方法文章

微波辅助聚乙二醇和树脂上肽的功能化及其在链式聚合和水凝胶形成中的应用

DOI：

10.3791/50890

⸱

2013年10月29日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Chemical Engineering, University of Rochester, 3Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本视频将演示一种快速高效的方法，用于对聚乙二醇进行甲基丙烯酸酯化，从而实现链式聚合反应和水凝胶的合成。视频还将展示如何将甲基丙烯酰胺官能团引入肽分子中，详细介绍评估官能团化效率的常用分析方法，提供故障排除及高级修饰的建议，并演示典型的水凝胶表征技术。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用聚乙二醇（PEG）大分子单体进行水凝胶制备的主要优势之一是其高度的合成灵活性。研究人员可从多种PEG分子量及结构（臂数、臂长和支化模式）中进行选择，从而精确调控所得水凝胶的结构与性能，包括杨氏模量和网络孔径。本视频将展示一种快速、高效、无溶剂、微波辅助的方法，用于将PEG前体甲基丙烯酸酯化为聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDM）。该合成方法为药物递送和再生医学应用提供了亟需的起始材料。所展示的方法优于传统甲基丙烯酸酯化方法，因其显著更快、更简便，且更经济环保，所需试剂和溶剂用量更少。我们还将演示该技术在树脂上对肽段进行甲基丙烯酰胺功能化的改进方法。这种树脂上方法可在肽段脱保护和从树脂上裂解之前，对其N端进行甲基丙烯酰胺基团的功能化修饰。该方法可选择性地在肽段N端引入甲基丙烯酰胺基团，同时保持具有反应性侧链基团（例如 赖氨酸的伯胺、丝氨酸的伯醇、苏氨酸的仲醇以及酪氨酸的酚羟基）的氨基酸处于保护状态，从而避免在多个位点发生非特异性功能化。本文将详细介绍用于评估功能化效率的常用分析方法，包括质子核磁共振波谱（;H-NMR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF）。同时将讨论常见的实验问题及建议的故障排除方法，以及可用于进一步调节大分子单体功能性和所得水凝胶物理化学性质的技术改进方案。还将演示所合成产物在药物递送及细胞-材料相互作用研究中用于水凝胶制备的应用，特别关注通过调节水凝胶组成以控制网络孔径、调控水凝胶刚度及药物释放行为。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

聚乙二醇（PEG）水凝胶是再生医学和药物递送应用中常用的生物材料1-3这些水凝胶相较于其他生物材料具有显著优势。聚乙二醇（PEG）水凝胶为合成材料，与天然生物材料相比，其工程学特性（如弹性模量和降解速率）更易于精确调控。1由于是合成来源，聚乙二醇（PEG）相较于天然来源材料具有显著更低的批间差异性4由于PEG的化学组成，这些水凝胶具有高度亲水性、抗蛋白质吸附性以及良好的生物相容性3这种抗蛋白质吸附的特性使得PEG水凝胶可作为“空白模板”，使研究人员能够探究和研究特定的生物或化学因子（药物、生物分子、细胞黏附肽， 等等。以及这些因素在调控细胞和/或组织行为中的具体作用。

聚合物结构示意图：聚合物 A-D；化学键；分子式表示。
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图1：聚乙二醇（PEG）结构的示例。 A) 线性PEG。 B) 具有季戊四醇核心的4臂PEG。 C) 具有六甘油核心的8臂PEG。 D) 具有三季戊四醇核心的8臂PEG。n表示每条臂上的PEG重复单元数。每个重复单元的分子量为44 g/mol，因此可根据总分子量以及结构/臂数计算n值。

PEG前体具有多种结构和分子量可供选择（图1）。通过改变PEG的结构（支臂数量）和乙二醇重复单元数（n），可调控由这些大分子单体形成的水凝胶网络的性能。未修饰的PEG含有末端羟基，必须将其替换为其他官能团，以便在水凝胶网络形成前通过聚合反应实现共价交联，这是PEG水凝胶最常用的交联策略。已有多种化学基团可被引入PEG大分子单体中，以促进聚合反应和网络交联（丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基醚、降冰片烯）。 等等。）。尽管存在多种可用于促进交联的末端官能团，但聚合反应仅可通过两种机制进行：逐步增长聚合和链式增长聚合（或两者的混合模式）。

聚合物网络示意图：聚甲基丙烯酸酯与聚乙二醇的交联对比。
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图2: 理论水凝胶网络示意图 A传统的链式增长聚合会导致形成非均质网络，其中包含密集的聚甲基丙烯酸酯交联区域，并增加网络非理想性，如环化结构、未反应的前体以及永久缠结。 B逐步增长聚合反应产生显著更均一的网络结构（未按比例绘制）。

通过链增长聚合发生交联的功能基团无需额外交联剂的存在。然而，链式聚合形成的水凝胶会产生结构不均一的网络，其中包含交联密集的区域（图2A）1。相比之下，逐步聚合需要使用可与PEG大分子单体末端功能基团反应的交联剂或共聚单体。由于PEG上的末端功能基团只能与交联剂反应，而交联剂也只能与PEG上的末端功能基团反应，因此可形成更均一的网络结构（图2B）1。逐步聚合通常还能实现更高的功能基团转化率，减少未反应前体的残留量，从而降低因可溶性未结合大分子单体引发免疫或炎症反应的风险1。此外，还已开发出混合模式聚合方法，通过同时具备自反应能力（链增长）和与交联剂反应能力（逐步增长）的大分子单体，将逐步聚合与链增长聚合结合。这种方法可产生兼具两种聚合机制特性的水凝胶，并可用于构建比单独的逐步聚合或链增长聚合网络更为复杂和多样化的网络结构1。

尽管存在大量可用于功能化聚乙二醇（PEG）并促进水凝胶形成的官能团，甲基丙烯酸酯和降冰片烯分别是链式增长聚合和逐步增长聚合中最常见的两类功能基团。这两种官能团均可实现对网络聚合过程优异的时空控制，且在用于细胞包封时，所形成的网络结构能够支持较高的细胞整体存活率5-7二甲基丙烯酸酯功能化的聚乙二醇（PEGDM）通过链式聚合实现交联，并可通过与丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或其他类似功能化生物分子共聚，实现生物分子或其他因子的掺入。5,6PEGDM水凝胶相较于其他链增长聚合体系（如丙烯酸酯功能化的聚乙二醇，PEGDA）具有显著优势。采用传统方法合成PEGDA的速度虽快于PEGDM，但在微波辅助合成条件下，PEGDM的合成效率更高。通常情况下，PEGDA的合成需要过夜进行8 或24小时9 反应，但也可在升温条件下于四小时内合成10PEGDM 也通常通过过夜反应来合成11 或孵育24小时5，某些方法将反应时间延长至4天12. 采用此处展示的微波辅助法，可在5分钟内完成PEGDM的制备。尽管PEGDM的反应动力学比PEGDA慢13, PEGDM的交联反应仍然非常迅速，可在数分钟内完成，并且比PEGDA实现更高的大分子单体转化率，因为甲基丙烯酸酯基团的疏水性增加，导致其在溶液中官能团聚集程度提高，从而增加了自由基转移和甲基丙烯酸酯转化的概率14与PEGDA水凝胶相比，PEGDM水凝胶也表现出更高的细胞存活率和生长能力，这可能是由于在任意给定时间内反应速率降低，从而减少了自由基浓度和未反应的大分子单体含量14硫醇-烯烃聚合反应（如使用降冰片烯功能化的聚乙二醇（PEGN））通过逐步增长聚合形成水凝胶，需使用平均官能度大于两个的PEGN和交联剂。由于硫醇自由基可与降冰片烯的碳-碳双键发生反应，通常采用含多个巯基的交联剂来交联PEGN水凝胶，从而便于整合带有半胱氨酸氨基酸功能的多肽7. 尽管存在多种通过逐步增长聚合反应的其他化学反应（例如硫醇-丙烯酸酯的迈克尔加成反应）15 和硫醇-乙烯基砜16“点击”反应，例如炔烃-叠氮化物17 等等。），硫醇-降冰片烯水凝胶非常常见，因为降冰片烯环的张力显著提高了反应速率，并降低了降冰片烯双键发生链式聚合的可能性7.

选择甲基丙烯酸酯、降冰片烯或其他官能化方式以促进水凝胶形成，主要取决于具体的研究方法。例如，已证明通过链式增长聚合形成的PEGDM网络非常适合用于组织工程化骨膜构建过程中对细胞定位的控制18,19。而通过逐步增长聚合形成的PEG网络则更适用于引入肽序列，以实现酶响应性水凝胶降解，这是因为含有巯基（半胱氨酸）的肽与降冰片烯官能化的大分子单体可方便地引入酶底物序列20。如果研究问题最适合通过逐步增长型水凝胶来解决，Fairbanks et al. 提供了针对PEG的降冰片烯官能化策略的详细描述7。本文将详细介绍PEG和肽序列如何进行官能化（PEG采用甲基丙烯酸酯，肽采用甲基丙烯酰胺）以用于链式聚合反应。

传统上，PEGDM 是通过聚乙二醇（PEG）与甲基丙烯酰氯和三乙胺在二氯甲烷中反应制备的。该反应在室温下进行过夜11或24小时5，某些方法甚至将反应时间延长至4天12，随后经过滤、在乙醚中沉淀并收集产物。尽管该方法存在多种变体，但均耗时较长，需要大量化学合成设备，且不够环保，因其涉及使用较大量高纯度试剂和溶剂。为克服这些局限性，Lin-Gibson 等开发了一种微波辅助、无溶剂的方法，用于在PEG末端引入甲基丙烯酸酯基团（图3A）12。在此反应中，PEG的末端羟基与甲基丙烯酸酐中的一个羰基发生反应，形成羧基，从而生成PEGDM产物，副产物为甲基丙烯酸。该合成方法具备微波合成的诸多典型优势，包括缩短反应时间以及无需使用溶剂21。相比前述方法，微波合成更具优势，因其显著更快，所需合成设备更少（例如玻璃器皿、反应板），且整体试剂和溶剂用量更少，因为溶剂仅用于产物的纯化和收集，而不用于合成过程本身，因此更具经济性和环境友好性。

使用微波法进行甲基丙烯酸酐反应的聚合物合成方程式；化学过程示意图。
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图3: 功能化示意图 A聚乙二醇与10倍摩尔过量的甲基丙烯酸酐反应，生成聚乙二醇甲基丙烯酸酯。 B）该方法同样可用于功能化肽序列的N端，形成甲基丙烯酰胺功能化肽。在将肽从树脂上裂解之前进行此操作，可选择性地功能化N端，因为氨基酸侧链基团仍处于保护状态。n：大分子单体中PEG重复单元的数量（分别对应所用2、10和20 kDa线性PEG的n=45.5、227和455）。R1至RN：氨基酸侧链。PG1至PGN：侧链保护基团。TFA：三氟乙酸。TIPS：三异丙基硅烷。DODT：3,6-二氧杂-1,8-辛二硫醇。H2O：水。

我们课题组近期对微波辅助甲基丙烯酰化方法进行了改进，用于在肽的N端引入甲基丙烯酰胺基团（图3B），以促进肽段整合到多种聚合物及聚合物网络中。在该反应中，肽N端的伯胺与甲基丙烯酸酐上的羰基发生反应，形成酰胺键，从而生成甲基丙烯酰胺功能化的肽，副产物为甲基丙烯酸。在使用该方法对肽序列的N端进行功能化修饰时，必须注意：含有反应性侧链的氨基酸（如伯胺基团（赖氨酸）、羟基（丝氨酸、苏氨酸）和酚羟基（酪氨酸））应在功能化过程中加以保护，且保护基团仅在甲基丙烯酰胺基团引入后方可脱除。

本文将演示这两种微波辅助方法，用于合成聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDM）并对树脂上的肽序列进行功能化修饰，同时指出常见问题并提出相应的解决方案。文章将详细介绍常用于评估产物功能化的分析化学技术，并提供进行更高级修饰的建议和资源。本文还将展示典型实验结果，包括利用合成的PEGDM形成水凝胶网络，利用所形成的水凝胶控制模型药物的释放，以及使用功能化肽段促进细胞与水凝胶之间的相互作用。特别关注对水凝胶网孔尺寸的表征，并讨论如何调节水凝胶的组成以影响这一基本物理特性，从而调控材料的整体性能，如刚度和药物释放行为。

方案

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1. 微波辅助合成 PEGDM

  1. 为防止水分污染，将所有使用的玻璃器皿在烘箱（>60 ºC）中预干燥1小时。
    注意：所需玻璃器皿包括：两个100 ml烧杯、一个250 ml烧杯、3把药匙、一个250 ml布氏烧瓶、一个7 cm布氏漏斗、一个10 cm表面皿。
  2. 将100–150 ml无水乙醚（74.12 g/mol）倒入烧杯中，用表面皿盖住烧杯，并将烧杯置于盛有冰的重结晶盘中，预先冷却，用于后续第1.6步的沉淀操作。将微波炉和涡旋振荡器移入化学通风橱中。
    注意：乙醚也可通过将烧杯放入化学冷冻柜中进行预冷。冷冻柜冷却可达到更低的乙醚温度，从而提高沉淀的速率和效率。
  3. 在小称量舟中称取5 g聚乙二醇（PEG），分子量可根据需要选择（1,000–100,000 Da）。
    1. 如有，从闪烁瓶盖上移除塑料部件。将闪烁瓶去皮归零，在通风橱中根据公式1加入10倍摩尔过量的甲基丙烯酸酐（MA，154.16 g/mol）。将PEG加入闪烁瓶中。
      聚合物组成方程，M_MA用于计算分子量，公式表示。 (1)
      其中 MPEG格式符号，代表数字视频压缩标准。 为PEG的质量（单位：g），静力平衡公式，ΣFx=0，以文本方程形式展示，用于物理教学。 为PEG的分子量（单位：g/mol），NPEG末端；静力平衡概念图示；ΣFx=0，用于平衡分析的物理公式。 为PEG上的末端羟基数，质谱方程，用于分析化学中的分子量计算（MW和MA）。 为MA的分子量（单位：g/mol）。
  4. 将闪烁瓶盖轻轻拧紧。将微波炉设置为最大功率加热5分钟。佩戴耐热手套，每隔30秒从微波炉中取出闪烁瓶一次。
    1. 完全拧紧瓶盖，涡旋振荡30秒。重复此操作，直至完成全部5分钟的微波加热。由于瓶盖可能出现裂纹，过程中可能需要更换瓶盖。
  5. 将瓶盖略微松开，使PEGDM冷却至室温。用少量（10–15 ml）二氯甲烷（DCM，84.93 g/mol）溶解PEGDM。
    注意：建议在加入DCM前让PEGDM充分冷却（约5分钟），以避免因残留热量导致DCM（一种疑似致癌物）沸腾。可用药匙将PEGDM打碎成小块，并通过涡旋振荡促进溶解。
  6. 用10倍体积的冰乙醚沉淀PEGDM，持续20分钟。
    注意：对于低分子量PEG（2,500 Da），可能需要用药匙刮擦烧杯内壁以引发结晶；然而，分子量低于1,000 Da的PEG即使刮擦也无法沉淀。
  7. 使用布氏漏斗和烧瓶，通过减压过滤收集PEGDM。不要过滤至完全干燥，以免促进PEGDM吸附水分。
    注意：若所用真空系统需要，可在过滤装置与真空源之间加装真空阱，以保护真空泵免受溶剂蒸气损害。
  8. 将过滤后的PEGDM转移至一个50 ml锥形管中，管盖上穿刺大孔径针头以通风。在真空干燥箱中过夜干燥。
  9. 将PEGDM重新溶于DCM，并再次沉淀（如步骤1.5–1.7所述），作为最后一步以去除未反应的MA。再次按步骤1.8进行干燥。

2. PEGDM 功能化的表征

  1. 使用氘代氯仿（120.38 g/mol）作为溶剂，制备1H-NMR 样品。取少量 PEGDM 样品（约 10 mg）放入闪烁瓶中，并加入少量溶剂（约 1.0 ml）。目标浓度为 10 mg/ml。
    1. 待样品完全溶解后，转移至一支洁净的核磁管中。样品液面应充满核磁管底部 4–5 cm 的区域。
  2. 采集质子核磁共振谱图。本实验采用 400 MHz 谱仪进行数据采集。样品在室温下至少扫描 64 次，以获得足够的数据分辨率。
  3. 若核磁共振分析结果（图 4）显示 PEGDM 的官能化程度低于 90%，则需重复甲基丙烯酸化步骤。应根据未官能化 PEG 含量的减少量，调整所用甲基丙烯酸酐（MA）的质量。

注意：聚乙二醇单甲基丙烯酸酯（PEGDM）中聚乙二醇（PEG）的官能化百分比可通过末端甲基丙烯酸酯质子（a、b 和 c）与中心 PEG 质子（d）的实测值与理论值之比计算得出（图4）。对于线性 PEG，中心 PEG 质子的理论数量由公式 2 计算：

静态平衡，聚合物链公式 d_theo=4*(MW_PEG/MW_PEG repeat−1)，理论计算 (2)
其中 分子量（MW）表示公式，有机化学概念，教育符号。 为 PEG 的分子量，单位为 g/mol，PEG 重复单元分子量分析，公式文本；聚合物化学概念，分子量研究。 为单个 PEG 重复单元的分子量（44 g/mol）。对于非线性 PEG，该方程需根据具体的支化结构进行修正（图 1）。随后可使用方程 3 计算功能化百分比：
化学表面分析中的功能化方程。(3)
其中 微分面积元素符号，与微积分或物理方程相关。 为峰 d（δ=6.63 ppm）下观测到的面积，机械优势公式（MA=面积）；物理学与工程分析中的基本概念。 为甲基丙烯酸酯质子峰（a，δ=1.94 ppm；b 和 c，δ=5.57 和 6.12 ppm）下观测到的面积，表示静态力矩平衡的方程，MA=0，描述旋转平衡原理。 为理论上甲基丙烯酸酯质子的数量（a=3*NPEG 末端；图示中的静态平衡概念；ΣFx=0，用于平衡分析的物理公式。，b=1*NPEG 末端；图示中的静态平衡概念；ΣFx=0，用于平衡分析的物理公式。，c=1*NPEG 末端；图示中的静态平衡概念；ΣFx=0，用于平衡分析的物理公式。 - 线性 PEG 分别为 6、2 和 2）。应分别使用峰 a、b 和 c 进行功能化百分比的计算，然后取平均值得到总体功能化百分比。

注意：充分功能化的 PEGDM 可通过透析（在水中，以水为透析液）并经冷冻干燥收集，以去除残留的甲基丙烯酸酐和甲基丙烯酸。最终产物应与少量（0.01 wt%）抑制剂（如柠檬酸或维生素 C）混合，并在 -20 °C 下与干燥剂一起保存，直至使用。最终的 PEGDM 产物可用于制备水凝胶，具体方法详见 Khetan 和 Burdick 在 JoVE 期刊发表的文章22。

3. 树脂上肽的微波辅助功能化

注意：我们的多肽使用Fmoc-Gly-Wang树脂，通过带有紫外监测的自动多肽合成仪合成，氨基酸溶液为0.2 M的N-甲基吡咯烷酮（NMP，99.1 g/mol）溶液。脱保护使用5%哌嗪（86.1 g/mol）的二甲基甲酰胺（DMF，73.1 g/mol）溶液，活化剂使用0.5 M的O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU，379.3 g/mol）DMF溶液，活化碱使用2 M的二异丙基乙胺（DIEA，129.3 g/mol）NMP溶液。多肽也可从商业多肽供应商处获得。使用商业来源时，关键是要采购仍连接在树脂上且氨基酸侧链保护基完整的多肽，而不是像常规那样完全裂解的多肽。

注意：必须保护所有具有反应性侧链的氨基酸，以确保甲基丙烯酰胺功能化仅发生在肽序列N端的伯胺上。有关具有反应性侧基的氨基酸及其典型保护基团，请参见表1。带有保护基团的氨基酸在肽合成过程中与未保护的氨基酸一样被引入序列中，通常可从相同的氨基酸供应商处获得。

氨基酸反应基团保护基
LysinePrimary Aminetert-butyloxycarbonyl (Boc)
SerinePrimary Alcoholtert-butyl (tBu)
ThreonineSecondary AlcoholtBu
TyrosinePhenoltBu

表1： 反应性氨基酸及典型保护基团。

  1. 采用标准固相肽合成法合成肽，并将树脂保存在 DMF 中，于 4 °C 储存，直至使用。
  2. 使用带有滤纸和 250 ml 锥形瓶的 7 cm 布氏漏斗，通过过滤收集 DMF 中的肽树脂。
  3. 若存在，从闪烁瓶盖上移除塑料部件。将树脂转移至闪烁瓶中。使用一次性移液管，加入刚好足以覆盖闪烁瓶中树脂的 MA。
  4. 将瓶盖松松地盖在闪烁瓶上。将微波炉设置为最大功率加热 3 分钟。佩戴耐热手套，每隔 15–20 秒从微波炉中取出一次闪烁瓶。
    1. 完全拧紧瓶盖，涡旋振荡 15 秒。重复此操作，直至溶液已完成总共 3 分钟的微波处理。
  5. 将瓶盖略微松开，使肽溶液冷却至室温。使用少量 DMF 及带有滤纸和锥形瓶的布氏漏斗，从闪烁瓶中收集肽树脂。
  6. 将肽树脂转移至新的闪烁瓶中，并进行肽的裂解与脱保护。
    1. 每 0.25 mmol 树脂，使用 18.5 ml 三氟乙酸（TFA，114.02 g/mol）、各 0.5 ml 的三异丙基硅烷（TIPS，158.36 g/mol）、3,6-二氧杂-1,8-辛二硫醇（DODT，182.30 g/mol）和去离子水（18.02 g/mol）组成的裂解试剂，在室温下反应 2 小时并持续旋转。
      注意：该裂解试剂适用于大多数肽，但无法脱除 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基（Pbf）保护的氨基酸（常用于保护精氨酸侧链）。若序列中含有 Pbf 保护基团，应将 0.5 ml TFA 替换为 0.5 ml 硫代苯甲醚（124.20 g/mol），并将裂解时间延长至 4 小时。
      注意：若裂解试剂中形成浑浊的结晶状物质，则表明肽可能从溶液中析出，此时应将裂解试剂体积加倍。
  7. 在烧杯中将 400 ml 无水乙醚置于冰上冷却，并用表面皿覆盖。
  8. 用 10 倍体积过量的乙醚沉淀肽，并将溶液平均分装至四个 50 ml 离心管中。在 3,200 × g 条件下离心 10 分钟以收集肽。
    1. 倾去乙醚，将肽重悬于总共 100 ml 新鲜乙醚中，分装至两个 50 ml 离心管。重复离心过程，再分别用 50 ml 新鲜乙醚重悬两次，共完成 4 次乙醚洗涤。
      注意：此步骤可去除裂解试剂中的化学物质及断裂的保护基团。
  9. 最后一次离心后，倾去废液乙醚，并在真空条件下干燥肽过夜。

4. 肽功能化的表征

  1. 使用50:50 H2O：乙腈（41.05 g/mol）+ 0.1% 三氟乙酸作为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF）分析肽样品的溶剂。取少量肽样品（1–2 mg）置于1.5 ml离心管中，加入1 ml MALDI溶剂溶解样品。
  2. 配制基质溶液。常用的基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA，189.2 g/mol）。将10 mg/ml基质溶解于MALDI溶剂中，制成基质储备溶液。
    注意：基质储备液可在室温下保存长达一周，用于后续分析。
  3. 将肽段溶液与基质溶液按1:1比例混合，取该混合溶液分别点样于MALDI样品靶板上的三个不同位置，每处添加 1 μl/spot.
    1. 干燥斑点，可选择自然晾干或使用热风枪。每个样品重新点样并干燥。
      注意：重复点样可产生更均匀的肽/基质样品，并有助于获得清晰的信号。还应将标准肽混合物与基质溶液按1:1比例混合后点样（仅一次）至MALDI靶板上。
  4. 采集MALDI-ToF数据。由于在肽段的N端添加了甲基丙烯酰胺基团，其分子量应比肽段本身的分子量增加68 g/mol。
    注意：与PEGDM的合成不同，肽无法进行再功能化，因为在裂解过程中，具有反应性侧链的氨基酸上的保护基团会被去除，无法再确保对N端进行选择性功能化。
    1. 如果MALDI分析（图5) 表明肽已正确功能化，且所有保护基团均已适当切除，可通过透析（以水对水）并收集冻干产物以去除残留污染物（裂解试剂、乙醚、切除的保护基团） 等等。）。应将固态多肽转移至小型离心管中，并于 -20 °C 直至使用。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

质子核磁共振是评估化学反应效率最常用的分析技术之一，因为每个谱峰下的面积与样品中该质子的相对含量成正比，从而可确定样品中产物与反应物的比例。对于该反应， 1H-NMR分析（图4) 可用于根据观察到的末端甲基丙烯酸酯质子（a、b 和 c）与中心 PEG 质子（d）的实测值与理论值之比，计算功能化百分比。图中所示的 PEGDM 图4 为2,000 Da，功能化前；因此n = 2,000 Da / (44 Da/PEG重复单元) = 45.5，故d = 4×(n−1) = 178，使得质子核磁共振（NMR）单元比为178/102.16 = 1.74。在此情况下，不能使用峰a来评估功能化百分比，因为样品中水的存在会人为增大该峰下的积分面积。使用峰b计算，功能化百分比为1.00×1.74/2×100% = 87.1%；使用峰c计算，功能化百分比为1.08×1.74/2×100% = 94.1%。因此，总体功能化百分比为91%，该PEGDM已充分功能化，可用于水凝胶合成。通常，经过一轮甲基丙烯酸化反应后，功能化程度可达约90%。

由于多肽在1H-NMR分析中会产生大量质子峰，因此使用MALDI-ToF质谱更便于研究多肽的功能化情况。这一点在图5中得到展示，其中合成了多肽GKRGDSG并进行了甲基丙烯酰胺功能化。取少量多肽在功能化前进行裂解，以测定其分子量（图5A），结果显示观测到的分子量峰位于676 g/mol，与该多肽的理论分子量一致，表明多肽序列合成正确。其余多肽在裂解前进行了甲基丙烯酰胺功能化。由于该多肽含有Pbf保护的R氨基酸，因此采用含硫代苯甲醚的裂解液处理4小时进行裂解。甲基丙烯酰胺功能化后，观测到的分子量峰出现在744 g/mol（图5B），与甲基丙烯酰胺功能化多肽的预期分子量（676 + 68 g/mol）相符，而非未功能化多肽的预期分子量，表明功能化反应成功。

为了验证PEG和甲基丙烯酰胺功能化肽的双重功能，制备了含有或不含0.5 mM甲基丙烯酰胺功能化的GKRGDSG肽的PEGDM水凝胶（图6）。水凝胶由10 wt%线性10 kDa PEGDM溶于PBS中，并添加0.05 wt%光引发剂二苯甲酮衍生物Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate（LAP）制得。将前体溶液注入由玻璃片间隔并用文件夹夹紧固定的两片玻璃载片之间，随后在365 nm紫外光（2 mW/cm2）照射下反应10分钟以引发交联，之后使用直径8 mm的圆柱形打孔器收集凝胶。凝胶用PBS冲洗，并在PBS中溶胀2天，以确保达到平衡溶胀状态16,20。人源间充质干细胞（MSCs，第3代）培养至80%融合度后，以15,000个细胞/cm2的密度接种于水凝胶表面。细胞在培养48小时使其充分贴附后，更换为新鲜培养基，其中加入0.5 µl/ml钙黄绿素AM（calcein AM）和2 µl/ml溴化乙锭同源二聚体（ethidium homodimer）（Invitrogen公司的LIVE/DEAD活力检测试剂盒），然后在Nikon Eclipse Ti 2000显微镜下以10倍放大倍数进行相差显微镜和荧光成像。结果显示，MSCs无法在未功能化的PEG水凝胶上贴附（图6A），但在引入细胞黏附肽RGD后，细胞能够在水凝胶表面成功贴附并铺展（图6B）。所展示的LIVE/DEAD荧光图像并不反映接种MSC群体的真实活力状态，因为MSC是依赖黏附生存的细胞，死亡后会从凝胶表面脱落，并在换液过程中被清除，从而导致接种细胞活力被人为高估。因此，这些荧光图像的主要目的是区分贴壁细胞与水凝胶表面微小的拓扑结构差异，而这些差异仅通过相差显微镜难以清晰识别。值得注意的是，在仅含PEG的凝胶上接种的未铺展细胞同时呈现calcein AM和ethidium homodimer阳性染色，表明在成像时这些细胞正处于死亡过程中。

PEG水凝胶的众多优势之一在于其高度可调的特性。通过改变PEG水凝胶的具体组成，研究人员可以高度控制其弹性模量等性质。如图7所示，PEG的分子量（图7A）和质量百分比（图7B）均已被证实可调控水凝胶的网络孔径（ξ），以及水凝胶的刚度和包封药物的释放速率。通过制备不同分子量的PEGDM水凝胶，并检测其相应的水凝胶模量和网络孔径（图8），验证了这一现象。所有水凝胶均在PBS中以10 wt%线性PEGDM和0.05 wt% LAP作为光引发剂制备。将40 µl水凝胶前体溶液置于剪去尖端的1 ml注射器中，在2 mW/cm2强度的365 nm紫外光下照射10分钟以形成水凝胶，所得圆柱形水凝胶直径约为5 mm，高度约为2 mm。水凝胶在PBS中溶胀2天后进行力学测试。使用MTS QT/5材料试验机配备5 N载荷传感器，以0.1 mm/sec的速率压缩至初始水凝胶高度的5%–10%，测定水凝胶模量。完成力学测试后，通过Flory-Rehner方程测定网络孔径，具体方法见讨论部分，计算在MATLAB中进行，测量水凝胶冻干前（Ms）和冻干24小时后（MD）的质量。正如假设所示，增加PEG大分子单体的分子量会导致水凝胶网络孔径增大（图8A）和水凝胶刚度降低（图8B）。通过调节PEG的质量百分比，也可调控水凝胶的网络孔径和相应的凝胶刚度。使用不同wt%的线性10 kDa PEGDM制备水凝胶，并按照前述方法测定水凝胶刚度和网络孔径（图9）。如图7B所示，增加PEG的质量百分比会导致网络孔径显著减小（图9A）和水凝胶刚度显著增加（图9B）。

使用不同分子量的聚乙二醇（PEG，分别为 2、10 和 20 kDa）制备了包封牛血清白蛋白（BSA）的水凝胶。所有水凝胶均在含 50 µg/ml BSA 的磷酸盐缓冲液（PBS）中，按 图6 所述方法制备，其中 PEGDM 含量为 10 wt%。将凝胶在 37 °C 的 1 ml PBS 中孵育，并在每个时间点转移至新鲜 PBS 中。使用赛默飞世尔科技公司的 Bradford 法测定释放的 BSA 含量。水凝胶的网孔尺寸测定方法见 图8。如 图7A 所示，由于高分子量 PEGDM 形成的水凝胶具有更大的网孔尺寸（图10），BSA 从其中的释放速度更快。

核磁共振谱图、化学位移图、分子结构、质子分析、光谱结果
图 4. 微波辅助法功能化的 2 kDa 线性 PEGDM 的代表性 1H-NMR 谱图。 功能化百分比可根据末端甲基丙烯酸酯质子（a、b 和 c）与中心 PEG 质子（d）的实测值与理论值之比进行计算。 点击此处查看高清图像。

分子量分布图；强度 vs. 重量；预期值 676, 744 g/mol；分析。
图5. 肽GKRGDSG在微波辅助法功能化前（A）和功能化后（B）的代表性MALDI-ToF图谱。 请注意，功能化后的实测分子量峰出现在744 g/mol，与甲基丙烯酰胺功能化肽的预期分子量（676+68 g/mol）一致，而非未功能化肽的预期分子量（676 g/mol）。点击此处查看高清图像。

PEGDM细胞研究；相差显微镜、活/死细胞染色、显微图像；细胞活力评估。
图6. 间充质干细胞（MSCs）在A）仅含PEG凝胶和B）含0.5 mM甲基丙烯酰胺功能化GKRGDSG的PEG凝胶上培养后的代表性相差显微图像（左）和LIVE/DEAD（绿色/红色）荧光图像（右）。 间充质干细胞无法在单独的PEGDA凝胶上黏附和铺展，但当凝胶中引入细胞黏附肽RGD后，细胞能够在水凝胶表面黏附并铺展开来。点击此处查看高分辨率图像。

聚合物网络示意图显示了刚度与药物释放速率的关系；包封药物、甲基丙烯酸酯、乙二醇。
图7. A) 用于形成水凝胶网络的聚乙二醇（PEG）分子量和B）重量百分比影响水凝胶网孔尺寸（ξ）以及相应的水凝胶刚度和包封药物的释放速率。 A) 在恒定重量百分比下增加PEG分子量（从左到右），会增大水凝胶网孔尺寸，降低水凝胶刚度，并提高药物释放速率。 B) 降低用于形成水凝胶的PEG重量百分比（从左到右），同样会增大水凝胶网孔尺寸，从而降低水凝胶刚度并提高药物释放速率（未按比例绘制）。 点击此处查看高清图像。

PEG大分子单体分子量与纳米级孔径及弹性之间的关系，柱状图比较，具有统计学显著性。
图8. A) 随着PEG大分子单体分子量的增加，网络孔径增大；B) 水凝胶刚度降低。 n=10，误差条表示标准误（SEM），*** p<0.001，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey's HSD事后检验。所有统计分析均使用Prism 5软件完成。 点击此处查看高分辨率图像。

显示颗粒尺寸和弹性模量随PEG重量百分比变化的柱状图。
图9. A) 随着PEG重量百分比（wt%）增加，网络孔径减小；B) 水凝胶刚度增加。 n = 9-10，误差条表示标准误（SEM），** p<0.01，*** p<0.001，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey's HSD事后检验。 点击此处查看高分辨率图像。

BSA释放动力学，图表，PEG聚合物，分子量影响，药物递送研究。
图10. 从使用2 kDa、10 kDa和20 kDa分子量PEG形成的水凝胶中释放包封的模型药物牛血清白蛋白（BSA）。 由于较高分子量PEGDM形成的水凝胶具有更大的网络孔径，BSA的释放速度更快。n=6，误差条表示标准误（SEM）。在除t=1小时和2.5小时外的所有时间点，三组之间的BSA释放百分比均存在显著差异（p<0.0001）；在t=1小时和2.5小时，2 kDa与10 kDa凝胶间的释放量相当，经双因素重复测量方差分析（ANOVA）结合Bonferroni事后检验确定。点击此处查看高分辨率图像。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

前文所述方法对于合成聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDM）以及对肽段或其他含氨基化合物进行甲基丙烯酰胺功能化具有重要价值。这些材料随后可用于再生医学和药物递送应用。由于聚乙二醇（PEG）具有亲水性，由PEG大分子单体形成的水凝胶含水量较高，类似于人体多种组织2。这一特性使PEG具有极强的抗蛋白质吸附能力，因此在体内呈惰性3。然而，PEG的吸湿性在功能化过程中可能带来问题。若在甲基丙烯酰化反应过程中PEG样品中存在水分，甲基丙烯酸酐将优先与水反应生成甲基丙烯酸，从而导致PEG的功能化效率降低。

因此，为确保聚乙二醇（PEG）或肽的甲基丙烯酰化反应成功，最关键的步骤之一是保持无水反应条件。使用前对所有玻璃器皿进行干燥的推荐操作旨在防止水分污染。样品中若存在水，可在核磁共振（NMR）分析中观察到位于1.7 ppm处的宽峰，图4）。如果在所有玻璃器皿均已干燥的情况下仍观察到甲基丙烯酰化效果不佳，可使用硫酸钠或其他干燥剂（如分子筛）对化学品进行干燥处理。 等等。使用前可通过蒸馏去除水分并纯化甲基丙烯酸酐，也可采用共沸蒸馏对聚乙二醇（PEG）进行干燥。23在极端情况下，可在手套箱中进行合成，以进一步确保充分的无水条件。也可按照相同步骤进行第二轮甲基丙烯酸酯化反应，以提高官能化程度。由于后续可能需要进行额外的官能化步骤，因此在步骤1.7和1.9中应小心操作，尽快通过真空抽滤收集PEGDM。真空抽滤时间若超过必要时长，会增加PEG暴露于空气中的机会，从而增加吸水风险。

尽管甲基丙烯酸酐相对于羟基官能团的过量百分比保持不变，增加PEG功能化（例如 PEG前体上的臂#通常与所达到的功能化百分比降低相关（Benoit实验室未发表结果）。为预先解决功能化效率的下降问题，或在难以实现足够高功能化程度时，可在保持微波反应间隔为30秒的前提下，适当延长微波反应时间。虽然通常10倍摩尔过量的甲基丙烯酸酐已足够，但也可通过增加反应中甲基丙烯酸酐的用量来提高功能化程度12.

为了获得良好的核磁共振（NMR）信号，必须进行额外的沉淀步骤（1.9）。尽管在合成当天即进行第二次沉淀操作具有吸引力，但研究发现，在重新沉淀前将样品过夜干燥有助于去除过量的甲基丙烯酸酐和甲基丙烯酸。样品制备对于获得清晰的核磁共振谱图同样至关重要，因此应按照推荐条件制备样品。图4展示了正确功能化的PEGDM的代表性1H-NMR结果。通过分析末端甲基丙烯酸酯质子与中心PEG质子的比值，确定PEGDM已实现充分的功能化。MALDI样品制备对于获得清晰的检测结果同样重要。MALDI对盐类的存在和高样品浓度特别敏感。如果无法获得清晰的MALDI信号（强度高于50个任意单位（a.u.），且信噪比较高），则应在与基质溶液混合并重新分析前，用MALDI溶剂将样品溶液稀释1:100。图5展示了在正确完成多肽功能化、裂解及样品制备后的代表性MALDI-ToF结果。在功能化前对少量树脂进行裂解（图5A）显示GKRGDSG多肽合成正确，而图5B则显示多肽的甲基丙烯酰胺功能化正确。

尽管树脂上肽的功能化是一种相对稳定的实验操作，但每种序列所需的裂解条件通常需要优化。对于许多氨基酸侧链被保护的长序列而言（>30个氨基酸长，或 >15个带有保护基的氨基酸）时，裂解时间应增加一小时。然而，若裂解时间过长，由于长时间的酸性暴露，可能导致肽键断裂。基质辅助激光解吸电离（MALDI）分析在揭示肽合成或裂解过程中发生的任何错误方面具有重要帮助。若观测到的分子量低于预期值，可能表明一个或多个氨基酸未完全偶联，或发生了肽段断裂（参见 表2 （关于常见分子量变化的来源，请参见相关文献）。若观察到的分子量高于所用保护基团的预期质量，则很可能裂解和脱保护不充分，此时应将肽段再次进行裂解，并延长裂解时间。

氨基酸缺失分子量变化 (g/mol)未裂解保护基分子量变化 (g/mol)常见离子分子量变化 (g/mol)
Ala-71乙酰基+42Cl-+35
Arg-158烯丙基+40K++39
Asn-114Alloc+85Mg2++24
Asp-115Boc+100Na++23
Cys-103Fmoc+223
Gln-128OtBu+56
Glu-129Pbf+252
Gly-57tBu+56
His-137Trt+242
Ile-113
Leu-113
Lys-128
Met-131
Phe-147
Pro-97
Ser-87
Thr-101
Trp-186
Tyr-147
Val-99

表2. 肽分子量中常见变化。

采用微波辅助甲基丙烯酰化方法制备的大分子单体可用于多种再生医学或药物递送应用。本文合成的官能化肽和PEGDM也可通过氮氧自由基介导聚合（NMP）、原子转移自由基聚合（ATRP）或可逆加成-断裂链转移（RAFT）方法引入聚合物中24。如JoVE期刊中Khetan和Burdick此前报道的那样，也可在细胞存在下形成水凝胶网络22。这通常需要引入细胞黏附肽（如RGD）或细胞外基质分子，因为单独的聚乙二醇（PEG）无法提供某些细胞类型存活和功能所必需的细胞-材料相互作用25。例如，肽可通过传统的固相肽合成方法合成，并按本文所述进行官能化，以便引入水凝胶网络中。如图6所示，在水凝胶中加入甲基丙烯酰胺官能化的细胞黏附肽GKRGDSG（0.5 mM）可促进人骨髓间充质干细胞（MSCs）在PEG水凝胶表面的黏附，增加贴附和铺展细胞的数量（图6B），相比之下，不含细胞黏附肽的PEG水凝胶则效果较差（图6A）。然而，先前的研究表明，通过在黏附肽与水凝胶网络之间引入3,400 Da的PEG间隔臂，可进一步增强细胞-材料相互作用，以减少肽-整合素之间的空间位阻。若不加入该间隔臂，细胞可能通过非特异性吸附到肽上的蛋白质与PEG水凝胶相互作用，而非通过整合素介导的肽相互作用26。为引入该PEG间隔臂并避免非特异性相互作用，可按照Hern和Hubbell所述方法，通过N-羟基琥珀酰亚胺活化酯将肽与单官能化PEG偶联26。

水凝胶网络的应用需要对其材料特性进行精确控制。聚乙二醇（PEG）水凝胶的一个显著优势在于能够高度调控这些特性。例如，可通过改变用于形成水凝胶网络的PEG的分子量、支臂数量以及质量百分比（wt%），来精细调节其性能以适应特定应用。这使得对水凝胶网孔尺寸（ξ）的精确控制成为可能，而网孔尺寸决定了水凝胶的溶胀比（Q）和刚度（弹性模量，E）。这一点在图7A中有所展示，并在图8中进行了量化：随着PEG大分子单体分子量的增加，水凝胶网孔尺寸增大（图8A），而水凝胶刚度则降低（图8B）。

控制这些水凝胶网络宏观行为的基本物理特性——网孔尺寸，是通过Flory-Rehner方程16计算得到的。进行该计算时，首先根据公式4计算体积溶胀比（Q）：
流体力学公式 Q=1+ρs/ρp(Ms/MD-1)，静态平衡，教学示意图。 （4）

其中，ρs 为水的密度（1 g/ml），ρp 为聚乙二醇（PEG）的密度（1.12 g/ml），Ms 为水凝胶的溶胀质量，MD 为水凝胶的干质量（通常在冷冻并冻干后测定）。随后根据公式 5 计算交联点之间的分子量（Mc，单位为 g/mol）：
高分子化学方程；交联参数公式；科学分析与研究。 （5）

其中，MN 为聚乙二醇（PEG）的数均分子量（单位：g/mol），静力学平衡方程图示；ΣFx=0, MA=0；物理解题方法。 为聚合物的比容 静力学平衡方程，V=ρs/ρp，表示密度比，用于教学的公式。，V1 为水的摩尔体积（18 ml/mol），V2 为水凝胶中聚合物在平衡状态下的体积分数
（静力学平衡方程 V₂=1/Q，用于物理公式及教学研究。），X1 为 PEG 与水之间的聚合物-溶剂相互作用参数（0.426）16。交联点之间的键数（n）则由方程 6 计算得出：
聚合反应公式，\( n = N_b \frac{M_c}{M_r} \)，化学反应计算的关键。 （6）

其中 Nb 为 PEG 重复单元中的化学键数目（3），Mr 为 PEG 重复单元的分子量（44 g/mol）27。由此可通过公式 7 计算聚合物链的均方根末端距 显示变量 'r' 平方的几何平均公式示意图。（单位：nm）：
静态平衡方程，显示半径关系的公式：(r0^2)^(1/2) = lCn^(1/2)n^(1/2)。 （7）

其中，l 为平均键长（基于 C-C 和 C-O 键长计算得到，为 0.146 nm），Cn 为聚合物的特征比（PEG 的特征比为 4.0）28。最后，水凝胶的网孔尺寸可通过公式 8 计算：
静态平衡公式 ξ=ν₂⁻¹/³(r₀²)¹/²，用于教学的数学表达式。 (8)

通过调整形成水凝胶时所用PEG的含量，也可以类似地调节水凝胶的性能。降低PEG大分子单体的质量百分比会导致水凝胶网孔尺寸增大，从而降低水凝胶的刚度。图7B展示了，图9则量化了在水凝胶形成过程中所用PEG的质量百分比如何用于控制网孔尺寸（图9A）以及相应的水凝胶刚度（图9B）。由于基底刚度已被证明会影响细胞行为（如干细胞分化29），因此能够精确控制刚度是水凝胶制备中的一个重要特性。

水凝胶还可用于控制药物递送。如图7A所示，并在图10中得到验证，增加PEG大分子单体的分子量可增大水凝胶网络的孔径，从而促进包封的模型药物——牛血清白蛋白（BSA）的释放。尽管本研究中的水凝胶样品在t=195小时时被破坏，以便测量其湿重和干重以计算孔径大小，但根据我们的经验，若延长孵育时间，BSA的释放仍会持续进行。在图10中观察到的BSA不完全释放现象并不意外，因为其他研究团队也报道过BSA在PEG水凝胶网络中具有抵抗扩散的特性30。包封蛋白的不完全释放可能源于蛋白质与PEG大分子之间的氢键作用，或PEG上的甲基丙烯酸酯基团与BSA中赖氨酸残基上的伯胺基团之间的共价结合31。此外，BSA随时间推移易于发生聚集和二硫键形成，这会增加其有效斯托克斯半径，从而阻碍其从水凝胶中的释放。由于此类链增长型水凝胶（如本研究所用的PEGDM水凝胶）容易产生网络非理想性及孔径分布不均（图2A），部分包封的BSA可能位于水凝胶中孔径显著小于整体平均值的区域，因而无法释放。尽管在此情况下观察到了不完全且非菲克型的释放行为（数据未显示），但已有研究表明，使用类似的PEGDM水凝胶可实现对多种其他模型药物（如胰岛素和卵清蛋白）的可控菲克型释放30。此外，Watkins和Anseth曾利用共聚焦激光扫描显微镜证明，荧光分子从类似水凝胶中的释放行为可通过菲克扩散模型进行合理拟合32。

尽管本研究中形成的水凝胶为非可降解性，但网络降解是可引入并调控于这些网络中的另一参数。实现水凝胶的可控降解可导致细胞行为的改变33促进组织生长或宿主组织长入，或消除取出移植物的需求34可降解PEG水凝胶通常通过在甲基丙烯酰化之前，将可水解降解的d,l-丙交酯、乙交酯或ε-己内酯基团开环聚合到PEG的羟基上进行合成。35这三类基团通过酯基官能团的水解而降解，其中乙交酯酯基最易降解，其次为丙交酯酯基，最后为己内酯酯基，其降解速率的差异源于它们疏水性的不同。在引入可水解降解基团后，可进一步采用本文所述的甲基丙烯酰化方法对聚乙二醇（PEG）进行功能化修饰，从而通过后续的自由基引发链式聚合反应形成水凝胶网络。36,37水凝胶网络的降解速率可通过改变可水解降解基团（乙交酯、丙交酯）的种类进行调控。 等等。通过改变结构中所掺入的可降解重复单元的数量35,38.

理论上，可通过在步骤1.3和3.3中分别将甲基丙烯酸酐替换为丙烯酸酐，实现对聚乙二醇（PEG）和肽类的丙烯酰化修饰。然而，丙烯酸酐的成本超过甲基丙烯酸酐的20倍39,40，使得微波辅助丙烯酰化相较于微波辅助甲基丙烯酰化显著缺乏经济吸引力。

我们展示了一种简单、快速的功能化PEG和多肽的方法，介绍了如何评估该方法的效率，并提供了利用合成材料形成水凝胶网络的相关资源。这些合成工具在应用上具有高度的通用性，有望成为众多药物递送和材料研究实验室中的常用技术。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作部分由霍华德·休斯医学研究院医学博士进入研究生项目资助（AVH），以及罗切斯特大学向 Danielle Benoit 博士提供的启动资金资助 以及骨科研究与教育基金会/肌肉骨骼移植基金会（Orthopaedic Research and Education Foundation/Musculoskeletal Transplant Foundation, OREF/MTF）。作者谨此感谢 James L. McGrath 博士提供设备使用支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3,6-二氧杂-1,8-辛二硫醇Tokyo Chemical Industry Co, LTDD2649CAS 14970-87-7
乙腈J.T. BakerUN1648CAS 75-05-8
氨基酸AAPPTech甘氨酸: AFG101CAS 29022-11-5
精氨酸: AFR105CAS 154445-77-9
天冬酰胺: AFD105CAS 71989-14-5
丝氨酸: AFS105CAS 71989-33-8
无水乙醚Fisher ScientificUN1155CAS 60-29-7
柠檬酸Sigma AldrichC1857CAS 77-92-9
氘代氯仿Cambridge Isotope Laboratories Inc.DLM-7-100CAS 865-49-6
二氯甲烷Fisher ScientificUN1593CAS 75-09-2
二异丙基乙胺Alfa AesarA1181CAS 7087-68-5
二甲基甲酰胺Fisher ScientificD119-4CAS 68-12-2
Fmoc-Gly-Wang 树脂Peptides InternationalRGF-1301-PI100–200 目
甲基丙烯酸酐Alfa AesarL14357CAS 760-93-0
N-甲基吡咯烷酮VWRBDH1141-4LGCAS 872-80-4
树脂上多肽本实验室合成树脂上多肽也可从 Peptides International、GenScript、AAPPTec、等公司购买
O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐AnaSpec Inc510/791-9560CAS 94790-37-1
多肽校准标准品Care206195
哌嗪Alfa AesarA15019CAS 11-85-0
线性聚乙二醇 2 kDaAlfa AesarB22181CAS 25322-68-3
线性聚乙二醇 10 kDaAlfa AesarB21955
线性聚乙二醇 20 kDaSigma Aldrich81300JenKem Technologies USA 是线性和多臂聚乙二醇的另一供应商
硫代苯醚Alfa AesarL5464CAS 100-68-5
三氟乙酸Alfa AesarA12198CAS 76-05-1
三异丙基硅烷Alfa AesarL09585CAS 6485-79-6
α-氰基-4-羟基肉桂酸Tokyo Chemical Industry Co, LTDC1768CAS 28166-41-8

参考文献

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