本文描述了在虚拟现实环境中对小鼠行为期间进行皮层双光子成像所涉及的实验步骤。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，双光子成像已成为神经科学中不可或缺的工具，因为它能够在动物行为过程中对遗传学上明确标识的细胞活动进行长期测量1-6。本文描述了在小鼠穿越虚拟现实环境时，对其大脑皮层进行双光子成像的方法。我们重点关注实验操作中在明亮光照的虚拟环境下对行为动物进行成像的关键环节。本实验设置中存在的关键问题包括：减少与脑组织运动相关的伪影、防止虚拟现实投影系统的光线泄漏，以及降低激光引起的组织损伤。我们还提供了用于控制虚拟现实环境和瞳孔追踪的示例软件。通过这些方法和资源，可将传统的双光子显微镜改造用于行为状态小鼠的实验研究。
引言
双光子钙成像技术（使用基因编码的钙指示剂如 GCaMP57 或 R-GECO8，或合成染料如 OGB 或 Fluo4）已成为在活体小鼠中测量神经元活动的强大方法1-6。该技术能够以接近单个动作电位的分辨率，同时记录数百个细胞的活动，成像深度可达脑表面下约 800 µm9,10。此外，利用基因编码钙指示剂（GECIs），可实现对特定基因型细胞类型13的神经元活动进行长期、慢性记录5,11,12。这些方法共同提供了前所未有的时间和空间分辨率，为在体研究神经计算过程开辟了众多新的可能性 in vivo。
为了成像，需要通过外科手术暴露并标记小鼠大脑。通常使用重组腺相关病毒（AAV）系统递送基因编码钙指示剂（GECI），并在注射部位上方植入颅窗，以实现对大脑的光学通路。随后将头部固定杆连接至颅骨，以便在双光子显微镜下固定头部。这些步骤的设计与实施至关重要，因为清醒动物成像中的大多数问题均源于制备过程中的不稳定性。理想情况下，此处描述的手术操作应可支持术后长达数月的慢性成像。
为了在双光子成像期间实现视觉引导行为，固定头部的小鼠位于由气流支撑的球形跑步机上，小鼠可通过该跑步机在虚拟现实环境中进行导航。小鼠在跑步机上的运动与显示在环绕小鼠的环形屏幕上的虚拟环境中的移动相耦合1....
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方案
所有动物实验程序均经巴塞尔城市州兽医部门批准，并遵循其指南进行。
1. 硬件和软件设置
- 双光子扫描显微镜装置设置：
- 使用脉冲红外激光器作为照明光源（脉冲宽度 <120 飞秒
- 使用由8或12 kHz共振扫描器和标准检流计组成的扫描头。 注意： 这使得在750 × 400像素分辨率下可实现40 Hz或60 Hz的帧率。高帧率对于最大限度减少由脑部运动引起的图像失真至关重要。此外，快速共振扫描可提高信号产出，并减少光漂白。16 和光毒性。
- 使用压电式高速 z 轴步进器，在多个深度依次采集时间交错的图像。 注意： 此步骤为可选，可在降低帧率的前提下提高数据产量。
- 使用机械快门以减少激光对组织的暴露。根据共振扫描器的振幅调整快门的宽度。 注意： 由于共振扫描器的扫描路径呈正弦波形，激光束在扫描转向点处移动相对较慢。为防止在这些激光暴露时间最长的转向点处对组织造成损伤，需在扫描透镜与管透镜之间的焦平面中引入一个机械快门，以阻断激光束。
- 使用高速数字化仪（800 MHz）与现场可编程门阵列（FPGA）结合进行数据采集。 注意： FPGA 对 PMT 信号进行高通滤波，并将其分 bi....
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结果
使用GECI标记细胞群进行双光子钙成像时，成像质量在很大程度上取决于颅窗植入物的质量。病毒注射两周后，应检查颅窗的透明度，不应观察到肉芽组织或骨再生（图1A）。此外，浅表血管的分布模式应保持不变，血管边界应清晰分明。同时，也可检测GECI的表达情况，在落射荧光显微镜下应能清晰看到标记细胞的团块（图1B）。
理想情况下，制备样本应具有足够的稳定性，使得在帧对齐后，由小鼠运动引起的双光子图像畸变在图像中不可见（图2）。共振扫描器的扫描路径呈正弦波形，导致图像出现非线性畸变。在扫描路径的回转点处，由于图像在此区域被拉伸，不采集数据。如果视觉刺激系统的光源（此处为投影仪的LED）与回转点正确同步，则光泄漏仅在此期间可见（图2）。光源的闪烁频率必须是扫描频率的两倍。实现这一效果的关键在于LED的快速上升和下降时间以及控制电路（图3）。
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讨论
行为双光子成像成功的关键在于制备在两个方面的稳定性：
- 在开窗植入后的数天内，组织的炎症反应可能导致肉芽组织和软骨的形成增强，从而阻碍甚至无法进行成像。
- 实验过程中，脑组织必须保持足够的稳定性，以防止运动伪影干扰与神经活动相关的荧光信号。
为了将炎症性免疫反应降至最低，颅窗植入手术应尽快完成，并且必须不惜一切代价避免对脑组织造成直接损伤。至关重要的是，必须确保在整个实验过程中颅窗植入物始终保持密封，以防止发生炎症。
为尽量减少与脑部运动相关的成像伪影，在手术过程中应注意不要损伤或移除硬脑膜。当运动局限于与成像平面平行的平面（即 x/y 平面）时，残留的由运动引起的脑部移动可在后期进行校正。x/y 方向上可接受的最大运动标准差约为 5 µm；而在 z 轴方向上，该值约为 1 µm，即运动范围应小于显微镜的分辨率极限。
共振扫描器在扫描路径的转向点处速度较低，可能导致激光诱导的组织损伤。为防止这种情况，可在扫描望远镜.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由弗里德里希·米歇尔生物医学研究所、马克斯·普朗克学会以及人类前沿科学计划资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盖玻片（直径 = 3-5 mm） | Menzel | 窗植入物 | |
| InSight DeepSee 激光器 | Spectra-Physics | 显微镜 | |
| 12 kHz 谐振扫描器 | Cambridge Technology | G1-003-30026 | 显微镜 |
| 检流计 | Cambridge Technology | G6215H | 显微镜 |
| 数字化仪 | National Instruments | NI 5772 | 显微镜 |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | 显微镜 |
| 采集卡 | National Instruments | PCIe 6363 | 显微镜 |
| 发射滤光片 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | 显微镜 |
| 压电式 z 轴驱动器 | Physikinstrumente | P-726.1CD | 显微镜 |
| 压电驱动控制器 | Physikinstrumente | E665 LVPZT | 显微镜 |
| 物镜 16X，0.8NA | Nikon | CFI75 | 显微镜 |
| 电流放大器 | Femto | DHPCA-100 | 显微镜 |
| 光电倍增管 | Hamamatsu | 显微镜 | |
| 无红外滤光片的 USB 相机 | ImagingSource | DMK22BUC03 | 瞳孔追踪 |
| 50 mm 物镜 | ImagingSource | M5018-MP | 瞳孔追踪 |
| 宏适配环 | ImagingSource | LAexSet | 瞳孔追踪 |
| 光学电脑鼠标 | Logitech | G500 | 运动追踪 |
| 20 cm 泡沫聚苯乙烯球 | 例如 idee-shop.de | 08797.00.15 | 虚拟环境 |
| LED 投影仪 | Samsung | SP-F10M | 虚拟环境 |
| 采集卡 | National Instruments | NI 6009 | 虚拟环境 |
| Panda3D 游戏引擎 | www.panda3d.org | 虚拟环境 | |
| Python 的 Numpy 库 | www.scipy.org | 虚拟环境 | |
| Python 的 Scipy 库 | www.scipy.org | 虚拟环境 | |
| NI-DAQmx 驱动程序 | National Instruments | www.ni.com | 虚拟环境 |
| 超声耦合剂 | Dahlhausen | 5701.0342.10 | 成像 |
参考文献
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W.
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重印与许可
