛干内部的皮质醇（CORT）被甲醇提取，甲醇蒸发后，残余物用检测缓冲液重新溶解。提取的皮质醇（CORT）连同样品标准品和质控品，使用一种灵敏且特异的市售酶免疫分析（EIA）试剂盒进行检测。EIA的检测结果转换为每毫克粉末状毛发重量所含的皮质醇（CORT）皮克数（pg/mg）。本实验室已应用该方法分析人类、多种猕猴、狨猴、狗和北极熊的毛发皮质醇（CORT）。来自本实验室及其他研究团队的大量研究已证实，毛发皮质醇（CORT）在自然环境和实验室条件下评估慢性应激暴露具有广泛的适用性。

引言

自Selye发现HPA轴在应激反应中的作用以来，血浆、唾液中皮质醇（CORT）的测定，偶尔也包括尿液或粪便中的CORT测量，已被用作评估生理应激的指标1尽管已有大量论文将下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）活动与急性应激情境相关联，但该领域一直受限于缺乏一种简单且可靠的慢性生理应激指标。这一问题的产生是因为血浆和唾液均能提供 "点" 皮质醇（CORT）活性的估计值会受到昼夜节律变化的影响，并可能因环境干扰而产生混杂。尿液和粪便样本可提供持续数小时至某些情况下长达一整天的CORT和/或其代谢物排泄量的测量结果。通过上述任一基质采集多个样本，可能获得反映一段时间内CORT水平的粗略综合指标；然而，这些方法均无法真正反映HPA轴活动的长期变化，以及该系统对慢性应激的反应性。

检测毛发中的皮质醇（CORT）已开始填补应激研究领域这一重要需求。多个实验室的早期研究证实了人类毛发中存在皮质醇，但未探讨毛发中皮质醇水平是否会随应激状态而变化2。由于我们实验室多年来一直关注各种社会和行为因素对恒河猴下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的调节作用3，我们着手建立并验证从恒河猴毛发中提取和分析皮质醇的方法4。基于血液循环中的皮质醇会缓慢且持续地进入生长中的毛发这一假设，该新方法的目的是利用毛发来源的皮质醇水平作为数周至数月期间HPA轴活动的整合性指标。

在制定本方案的过程中遇到了若干方法学上的挑战。首先，先前的研究表明，少量循环中的皮质醇（CORT）会随汗液和皮脂排出，并可能附着在毛干外表面2。为了消除这一潜在的混杂因素，我们开发了一种温和的清洗程序，该程序似乎能够去除毛干外部的CORT，同时对毛干内部存在的CORT影响极小。因此，经过该程序处理的猴毛（即 以异丙醇进行两次各3分钟的清洗）损失了约7–8%的总毛发CORT含量，第三次清洗仅额外去除了不到1%的类固醇4。人类毛发中似乎含有更多的外源性CORT，因为采用相同程序可使样本平均去除27%的总CORT含量（K. Rosenberg 和 J. Meyer，未发表数据）。然而，与猴毛类似，第三次清洗所去除的CORT含量（约7%）远低于前两次。因此，猴毛和人毛的结果均支持以下观点：大多数（即使不是全部）外源性CORT均可被去除，同时可保留毛干内部基质中大部分的CORT。其次，我们的初步研究还显示，在提取前对毛发进行研磨可显著提高CORT的回收率，这可能是由于破坏了毛干复杂的蛋白质基质结构，并增加了溶剂渗透的有效表面积。我们开发了两种不同的研磨方法，各有优缺点。方法1使用球磨机，其优势在于可产生最细的粉末。然而，球磨机设备相对昂贵，若使用标准研磨罐和研磨球，则一次仅能处理两个样本；此外，使用标准研磨罐时，小样本也难以有效处理。方法2使用振荡研磨仪（beadbeater），其研磨能力相对较弱。因此，与球磨机相比，该方法的平均CORT回收率约低10%（未发表数据）。但另一方面，振荡研磨仪的成本远低于球磨机，根据型号不同可一次性处理16–24个样本，且更适合处理小样本。鉴于上述回收率的差异，建议在同一项研究中所有样本均采用相同的研磨方法。

毛发样本处理完毕后，用甲醇进行提取，并采用一种灵敏且特异的商品化酶免疫分析（EIA）试剂盒检测提取物中的皮质醇（CORT），该试剂盒最初设计用于测定唾液中的CORT。通过实验证明，猴毛发提取物的连续稀释液所得EIA读数与标准品CORT的读数高度平行，部分验证了提取和检测方法的有效性。随后我们进一步证实，毛发中的CORT（除血浆和唾液CORT外）对猴子因行政命令被迫迁入新饲养环境这一重大生活应激源具有敏感性4,5。本文详细描述了我们实验室常规用于处理人和猴毛发样本，以及从中提取和分析CORT的方法。

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方案

1. 样本采集与保存

  1. 人类毛发
    1. 用橡皮筋或夹子固定住待采集的整段头发（直径不超过铅笔粗细）。使用干净的剪刀尽可能贴近头皮剪断头发（注意不要划伤皮肤）。注意：标准采样区域为颅骨枕顶区。
    2. 一些研究者报告了人体毛发中皮质醇（CORT）水平的下降  随着与头皮距离的增加6，这可能是由于反复接触水和洗发水导致的冲洗流失7 （尽管参见 Manenschijn） 等.8 和 Thomson 等.9 对于未观察到节段性下降的相反结果，应尽量减少此潜在影响 "洗脱效应"，我们建议收集靠近头皮、长度不超过3 cm的头发段（假设平均生长速率为1 cm/月）10，一个 3 cm段包含过去约3个月内沉积的CORT）。为实现此目的，使用直尺从第一次切割处测量3 cm，再次切割，以获得3 cm 厘米样品。注意：一旦毛发已被剪至所需长度，除非研究需要将样品进一步切割为多个独立的1厘米段，否则无需再保持毛发纤维的整齐排列。 厘米 长片段以建立采样前一段时间内皮质醇沉积的回顾性时间表6.
    3. 将毛发样本放入铝箔袋、干净的纸信封或15 用于样品洗涤的聚丙烯螺口离心管（规格为 ml）。由于皮质醇（CORT）在毛发中极为稳定2样品可在 -20 °C 长期保存，必要时可在室温下 overnight 运输。
    4. 应在志愿者身上练习毛发采集程序，并在开展完整研究之前对练习样本进行称重。注意：尽管建议采集更大样本，但使用本文所述方法可分析小至5-10 mg的毛发样本。 >10 mg，以尽量降低获得低于最低皮质醇（CORT）标准品浓度的EIA读数的可能性。
  2. 猴毛
    1. 使用标准动物推剪从颈后部剃取毛发（100–250 mg）。尽量贴近皮肤剃毛，注意避免划伤皮肤导致出血，因为血液中的皮质醇（CORT）水平远高于毛发中的含量。注：选择颈部区域进行常规取样，是因为该部位通常毛发充足，且在重复取样前可方便观察毛发再生情况。
    2. 将毛发样本放入铝箔袋或15 带有螺帽的聚丙烯离心管。猴毛样本的储存和运输方式应与上述人发样本所述相同。
    3. 因为猴毛与人类的头发不同，生长到一定长度后便会停止生长11然而，在这种情况下，通常无法利用毛发距皮肤的距离作为CORT沉积的时间日历。但是，如果能够对同一只动物进行多次取样（例如，在定期的常规健康检查期间），建议先进行初次剃毛以确定一个基准时间点，然后在经过所需的时间间隔后，再次对同一区域进行剃毛。第二次样本中的CORT即为此次剃毛至再次剃毛之间的时间段内沉积的，从而可以精确地将样本中的CORT含量归因于该时间段内的HPA轴活动。5.

2. 样品洗涤与干燥

  1. 洗涤
    1. 将每个毛发样本放入一个15 毫升螺口聚丙烯离心管
    2. 加入5 ml高 向每管中加入高效液相色谱（HPLC）级异丙醇，然后使用旋转仪反复倒置混匀3分钟。
    3. 将异丙醇倒入废液容器中，注意不要损失任何样品。
    4. 重复步骤 2.1.2 和 2.1.3 一次。
  2. 干燥
    1. 至少干燥头发2-3天，以确保异丙醇完全挥发。

3. 样品研磨和皮质醇提取——适用于大样品的方法1

  1. 样品研磨
    1. 将最多 250 mg 的干燥毛发放入一个 10 ml 的不锈钢研磨罐中，并加入一颗 12 mm 的不锈钢研磨球。
    2. 使用球磨仪以 25 Hz 的频率研磨样品 6 分钟。
    3. 用分析天平称取最多 50 mg 的毛发粉末，然后转移至洁净的 2.0 ml 聚丙烯微量离心管中，用于后续的 CORT 提取。
  2. CORT 提取
    1. 向含有粉末样品的微量离心管中加入 1.0 ml HPLC 级甲醇。
    2. 盖紧管盖，在室温下使用旋转仪持续翻转孵育 18–24 小时。
    3. 在室温下以 14,000 rpm 离心 1 分钟，使毛发粉末沉淀。
    4. 小心转移 0.6 ml 上清液至一支洁净的 1.5 ml 微量离心管中，注意不要扰动毛发粉末沉淀。

4. 样品研磨和皮质醇提取——小样品的第二种方法

  1. 样品研磨
    1. 将最多 60 mg 的毛发放入已预称重的 2 ml 加强型微量离心管中，用于珠磨。
    2. 重新称量管子以获得样品重量。
    3. 向每个管中加入三颗 3.2 mm 的铬钢珠，然后在珠磨仪中研磨至少 2 分钟。若目视检查发现样品粉碎不充分，可额外再研磨 0.5 或 1 分钟。注意：此步骤无需转移已研磨的毛发，因为皮质醇（CORT）的提取与研磨在同一管中进行。
  2. 皮质醇（CORT）提取
    1. 向含有粉末样品的微量离心管中加入 1.5 ml 高效液相色谱级甲醇。
    2. 盖紧管盖，并在旋转仪上室温下持续翻转孵育 18–24 小时。
    3. 在室温下以 10,000 rpm 离心 5 分钟，使毛发粉末形成沉淀。注意：在提取和离心过程中，铬钢珠保留在管内与毛发一起，因此离心速度较方法 1 更低。
    4. 小心转移 1.0 ml 上清液至洁净的 1.5 ml 微量离心管中，注意不要扰动毛发粉末沉淀。

5. 溶剂蒸发与样品重溶解

  1. 使用真空蒸发仪或氮气流吹干甲醇；若无真空蒸发仪，可使用氮气流。若使用真空蒸发仪，可通过冷阱或配备活性炭 cartridge 的化学捕集装置收集甲醇蒸气。
  2. 除去甲醇后，用适量的EIA分析缓冲液（分析稀释液）重新溶解CORT提取物。若预期CORT浓度较高，则使用0.4 ml或更大的缓冲液体积；若预期浓度较低，则可将体积减少至0.2 ml或更少，以提高检测灵敏度。注意：0.2 ml的体积足以对样品进行至少两次重复测定，以防需要重新检测。
  3. 重新溶解后的样品可立即进行分析，或于-20 °C冷冻保存以备后续检测。注意：若需冷冻保存重新溶解的样品，应避免在冷冻期间发生升华，因为样品体积的改变将导致最终计算时出现错误的CORT值。

6. 皮质醇测定与数据转换

  1. 使用高敏酶联免疫分析（EIA）试剂盒检测毛发提取物中的皮质醇（CORT）。注意：若使用商用唾液CORT EIA试剂盒，除以每份复溶后的毛发提取物的双份等分试样替代唾液样本外，其余操作均按照试剂盒说明书中的厂商建议进行。
  2. 为每次检测制备质量控制（QC）毛发提取物。
    1. 额外采集若干毛发样本，可按照步骤4.1和4.2分别单独处理，或按照步骤3.1和3.2进行混合后的大样本处理。
    2. 蒸发溶剂并按照步骤5.1和5.2重新溶解提取物，然后合并来自多个单独或混合样品的重新溶解提取物。
    3. 分装适量体积的混合重建提取物（例如 0.10 ml 分装至各自的微量离心管中，冷冻保存以备后续使用。
    4. 每个免疫测定微孔板上均需解冻并一式两份地运行一个质控等分试样，以提供参考皮质醇（CORT）值，用于检查每次运行的质量。
    5. 板内变异系数（CV；定义为一组样本值的标准差除以均值）可通过在同一次检测中分析10-12个质控孔来计算，而板间CV则可通过多批次检测中的质控值进行计算。若微孔板读数仪软件已针对代表每份毛发提取物的复孔计算出CV值，则确定板内CV的另一种方法是计算整块板上所有单个CV值的平均值。
    6. 如果任何样本提取物在酶免疫分析（EIA）中的读数高于最高浓度的皮质醇（CORT）标准品，则需取另一份该提取物，用适量的分析缓冲液进行稀释，随后根据稀释倍数校正EIA读数。若复孔间的变异系数（CV）超出常规范围，样本也将被常规性地重新分析。 >10%.
    7. 由于CORT EIA试剂盒旨在测定唾液或血浆等液体样本中的CORT值，因此必须将酶标仪软件的输出结果转换为每单位重量粉末状头发中的CORT含量。以下公式可将检测结果从μg/dl转换为每毫克头发中含有的CORT皮克数（pg CORT/mg头发）：
      (A/B) × (C/D) × E × 10,000 = F
      其中，A = 检测输出结果（μg/dl）；B = 用于提取的毛发重量（单位：mg）；C = 加入粉末状毛发中的甲醇体积（单位：ml）；D = 从提取物中回收并经干燥的甲醇体积（单位：ml）；E = 用于重新溶解干燥提取物的检测缓冲液体积（单位：ml）；F = 毛发皮质醇（CORT）浓度的最终值（单位：pg/mg）。

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结果

图1展示了使用方法2研磨和提取处理的一组代表性人类毛发样本（成年男性和女性受试者）的打印结果。通过计算机软件生成数据输出，并对CORT标准品拟合四参数S型曲线（图2）。该微孔板的孔间变异系数（CV）范围为0.01–5.73%，平均板内CV为1.34%。根据最近九次人类毛发检测的质控值计算得到的板间CV为4.41%。该微孔板上分析的37个样本得到的毛发CORT值范围为3.1–650 pg/mg（中位数 = 10.2 pg/mg；均值±标准差 = 36.0±110 pg/mg）。

方法1用于我们实验室处理非人灵长类动物及其他大型动物的毛发样本。一项针对成年恒河猴（主要为雌性）毛发的代表性检测结果显示，皮质醇（CORT）浓度范围为50.1–102 pg/mg（中位数 = 75.0；均值±标准差 = 75.8±14.0 pg/mg）。该检测的平均批内变异系数（CV）为2.08%，根据最近九次恒河猴毛发检测的质量控制（QC）值计算得出的批间变异系数为4.63%。

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讨论

上述所述的毛发CORT检测方法操作简便、成本相对较低，所用的化学试剂、试剂和耗材均易于获取，所需设备除一种例外情况外，通常在常规分析实验室中均可具备。该例外是一种研磨装置，例如球磨机或微型珠磨器。我们注意到，一些研究小组会将毛发样本切割成大小约1 毫米长度12，但根据我们的观察，如果条件允许，建议采用研磨而非切碎的方式。文献中另一存在方法学差异的方面是，在皮质醇（CORT）提取前是否应清洗毛发。13，以及应使用何种洗涤条件。如果不进行洗涤，则存在这样的风险：甲醇提取物不仅包含在数周或数月毛发生长过程中缓慢掺入的皮质醇（CORT），还可能包含近期通过汗液和/或皮脂沉积在头发表面的CORT。对北极熊样本的研究支持毛发中存在两种CORT组分的观点：一种是通过短暂的异丙醇洗涤完整毛发即可去除的松散结合组分，该组分可能主要代表表面污染；另一种是紧密结合组分，需通过对粉末状毛发样本进行充分的甲醇提取才能获得14同样的结论也可从通过反复异丙醇清洗从猴和人类毛发中提取的皮质醇（CORT）量逐渐减少的现象中得出（参见引言部分）。另一方面，如果进行清洗，则溶剂的选择及清洗条件可能对...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢马萨诸塞大学心理学系的 Kymberlee O'Brien、Celia Moore 和 Edward Tronick 感谢 Boston 提供本研究中分析的人类毛发样本，感谢 Stephen Suomi 和 Amanda Dettmer（美国国立儿童健康与人类发展研究所比较行为学实验室）提供恒河猴毛发样本。本方法的初步开发及后续应用得到了美国国立卫生研究院（NIH）RR11122 项目对 M.A.N. 的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
色谱级异丙醇FisherA451
色谱级甲醇FisherA452
唾液皮质醇检测试剂盒Salimetrics1-3002有关检测的灵敏度和特异性信息，请参见制造商提供的试剂盒说明书
15 ml 聚丙烯螺口离心管Max Scientific10-9151
1.5 ml 安全锁微离心管Fisher05-402-25
2.0 ml 安全锁微离心管Fisher05-402-7
2.0 ml XXTuff 加强型微管BioSpec330TX与迷你珠磨机配合使用
3.2 mm 铬钢珠BioSpec11079132c与迷你珠磨机配合使用
10 ml 不锈钢研磨罐Retsch02.462.0061与混合研磨仪配合使用
12 mm 不锈钢研磨球Retsch05.368.0037与混合研磨仪配合使用
Savant 活性炭滤芯FisherDTK120R与 Savant 化学捕集阱配合使用
适用于 15 ml 离心管的旋转仪FisherS02135
适用于微离心管的旋转仪FisherNC9854190
用于微离心管的台式离心机Fisher13-100-675
MM 200 混合研磨仪Retsch20.746.0001
Mini-Beadbeater 16 BioSpec607
Savant DNA 快速真空浓缩仪FisherDNA120-115
Savant 制冷式蒸汽捕集阱FisherRVT400-115
Savant 化学捕集阱FisherSCT120可替代制冷式蒸汽捕集阱
酶标仪
洗板机
微孔板混匀仪
多通道移液器
分析天平

参考文献

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