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方法文章

设计丝-丝蛋白合金材料用于生物医学应用

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DOI：

10.3791/50891

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2014年8月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Rowan University, 2Department of Biomedical and Translational Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Sciences, Cooper Medical School of Rowan University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Rowan University

本文内容

摘要

共混是一种高效的方法，可用于制备具有广泛性能和多种特性的生物材料。通过预测不同天然丝蛋白之间的分子相互作用，可以设计出具有可调机械韧性、电响应性、光学透明性、化学可加工性、生物降解性或热稳定性的新型丝蛋白-丝蛋白合金平台。

摘要

纤维状蛋白质具有不同的序列和结构，已被广泛应用于生物传感器、纳米医学、组织再生和药物递送等生物医学领域。通过设计基于这些蛋白质分子尺度相互作用的材料，有助于开发出具有可调控性能的新型多功能蛋白质合金生物材料。相较于传统的合成聚合物，此类合金材料体系还具有在体内可生物降解、生物相容性好以及性能可调等优势。本文以野生柞蚕丝（Antheraea pernyi）与家养桑蚕丝（Bombyx mori）的蛋白质共混体系为例，提供了与上述主题相关的实用实验方案，包括如何利用计算方法预测蛋白质-蛋白质相互作用、如何制备蛋白质合金溶液、如何通过热分析验证合金体系，以及如何制备多种功能性的合金材料，如带有衍射光栅的光学材料、具有电路涂层的电学材料，以及用于药物释放与递送的药用材料。这些方法可为基于不同蛋白质合金设计下一代多功能生物材料提供重要信息。

引言

大自然已创造出利用有限数量的结构蛋白来生成可调节且多功能生物基质的策略。例如，弹性蛋白和胶原蛋白通常被共同使用 体内 以提供特定组织所需的可调节强度和功能1,2关键在于混合。混合是指以特定比例混合蛋白质，是一种通过调节和改变材料特性来构建简单材料系统的技术方法。3-5与合成工程策略相比6,7，混合还能提高材料的均匀性以及材料的加工性能，因为操作简便8-16因此，设计多功能且生物相容的蛋白合金材料已成为医学研究的新兴领域。该技术还将系统揭示天然蛋白质基质对细胞和组织功能的影响 体外 和 体内10,17通过优化不同蛋白质之间的分子界面，基于蛋白质的合金材料可具备多种物理功能，例如在不同温度下的热稳定性、对多种组织的弹性支撑、对不同器官的电敏感性，以及用于角膜组织再生的光学特性3,18-27这些研究的结果将为生物医学科学领域提供一种新型的蛋白质-材料平台，直接关联于可调控的组织修复与疾病治疗，并进一步推动可生物降解植入装置的发展，使其具备新颖的治疗与诊断功能。3.

许多天然结构蛋白具有关键的物理和生物活性特性，可作为生物材料基质的候选物质。来自不同蠕虫物种的丝蛋白、毛发和羊毛中的角蛋白、不同组织中的弹性蛋白和胶原蛋白，以及多种植物蛋白，是目前用于设计多样化蛋白质基材料中最常见的结构蛋白（图1）18-27。通常，由于这些蛋白具有独特的重复性一级氨基酸序列，能够形成不同的分子二级结构（例如，丝蛋白的β折叠或角蛋白的卷曲螺旋）3,28-35。这些特性促进了在生物界面处形成具有独特功能的自组装宏观结构，使其成为宝贵的生物聚合物材料资源。本文以两种结构蛋白为例（野生柞蚕丝来源的蛋白A和家养桑蚕丝来源的蛋白B），展示制备多种蛋白合金生物材料的一般性实验流程。所演示的实验方案包括三部分：第一部分为蛋白相互作用的预测与模拟，第二部分为蛋白合金溶液的制备，第三部分为蛋白合金体系的构建及其在光学、电学和药物学领域的应用。

天然纤维概述：毛发角蛋白、竹子、羊毛角蛋白、弹性蛋白、桑蚕丝、柞蚕丝。
图1. 实验室中常用于设计蛋白基材料的各种结构蛋白原料，包括来自不同蠕虫物种的丝蛋白、毛发和羊毛来源的角蛋白、不同组织来源的弹性蛋白，以及多种植物蛋白。

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方案

1. 蛋白质相互作用的预测

  1. 蛋白质分子的生物信息学分析
    1. 访问美国国家生物技术信息中心网站（www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/），搜索将用于合金研究的蛋白质名称。注：本示例中使用了两种蛋白质：蛋白A，即野生柞蚕丝素蛋白；蛋白B，即家蚕桑蚕丝素蛋白。对于蛋白A，其氨基酸序列可在“fibroin [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1”中找到（Antheraea pernyi 为中华柞蚕蛾）。对于蛋白B，其氨基酸序列由“fibroin heavy chain precursor [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001106733.1”和“fibroin light chain precursor [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001037488.1”共同组成（Bombyx mori 为家养桑蚕）。
    2. 从数据库中选择并保存蛋白A和蛋白B的氨基酸序列。
    3. 访问ExPASy网站（SIB生物信息资源门户）（www.expasy.org），或使用其他商业软件，基于氨基酸序列计算蛋白质的基本生物信息学数据，包括但不限于每分子总电荷、分子疏水性指数、在不同pH值下的滴定曲线等。这些信息将作为蛋白质相互作用计算模拟的基础要素，有助于判断这两种蛋白质是否具有较强的相互作用。[注：此步骤并非用于精确预测蛋白质相互作用的每一个细节（如小肽或功能蛋白科学研究中所用），本部分的目的仅在于避免生成明显发生宏观相分离、无法称为“合金”材料的蛋白质混合物。因此，估算可为近似值，而蛋白质合金体系可通过第3.1步中描述的精确热分析实验方法进行验证]。
  2. 蛋白质合金体系的计算模拟
    以下描述模拟蛋白质合金体系的流程。该模拟程序使用C语言编写，可在单处理器或多处理器计算机系统上运行。采用格点-弹簧-质点（LSM）模型对合金蛋白质进行模拟36-39。LSM模型可简明描述连接于弹簧上的质点所受的净力，通过求解力方程可理解每个质点的运动行为。使用LSM模型模拟该蛋白质合金体系的简单程序算法如下：
    1. 将单个蛋白质表示为一个质量为m的粗粒化质点。
    2. 使用胡克型或新胡克型弹簧表示化学键38,39。通过用弹簧连接有限数量的质点，可构建代表合金蛋白质稳定结构单元的亚合金域。为表示分子内连接中不同类型的化学键，使用不同的弹簧常数/刚度。
    3. 将蛋白质合金体系建模为由完全交联的亚合金组成的材料。在此同样使用不同的刚度来表示亚合金之间交联键的不同类型。
    4. 通过Bell模型40,41模拟化学键的断裂与再形成过程，其中弱键允许重新形成，而强键一旦断裂则不可再生。当体系受到足够应力（包括亚合金内部和亚合金之间的键）时，化学键可能发生断裂与再形成。
    5. 为研究应力作用下合金蛋白质的形变效应，向体系施加外部力。在求解力方程（牛顿定律）时，将这些力均等地分配至每个质点。
    6. 为模拟溶液（如水分子）与蛋白质之间的相互作用，向每个质点施加额外的阻力或摩擦力。
    7. 综合考虑各作用力（来自化学键的弹簧力、外力及摩擦力），求解每个质点的力方程。
    8. 计算并提取蛋白质质点位置随时间的变化。
    9. 根据质点位置计算表征合金蛋白质的物理量。
    10. 在程序中改变键的刚度，以理解不同蛋白质之间的相互作用。（平均键刚度由蛋白质材料的杨氏模量计算得出。不同纤维蛋白材料的杨氏模量可通过通用拉伸试验18获得，或直接从已有文献中获取2-4,18）。

2. 蛋白合金溶液的制备

以野生柞蚕丝（蛋白A）和家养桑蚕丝（蛋白B）作为蛋白合金体系的示例。本方案首先介绍如何获得野生柞蚕丝（蛋白A）溶液。

  1. 取3 g野生柞蚕丝茧或纤维，剪碎。
  2. 称取3 g二碳酸钠或碳酸钠（注意：若使用碳酸钠，在煮沸过程中蛋白质链的分子量会降低42）。
  3. 用蒸馏水（H2O）装满一个2 L的玻璃烧杯，将烧杯置于加热台上，用铝箔覆盖后加热至沸腾。
  4. 移去铝箔盖，缓慢加入已称量的二碳酸钠，使其完全溶解。（注意：二碳酸钠的作用是作为“皂剂”去除附着在野生蚕丝纤维表面的可溶性丝胶蛋白及其他杂质。若使用其他天然蛋白质纤维，请根据文献选择相应的化学试剂）。
  5. 将生蛋白质纤维（野生蚕丝纤维）加入沸水中，持续煮沸2–3小时（注意：煮沸时间对蛋白质链的分子量有重要影响26,43。应根据文献或通过对照实验26,43选择合适的时间。煮沸温度也可调整以影响蛋白质链的分子量26,43,44）。
  6. 煮沸后，用刮铲小心地从溶液中取出蛋白质纤维，并挤压以去除多余水分。（警告：纤维温度很高！）
  7. 随后将纤维浸入盛有2 L冷蒸馏水的烧杯中，每次清洗30分钟，共清洗两次，以彻底去除纤维表面的杂质残留。在通风橱中干燥至少12小时。
  8. 在玻璃烧杯中熔化45.784 g硝酸钙（Ca(NO3)2），在65 °C下形成液体，用于溶解野生蚕丝蛋白质纤维。（注意：若使用其他天然蛋白质纤维，请选择相应的溶剂来溶解蛋白质。此处也可使用9.3 M的硫氰酸锂（LiSCN）或溴化锂（LiBr）溶液，或85%的磷酸溶液来溶解不同类型的蚕丝纤维。）
  9. 按每1 g纤维加入10 ml溶剂的比例混合纤维与溶剂，在95 °C下溶解5至12小时。（注意：溶解时间取决于蛋白质的分子量26,43-45）
  10. 使用注射器将野生蚕丝溶液注入12 ml透析盒（截留分子量上限为1,000）或密封透析管（截留分子量上限为1,000），并在2 L蒸馏水中进行透析。（注意：若保持溶液温度在35 °C，注射效率更高；否则在室温下蛋白质溶液的黏度将显著增加）。频繁更换蒸馏水以去除溶液中的Ca(NO3)2溶剂（分别在30分钟、2小时、6小时后，之后每12小时一次，持续3天。总共约更换8次水）。
  11. 3天后，从透析盒或透析管中收集蛋白质溶液，并转移至可承受13,000 rpm转速的离心管中。
  12. 在4 °C条件下，以3,500 rpm离心1小时，重复3次，以去除沉淀物。每次离心后，迅速将上清液转移至新的离心管中。最终溶液储存于4 °C冰箱中。
  13. 将5 ml蛋白质溶液倒入聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底或其他平坦疏水基底上，使其完全干燥（通常需超过12小时）。称量残留的固体蛋白膜，并通过重量百分比（w/v%）计算最终溶液浓度：浓度（w/v%）= 测得重量（mg）÷ 5（ml）÷ 10。
  14. 另取一种选定的天然蛋白质纤维（本例中使用家蚕丝作为蛋白B），重复上述流程，选用适当的“皂剂”和溶解溶剂，直至获得浓度已知的最终蛋白质水溶液。[注意：若蛋白质材料为粉末形式，在“皂洗”过程中应使用适当的多孔管或膜来承载样品。若蛋白质已纯化，可直接进入步骤2.8溶解粉末。若蛋白质已纯化且可溶于水，应先配制所需浓度的水溶液，然后进入下文步骤2.15制备混合蛋白质溶液。]
  15. 在4 °C下，用蒸馏水缓慢稀释蛋白A溶液（此处为野生蚕丝溶液），制备成1.0 wt%的蛋白A水溶液。对蛋白B（此处为家蚕丝）进行相同操作。
  16. 在4 °C下，使用移液器缓慢混合1 wt%的蛋白A溶液与蛋白B溶液，以避免混合过程中发生蛋白质聚集。（注意1：请勿使用涡旋振荡器混合蛋白质，因为某些蛋白质（例如，蚕丝蛋白）在振动下会形成水凝胶46,47。注意2：如有可能，使用额外装置控制混合速率和混合规模，确保尽可能缓慢混合，避免聚集。混合过程中切勿快速移液）。
  17. 最终的混合溶液应具有指定的质量比或摩尔比的蛋白A:蛋白B。通常按质量比90:10、75:25、50:50、25:75、10:90进行混合，以获得一系列合金溶液。以纯蛋白A和纯蛋白B溶液作为对照。对于摩尔比为蛋白A:蛋白B = R: (100-R)的混合溶液，计算混合体积比（基于相同1 wt%溶液）：体积A:体积B = R·(A的分子量): (100-R)·(B的分子量)。
  18. 立即将在4 °C下制备的最终混合溶液浇铸到PDMS基底上，形成薄膜或其他设计材料。（注意：高浓度蛋白质合金溶液不宜长期储存，因蛋白质在水中的相互作用可能导致后续形成更多聚集体。如有需要，可用无离子蒸馏水稀释混合溶液，并保存于4 °C冰箱中，以避免溶液中额外的蛋白质聚集）。

3. 可变蛋白质合金材料的制备

  1. 通过热分析验证合金预测3,9,31-35
    1. 制备PDMS基底，并通过浸泡于蒸馏水中进行清洗。
    2. 将不同混合比例的蛋白质混合溶液浇铸到PDMS基底上。
    3. 在通风橱中用气流干燥溶液至少12小时，直至形成薄膜（注意：不同溶液应使用相同体积，以确保薄膜厚度一致）。
    4. 将蛋白合金薄膜从PDMS基底上取下，并放置于洁净的培养皿中。
    5. 称量多个用于差示扫描量热法（DSC）研究的铝制坩埚和坩埚盖。将坩埚与盖子配对，使其总重量相等（即坩埚重量加盖子重量等于某一恒定值）。例如，此处使用了总重量为22.50 mg的坩埚和盖子组合，共准备了八组具有该总重量的坩埚-盖子配对组合。
    6. 将每种6 mg的干燥蛋白质混合物分别封装到铝制DSC坩埚中，并在步骤3.1.5中使用匹配的盖子进行密封。同时密封一对空坩埚和盖子作为参比，与样品一同使用，以便在热分析过程中仅记录样品自身的热容（注意：DSC将比较参比坩埚+盖子与样品+坩埚+盖子的热容。由于重量相等，坩埚和盖子带来的背景热容将被抵消，最终仅保留样品的热容信号）。
    7. 将密封的参比坩埚和样品坩埚放入DSC仪器中，通入流速为50 ml/min的吹扫干燥氮气，并配备制冷冷却系统。在进行样品测量之前，应先使用蓝宝石和铟分别对DSC仪器的热流和温度进行校准。
    8. 以2 K/min的升温速率将DSC预运行至150 °C，随后在此温度下保持15 min，以去除样品中残留的水分（通常占总质量的3–10%）。然后以10 K/min的速率快速冷却至25 °C。
    9. 以 2 K/min 的升温速率再次运行 DSC 至 300 °C，或直至蛋白质混合物的降解峰出现34记录在此过程中蛋白质样品在不同温度下的热容。将DSC降温后，将旧样品更换为具有不同混合比例的新样品。
    10. 使用DSC软件计算并绘制每种蛋白质混合样品的热容-温度曲线31-35.
    11. 通过以下方法判断蛋白质混合物的相容性（参见 图4 热学与 图5）如果这两种蛋白质完全互溶，则可称之为“蛋白质合金”；否则，根据聚合物描述理论，“蛋白质复合物”将是更合适的名称48,49):
      1. 单个蛋白质 A 和 B 应具有各自的单一玻璃化转变温度 Tg（A）和 Tg（B）（见图中的绿色和蓝色曲线） 图5)3,48;
      2. 该单一玻璃化转变温度通常介于两种单独蛋白质组分的玻璃化转变温度之间，Tg （A）和 Tg (B) （参见 图5)3,48;
      3. 若两种组分的混合物满足双节线条件，则可获得不相混溶的相分离混合物g（A）和 Tg（B）出现在其原始位置图5），并且每个 Tg 台阶高度与组分成正比，两种蛋白质完全不相溶3,48.
      4. 半相容性复合共混物将表现出一个非常宽的玻璃化转变，或者仍可能具有两个玻璃化转变，但相较于纯蛋白质组分，这两个转变温度彼此更接近g（A）和 Tg(B)（参见 图5在这种情况下，两种蛋白质组分之间可能形成微小的非均相结构，且其组成可能随位置不同而变化。
    12. 如果DSC中显示的情况符合(3.1.11.1)，并可确认蛋白A-B为合金体系，则继续制备蛋白合金材料。
  2. 利用蛋白质合金制备光学材料
    1. 在制造实验室中制备或外购设计好的拓扑表面用于浇铸。在此具体示例中，使用了一块带有四种衍射图案的玻璃（图4 光学
    2. 将带有衍射图案的玻璃放入培养皿中，确保图案面朝上。
    3. 将PDMS溶液均匀涂布在玻璃表面，完全覆盖表面图案（PDMS溶液按使用说明以9:1的混合比例由浇注液与催化剂溶液配制而成）23,44).
    4. 将浇铸皿置于平坦的表面上，放入65 °C的烘箱中至少2小时。在此过程中，PDMS溶液应干燥形成固体基质。
    5. 将PDMS基底从玻璃上取下。此时，衍射图案应已转移到PDMS表面。
    6. 使用合适的打孔器将带有衍射图案的PDMS模具打孔取出。
    7. 将蛋白合金溶液滴加到具有衍射图案的PDMS表面，并干燥至少12小时，以获得具有衍射图案的薄膜。
    8. 为获得不溶性蛋白合金材料，将包括PDMS模具在内的整套干膜置于真空烘箱中（60 °C，25 kPa），并在烘箱底部放置盛有水的培养皿。抽去烘箱中的空气，使水蒸气对样品进行至少2小时的退火处理。（该过程称为温度控制的水蒸气退火）45与广泛使用的甲醇法相比，该方法可在蚕丝材料中产生相似的β-折叠含量45）。释放真空，用镊子将不溶于水的薄膜从PDMS基底上剥离。本示例中使用的是野蚕丝-家蚕丝合金。
    9. 通过将胶片上的衍射图样与玻璃上的原始图样进行比较，检测胶片上衍射图样的质量（例如，采集扫描电镜图像以观察微米级细节；采集激光衍射图样以评估整体图样质量。
  3. 在蛋白质合金材料上制备电路
    1. 在玻璃基底上制备电路图案时，首先使用去脂溶剂（如Alconox）在超声波清洗器中清洗载玻片5分钟，接着用丙酮清洗5分钟，再用甲醇清洗5分钟。甲醇置于最后使用，因其蒸发速度较丙酮慢，可通过吹气去除，避免自然干燥后残留杂质。
    2. 使用180 L液氮杜瓦瓶汽化产生的干燥氮气将玻片吹干。
    3. 将基底材料引入沉积腔室。（这些指南适用于溅射系统，但也可使用其他沉积技术。）如果腔室配有负载锁，则沉积腔室内的真空不会受到显著影响。将负载锁抽真空至30 mTorr的压力。
    4. 打开负载锁与主沉积室之间的闸阀，将衬底引入腔室。
    5. 打开氩气和压力调节器，并将压力控制在所需的沉积压力。较高的压力会产生能量较低的溅射金属原子和更均匀的薄膜，而较低的压力则会得到附着性更好、沉积更快的薄膜。压力范围通常在3 mTorr至60 mTorr之间，20 mTorr较为适宜。
    6. 然后使用100 W的射频功率将金属沉积到快门上，以保护基底不被镀膜。需要使用调谐电路将射频功率导向金属靶材。对于金属靶材，可使用直流功率代替射频功率。为去除靶材表面的氧化层和污染物，需预溅射数分钟。
    7. 打开快门，将金属溅射到基底上。所述配置下的沉积速率约为每分钟10 nm。该速率取决于工作距离、气压、磁控阴极的磁体强度、靶材厚度以及所溅射的金属种类。调整沉积时间以达到所需的厚度。
    8. 从孵育 chamber 中取出包被的玻片。
    9. 使用匀胶机将光刻胶涂覆在薄膜表面。可选用多种光刻胶，本实验采用正性光刻胶。
    10. 光刻胶旋涂到薄膜上后，在 90 °C 下预烘 5 分钟以干燥光刻胶。
    11. 将带有器件图像的接触掩膜紧密贴合在光刻胶上。使用紫外光源曝光光刻胶，曝光时间为10秒，具体时间根据光源强度和所用光刻胶的特性可作调整。
    12. 将胶片放入光刻胶显影液中，直至出现投影图像。显影液会洗去被紫外光照射而发生聚合物键断裂的光刻胶。图像一出现，立即将胶片浸入去离子水中，以终止显影液对未曝光光刻胶的作用。
    13. 用干燥的氮气吹干薄膜。
    14. 将薄膜置于120 °C的烘箱中加热15分钟，以对光刻胶进行“硬烘焙”。
    15. 待薄膜冷却后，将其放入蚀刻液中，直至未被光刻胶保护的金属层脱落。随后浸入水中以终止蚀刻反应。
    16. 用丙酮冲洗以去除固化的光刻胶。
    17. 用甲醇冲洗，并用干燥氮气吹干。
    18. 待镀膜的玻璃制备完成后，将不同的蛋白质合金溶液滴加到玻璃表面，并干燥至少12小时，以获得玻璃上的蛋白质合金薄膜。（建议先将合金溶液浓缩至5 wt%，以制备较厚的蛋白质合金薄膜。）
    19. 由于疏水-亲水相互作用，薄金属膜将从玻璃表面转移到附着的蛋白质合金膜表面51用镊子将带有薄金属图案的蛋白合金薄膜从玻璃基底上剥离下来。
    20. 将干燥的薄膜放入真空烘箱中（60 °C，25 kPa），并在烘箱底部放置一个盛有水的培养皿。抽真空，使水蒸气对样品进行至少2小时的退火处理。释放真空后，用镊子将不溶于水的薄膜从基底上剥离下来。
    21. 测试蛋白质合金薄膜上金属图案的电学性能（如电阻），并将其与玻璃基底上的原始图案进行比较。
  4. 利用蛋白质合金制备药物材料
    1. 制备含有药物化合物的蛋白质合金薄膜时，首先按照步骤3.2所述制备PDMS基底。用蒸馏水清洗成型的PDMS基底。
    2. 将药物化合物溶解或分散于水溶液中。使用超声或涡旋振荡使药物化合物与水均匀混合。若化合物不溶于水，则将粉末分散于无离子的蒸馏水中，并确保分布均匀。
    3. 通过以下公式计算化合物与蛋白质合金的所需质量比：化合物溶液体积 × 化合物溶液的质量百分比：蛋白质合金溶液的体积 × 化合物溶液的质量百分比（此处使用1 wt%的合金溶液）。选择适当比例，以获得蛋白质合金薄膜中具有理想化合物密度的薄膜。
    4. 按照第2节步骤2.16中的相同说明，将化合物溶液缓慢地与蛋白质合金溶液混合。（注意：为避免发生凝胶化，混合过程中不得对溶液进行超声处理或涡旋振荡。）
    5. 将计算体积的混合物倒入PDMS基底上，并干燥至少12小时 在化学通风橱中制备含有特定比例药物化合物的蛋白质合金薄膜。
    6. 按照第3.2节步骤3.2.8中的相同说明对薄膜进行物理交联。可观察到含有低密度（LD）或高密度（HD）不溶性模型药物的合金薄膜示例 图 4 化学物质。

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结果

典型的蛋白质-蛋白质相互作用（例如，蛋白质A与蛋白质B之间）可能包含电荷-电荷（静电）吸引、氢键形成、疏水-亲水相互作用，以及两种蛋白质特定结构域之间的偶极、溶剂、反离子和熵效应图2)3因此，从本质上讲，我们可以通过计算机模拟来预测这些相互作用的效果。

蛋白质相互作用示意图：电荷、氢键、疏水相互作用。分子结合研究。
图2. 蛋白质A与蛋白质B之间的相互作用。 这些相互作用通常基于两种蛋白质特定结构域之间的电荷-电荷（静电）吸引、氢键形成或疏水-亲水相互作用。

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讨论

生产“合金”蛋白体系中最关键的步骤之一是验证混合蛋白的相容性。否则，该体系仅是一种不相容的蛋白混合物或蛋白复合系统，不具备稳定且可调控的特性。可通过实验性的热分析方法来实现这一目的，并确认其合金特性。蛋白-蛋白相互作用可根据Flory-Huggins晶格模型进行分析。48 基于“溶剂”（主要蛋白质组分）与“溶质”（次要蛋白质组分）之间相互作用的模型，混合过程中“溶剂”与“溶质”之间的自由能变化决定了该混合物的混溶性。48通常，混溶性可分为三种不同情况：（a）完全混溶（宏观上形成单相材料），（b）亚稳态混溶（材料中形成部分混溶的相），（c）不混溶（保持原有的两相结构，分别为蛋白质A和蛋白质B的区域）3,48相应地，双蛋白质体系的玻璃化转变行为可以体现这些差异，并可通过相图模型理想地加以表达（图 6）。例如，如果蛋白质 A 和 B 各自具有独立的玻璃化转变温度 Tg（A）和 Tg（B），分别图 6 绿色和蓝色曲线），一个完全互溶的蛋白质合金体系在...

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致谢

作者感谢罗文大学对本研究的支持。XH 还感谢塔夫茨大学的 David L. Kaplan 博士以及美国国立卫生研究院 P41 组织工程资源中心（TERC）提供的前期技术培训。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Q100 差示扫描量热仪 (DSC)TA Instruments, New Castle, DE, USA
N/A可使用任何带有计算热容软件的DSC仪器。
SS30T 真空溅射系统 T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USAN/A配备定制部件；可使用任何类型的溅射系统进行镀膜。
VWR 1415M 真空烘箱VWR International, Bridgeport, NJ, USAN/A可使用任何类型的真空烘箱对样品进行物理交联。

参考文献

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