从人类和猴毛发中提取和分析皮质醇

摘要

皮质醇（CORT）会在人类和非人类灵长类动物毛发的生长期中逐渐累积。本文介绍了高精度、高灵敏度提取和分析毛发中CORT的方法。毛发中CORT的测定特别适用于评估数周至数月期间的慢性应激状态。

摘要

应激激素皮质醇（CORT）会缓慢地整合到人类、非人灵长类及其他哺乳动物正在生长的毛发中。我们建立并验证了一种从恒河猴毛发中提取和分析CORT的方法，并进一步将该方法改进用于人类头皮毛发。与从血浆或唾液中获取的CORT"单次样本"不同，毛发中的CORT能够综合反映激素整合期间下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）系统的活动状态，从而体现生理应激水平。由于人类头皮毛发平均每月生长1 cm，因此从数厘米长的毛发段落中测得的CORT水平，有可能作为过去数月内所经历应激的生物标志物。

在本方法中，每份毛发样本首先用异丙醇清洗两次，以去除汗液或皮脂沉积在毛干外部的皮质醇（CORT）。干燥后，将样本研磨成细粉，以破坏毛发的蛋白质基质并增加提取的表面积。毛干内部的皮质醇（CORT）被甲醇提取，甲醇蒸发后，残余物用检测缓冲液重新溶解。提取的皮质醇（CORT）连同样品标准品和质控品，使用一种灵敏且特异的市售酶免疫分析（EIA）试剂盒进行检测。EIA的检测结果转换为每毫克粉末状毛发重量所含的皮质醇（CORT）皮克数（pg/mg）。本实验室已应用该方法分析人类、多种猕猴、狨猴、狗和北极熊的毛发皮质醇（CORT）。来自本实验室及其他研究团队的大量研究已证实，毛发皮质醇（CORT）在自然环境和实验室条件下评估慢性应激暴露具有广泛的适用性。

引言

自Selye发现HPA轴在应激反应中的作用以来，血浆、唾液中皮质醇（CORT）的测定，偶尔也包括尿液或粪便中的CORT测量，已被用作评估生理应激的指标¹尽管已有大量论文将下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）活动与急性应激情境相关联，但该领域一直受限于缺乏一种简单且可靠的慢性生理应激指标。这一问题的产生是因为血浆和唾液均能提供 "点" 皮质醇（CORT）活性的估计值会受到昼夜节律变化的影响，并可能因环境干扰而产生混杂。尿液和粪便样本可提供持续数小时至某些情况下长达一整天的CORT和/或其代谢物排泄量的测量结果。通过上述任一基质采集多个样本，可能获得反映一段时间内CORT水平的粗略综合指标；然而，这些方法均无法真正反映HPA轴活动的长期变化，以及该系统对慢性应激的反应性。

检测毛发中的皮质醇（CORT）已开始填补应激研究领域这一重要需求。多个实验室的早期研究证实了人类毛发中存在皮质醇，但未探讨毛发中皮质醇水平是否会随应激状态而变化²。由于我们实验室多年来一直关注各种社会和行为因素对恒河猴下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的调节作用³，我们着手建立并验证从恒河猴毛发中提取和分析皮质醇的方法⁴。基于血液循环中的皮质醇会缓慢且持续地进入生长中的毛发这一假设，该新方法的目的是利用毛发来源的皮质醇水平作为数周至数月期间HPA轴活动的整合性指标。

方案

1. 样本采集与保存

1. 人类毛发
   1. 用橡皮筋或夹子固定住待采集的整段头发（直径不超过铅笔粗细）。使用干净的剪刀尽可能贴近头皮剪断头发（注意不要划伤皮肤）。注意：标准采样区域为颅骨枕顶区。
   2. 一些研究者报告了人体毛发中皮质醇（CORT）水平的下降  随着与头皮距离的增加⁶，这可能是由于反复接触水和洗发水导致的冲洗流失⁷ （尽管参见 Manenschijn） 等.⁸ 和 Thomson 等.⁹ 对于未观察到节段性下降的相反结果，应尽量减少此潜在影响 "洗脱效应"，我们建议收集靠近头皮、长度不超过3 cm的头发段（假设平均生长速率为1 cm/月）¹⁰，一个 3 cm段包含过去约3个月内沉积的CORT）。为实现此目的，使用直尺从第一次切割处测量3 cm，再次切割，以获得3 cm 厘米样品。注意：一旦毛发已被剪至所需长度，除非研究需要将样品进一步切割为多个独立的1厘米段，否则无需再保持毛发纤维的整齐排列。 厘米 长片段以建立采样前一段时间内皮质醇沉积的回顾性时间表⁶.
   3. 将毛发样本放入铝箔袋、干净的纸信封或15 用于样品洗涤的聚丙烯螺口离心管（规格为 ml）。由于皮质醇（CORT）在毛发中极为稳定²

结果

图1展示了使用方法2研磨和提取处理的一组代表性人类毛发样本（成年男性和女性受试者）的打印结果。通过计算机软件生成数据输出，并对CORT标准品拟合四参数S型曲线（图2）。该微孔板的孔间变异系数（CV）范围为0.01–5.73%，平均板内CV为1.34%。根据最近九次人类毛发检测的质控值计算得到的板间CV为4.41%。该微孔板上分析的37个样本得到的毛发CORT值范围为3.1–650 pg/mg（中位数 = 10.2 pg/mg；均值±标准差 = 36.0±110 pg/mg）。

方法1用于我们实验室处理非人灵长类动物及其他大型动物的毛发样本。一项针对成年恒河猴（主要为雌性）毛发的代表性检测结果显示，皮质醇（CORT）浓度范围为50.1–102 pg/mg（中位数 = 75.0；均值±标准差 = 75.8±14.0 pg/mg）。该检测的平均批内变异系数（CV）为2.08%，根据最近九次恒河猴毛发检测的质量控制（QC）值计算得出的批间变异系数为4.63%。

讨论

上述所述的毛发CORT检测方法操作简便、成本相对较低，所用的化学试剂、试剂和耗材均易于获取，所需设备除一种例外情况外，通常在常规分析实验室中均可具备。该例外是一种研磨装置，例如球磨机或微型珠磨器。我们注意到，一些研究小组会将毛发样本切割成大小约1 毫米长度¹²，但根据我们的观察，如果条件允许，建议采用研磨而非切碎的方式。文献中另一存在方法学差异的方面是，在皮质醇（CORT）提取前是否应清洗毛发。¹³，以及应使用何种洗涤条件。如果不进行洗涤，则存在这样的风险：甲醇提取物不仅包含在数周或数月毛发生长过程中缓慢掺入的皮质醇（CORT），还可能包含近期通过汗液和/或皮脂沉积在头发表面的CORT。对北极熊样本的研究支持毛发中存在两种CORT组分的观点：一种是通过短暂的异丙醇洗涤完整毛发即可去除的松散结合组分，该组分可能主要代表表面污染；另一种是紧密结合组分，需通过对粉末状毛发样本进行充分的甲醇提取才能获得¹⁴同样的结论也可从通过反复异丙醇清洗从猴和人类毛发中提取的皮质醇（CORT）量逐渐减少的现象中得出（参见引言部分）。另一方面，如果进行清洗，则溶剂的选择及清洗条件可能对.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
色谱级异丙醇	Fisher	A451
色谱级甲醇	Fisher	A452
唾液皮质醇检测试剂盒	Salimetrics	1-3002	有关检测的灵敏度和特异性信息，请参见制造商提供的试剂盒说明书
15 ml 聚丙烯螺口离心管	Max Scientific	10-9151
1.5 ml 安全锁微离心管	Fisher	05-402-25
2.0 ml 安全锁微离心管	Fisher	05-402-7
2.0 ml XXTuff 加强型微管	BioSpec	330TX	与迷你珠磨机配合使用
3.2 mm 铬钢珠	BioSpec	11079132c	与迷你珠磨机配合使用
10 ml 不锈钢研磨罐	Retsch	02.462.0061	与混合研磨仪配合使用
12 mm 不锈钢研磨球	Retsch	05.368.0037	与混合研磨仪配合使用
Savant 活性炭滤芯	Fisher	DTK120R	与 Savant 化学捕集阱配合使用
适用于 15 ml 离心管的旋转仪	Fisher	S02135
适用于微离心管的旋转仪	Fisher	NC9854190
用于微离心管的台式离心机	Fisher	13-100-675
MM 200 混合研磨仪	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA 快速真空浓缩仪	Fisher	DNA120-115
Savant 制冷式蒸汽捕集阱	Fisher	RVT400-115
Savant 化学捕集阱	Fisher	SCT120	可替代制冷式蒸汽捕集阱
酶标仪
洗板机
微孔板混匀仪
多通道移液器
分析天平