小鼠在虚拟现实环境中导航时的双光子钙成像

摘要

本文描述了在虚拟现实环境中对小鼠行为期间进行皮层双光子成像所涉及的实验步骤。

摘要

近年来，双光子成像已成为神经科学中不可或缺的工具，因为它能够在动物行为过程中对遗传学上明确标识的细胞活动进行长期测量^1-6。本文描述了在小鼠穿越虚拟现实环境时，对其大脑皮层进行双光子成像的方法。我们重点关注实验操作中在明亮光照的虚拟环境下对行为动物进行成像的关键环节。本实验设置中存在的关键问题包括：减少与脑组织运动相关的伪影、防止虚拟现实投影系统的光线泄漏，以及降低激光引起的组织损伤。我们还提供了用于控制虚拟现实环境和瞳孔追踪的示例软件。通过这些方法和资源，可将传统的双光子显微镜改造用于行为状态小鼠的实验研究。

引言

双光子钙成像技术（使用基因编码的钙指示剂如 GCaMP5⁷ 或 R-GECO⁸，或合成染料如 OGB 或 Fluo4）已成为在活体小鼠中测量神经元活动的强大方法^1-6。该技术能够以接近单个动作电位的分辨率，同时记录数百个细胞的活动，成像深度可达脑表面下约 800 µm^9,10。此外，利用基因编码钙指示剂（GECIs），可实现对特定基因型细胞类型¹³的神经元活动进行长期、慢性记录^5,11,12。这些方法共同提供了前所未有的时间和空间分辨率，为在体研究神经计算过程开辟了众多新的可能性 in vivo。

为了成像，需要通过外科手术暴露并标记小鼠大脑。通常使用重组腺相关病毒（AAV）系统递送基因编码钙指示剂（GECI），并在注射部位上方植入颅窗，以实现对大脑的光学通路。随后将头部固定杆连接至颅骨，以便在双光子显微镜下固定头部。这些步骤的设计与实施至关重要，因为清醒动物成像中的大多数问题均源于制备过程中的不稳定性。理想情况下，此处描述的手术操作应可支持术后长达数月的慢性成像。

为了在双光子成像期间实现视觉引导行为，固定头部的小鼠位于由气流支撑的球形跑步机上，小鼠可通过该跑步机在虚拟现实环境中进行导航。小鼠在跑步机上的运动与显示在环绕小鼠的环形屏幕上的虚拟环境中的移动相耦合^14,15。可以记录诸如运动、视觉刺激和瞳孔位置等行为变量⁶。

我们介绍了在小鼠探索虚拟现实环境时进行慢性双光子成像的相关操作步骤。重点内容包括：减少运动伪影、降低光泄漏、最大化同时记录的细胞数量，以及最小化光损伤。我们还详细说明了气浮式跑步机的搭建、瞳孔追踪系统和虚拟现实环境的设置。本文所述方法可用于对头部固定小鼠中荧光标记的细胞群体进行成像。 在可能的多种行为范式中。

方案

所有动物实验程序均经巴塞尔城市州兽医部门批准，并遵循其指南进行。

1. 硬件和软件设置

1. 双光子扫描显微镜装置设置：
   1. 使用脉冲红外激光器作为照明光源（脉冲宽度 <120 飞秒
   2. 使用由8或12 kHz共振扫描器和标准检流计组成的扫描头。 注意： 这使得在750 × 400像素分辨率下可实现40 Hz或60 Hz的帧率。高帧率对于最大限度减少由脑部运动引起的图像失真至关重要。此外，快速共振扫描可提高信号产出，并减少光漂白。¹⁶ 和光毒性。
   3. 使用压电式高速 z 轴步进器，在多个深度依次采集时间交错的图像。 注意： 此步骤为可选，可在降低帧率的前提下提高数据产量。
   4. 使用机械快门以减少激光对组织的暴露。根据共振扫描器的振幅调整快门的宽度。 注意： 由于共振扫描器的扫描路径呈正弦波形，激光束在扫描转向点处移动相对较慢。为防止在这些激光暴露时间最长的转向点处对组织造成损伤，需在扫描透镜与管透镜之间的焦平面中引入一个机械快门，以阻断激光束。 
   5. 使用高速数字化仪（800 MHz）与现场可编程门阵列（FPGA）结合进行数据采集。 注意： FPGA 对 PMT 信号进行高通滤波，并将其分 bin 为像素。FPGA 上的高通滤波与 PMT 放大器上的有效低通滤波相结合，形成一个中心频率约为激光重复频率（80 MHz）的带通滤波器。示例 FPGA 代码作为补充材料提供。
2. 基于Dombeck及其同事设计的气浮式跑步机装置²
   1. 将球体固定装置通过内径至少为10 mm的供气管连接至气源。尽量增大球体固定装置进气口的横截面积，并在主气源与球体固定装置之间连接足够长度的管道。 注意： 增加供气管路的横截面积和长度可降低噪声的产生。
   2. 将一个聚苯乙烯泡沫球（直径20 cm）放入定制设计并3D打印的球形支架中。
   3. 如果行为实验范式仅需要前后运动，则通过插入一根销钉将球的运动限制在水平（俯仰）轴上例如 在球体侧面使用19 G的皮下注射针头。 注意： 通常情况下，动物在这种减少旋转的范式中适应装置的速度要快得多。
   4. 使用一个或两个光学电脑鼠标分别检测围绕两个或全部三个轴的运动，以追踪球体的移动。 注意： 计算机鼠标最好采用红外二极管，以尽量减少对成像的干扰。
3. 虚拟现实环境设置
   1. 准备虚拟现实环境。 注意： 提供了一个基于免费游戏引擎Panda3D的示例环境作为补充材料。虚拟环境中的物体使用开源三维建模软件Wings3D生成。该示例程序读取数据采集卡上的位置信息，并将其转换为虚拟环境中的运动。代码还执行了将环境投影到环形屏幕所必需的非线性变换。该环形屏幕的详细构建方法已在其他文献中描述。^14,17. 
   2. 使用LED投影仪或LED背光计算机屏幕显示虚拟环境。在成像过程中，集成一个门控电路以实现LED的快速闪烁。 注意： 在视觉刺激期间进行双光子成像时，一个固有的问题是视觉刺激系统产生的光泄漏，可通过遮蔽物镜来减少该问题。然而，通过将投影仪的光输出与共振扫描镜的转向点（数据未采集时段）同步，可完全消除视觉刺激系统的光泄漏，此方法与成像过程中用于视觉刺激的LED刺激装置所采用的方式相同。 果蝇¹⁸。这实现了视觉刺激与数据采集的有效高速交替（参见 图2）。闪烁频率（24 kHz）远高于闪烁融合阈值，在此阈值以上，动物便不再感知到闪烁。该对商用LED投影仪进行改装的电子电路图如图所示。 图3.
4. 瞳孔追踪
   1. 使用基于CMOS的视频摄像机（30帧/秒）进行瞳孔位置追踪。确保该摄像机不带有红外阻挡滤光片。 注意： 由于双光子激发激光经眼睛逸出产生的杂散光，瞳孔在记录期间以高对比度可见。瞳孔位置和直径通过基于Sakatani和Isa设计的定制软件实时提取。¹⁹. 

2. 遗传编码钙指示剂注射与窗片植入

钙指示剂的注射²⁰和颅窗的植入²¹按先前所述方法进行，并作如下补充：

1. 使用玻璃注射移液管将病毒注入目标区域，移液管内充满病毒溶液并连接至压力注射系统。根据移液管内径调整压力，通常约为70–140 mbar，在1–2分钟内注射约100 nl病毒溶液。为防止注射过程中病毒沿移液管溢出，应采用低频的低体积脉冲注射（2 Hz频率下每次脉冲0.05秒）。 注意： 为监测注射体积，可在移液管上以较小且等距的长度进行标记（例如 在体视显微镜下观察弯液面在刻度线之间的位移，即可估算注射体积。
2. 注射后数周，应形成一团密集标记的细胞，直径约为500 µm。  目标区域内GECI表达的效率取决于GECI与启动子的组合选择，以及所用重组AAV的感染滴度和血清型。 注意： 以代表性示例为例，注射病毒滴度为 8 x 10¹² vg/mL 的 AAV2/1-EF1α-GCaMP5¹² 将GC/ml注入小鼠初级视皮层后，约两周可获得满意的表达水平图1).
3. 头部固定杆不应遮挡小鼠的视野，但应具有足够的刚性，以确保在动物行为过程中实现稳定的成像。这通常需要在头部固定杆两侧各有一个固定点（参见 图1）。为了牢固地将头杆固定在颅骨上，需确保充分暴露并彻底干燥头杆将要粘附的颅骨区域。此外，使用手术刀或注射器针头在颅骨表面刮擦出浅表凹槽，以增加粘合的表面积。在用牙科水泥固定头杆前，先用氰基丙烯酸酯组织粘合剂覆盖骨面。

3. 实验步骤

1. 病毒注射后两到三周，使用落射荧光照明检查颅窗植入物的透明度和表达情况。若浅层血管边界清晰可见且轮廓分明，则表明颅窗植入物适合成像（见图1）。
2. 测量并调节激光功率，使其在样品处低于50 mW。
3. 打开球形跑步机的气流。
4. 为在显微镜下进行头部固定，使用异氟烷短暂麻醉动物以减少其应激反应。将动物放入异氟烷麻醉容器中，等待其停止活动（约10秒）。取出动物并立即在显微镜下进行头部固定。
5. 将视觉显示系统尽可能靠近动物放置，同时仍保留对动物的操作空间。动物与实验操作者之间的视觉接触越少，实验初期的应激反应就越小。
6. 确保颅窗植入物无灰尘和污物。必要时用水清洁。
7. 在颅窗与水浸物镜之间涂抹透明超声耦合剂作为浸没介质。这可解决因水分蒸发或泄漏导致的图像缓慢退化问题，并避免需在头杆上安装盛水锥形装置。注意：使用前需对耦合剂进行离心以去除所有气泡，并在涂抹过程中避免产生气泡。气泡会严重降低图像质量。
8. 用黑色胶带包裹物镜和头杆，以屏蔽杂散光。
9. 将虚拟环境平台移至最终位置，并调整视频摄像机以实现瞳孔追踪。
10. 设置激光快门，使其与实验过程中使用的扫描振幅相匹配。
11. 开始记录数据。

结果

使用GECI标记细胞群进行双光子钙成像时，图像质量在很大程度上取决于颅窗植入的质量。病毒注射两周后，应检查颅窗的透明度。应无肉芽组织或骨再生迹象（图1A）。此外，浅表血管的分布模式应保持不变，血管边界应清晰分明。同时，也可检测GECI的表达情况。在落射荧光显微镜下，标记细胞的团块应清晰可见（图1B）。

理想情况下，制备样本应具有足够的稳定性，使得在帧对齐后，小鼠运动所引起的双光子图像畸变在图像中不可见（图2）。共振扫描器的扫描路径呈正弦波形，导致图像出现非线性畸变。在扫描路径的回扫阶段，由于图像在此区域被拉伸，不采集数据。如果视觉刺激系统的光源（此处为投影仪的LED）与回扫点正确同步，则光泄漏仅应在该时段内显现（图2）。光源的闪烁频率必须是扫描频率的两倍。实现这一效果的关键在于LED及其控制电路的快速上升和下降时间（图3）。

讨论

行为双光子成像成功的关键在于制备在两个方面的稳定性：

1. 在开窗植入后的数天内，组织的炎症反应可能导致肉芽组织和软骨的形成增强，从而阻碍甚至无法进行成像。
2. 实验过程中，脑组织必须保持足够的稳定性，以防止运动伪影干扰与神经活动相关的荧光信号。

为了将炎症性免疫反应降至最低，颅窗植入手术应尽快完成，并且必须不惜一切代价避免对脑组织造成直接损伤。至关重要的是，必须确保在整个实验过程中颅窗植入物始终保持密封，以防止发生炎症。

为尽量减少与脑部运动相关的成像伪影，在手术过程中应注意不要损伤或移除硬脑膜。当运动局限于与成像平面平行的平面（即 x/y 平面）时，残留的由运动引起的脑部移动可在后期进行校正。x/y 方向上可接受的最大运动标准差约为 5 µm；而在 z 轴方向上，该值约为 1 µm，即运动范围应小于显微镜的分辨率极限。

共振扫描器在扫描路径的转向点处速度较低，可能导致激光诱导的组织损伤。为防止这种情况，可在扫描望远镜...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盖玻片（直径 = 3-5 mm）	Menzel		窗植入物
InSight DeepSee 激光器	Spectra-Physics		显微镜
12 kHz 谐振扫描器	Cambridge Technology	G1-003-30026	显微镜
检流计	Cambridge Technology	G6215H	显微镜
数字化仪	National Instruments	NI 5772	显微镜
FPGA	National Instruments	PXIe 7965R	显微镜
采集卡	National Instruments	PCIe 6363	显微镜
发射滤光片 525/50	Semrock	FF03-525/50-25	显微镜
压电式 z 轴驱动器	Physikinstrumente	P-726.1CD	显微镜
压电驱动控制器	Physikinstrumente	E665 LVPZT	显微镜
物镜 16X，0.8NA	Nikon	CFI75	显微镜
电流放大器	Femto	DHPCA-100	显微镜
光电倍增管	Hamamatsu		显微镜
无红外滤光片的 USB 相机	ImagingSource	DMK22BUC03	瞳孔追踪
50 mm 物镜	ImagingSource	M5018-MP	瞳孔追踪
宏适配环	ImagingSource	LAexSet	瞳孔追踪
光学电脑鼠标	Logitech	G500	运动追踪
20 cm 泡沫聚苯乙烯球	例如 idee-shop.de	08797.00.15	虚拟环境
LED 投影仪	Samsung	SP-F10M	虚拟环境
采集卡	National Instruments	NI 6009	虚拟环境
Panda3D 游戏引擎		www.panda3d.org	虚拟环境
Python 的 Numpy 库		www.scipy.org	虚拟环境
Python 的 Scipy 库		www.scipy.org	虚拟环境
NI-DAQmx 驱动程序	National Instruments	www.ni.com	虚拟环境
超声耦合剂	Dahlhausen	5701.0342.10	成像