早期变态期植入技术用于昆虫飞行行为监测

摘要

我们介绍一种在烟草天蛾（Manduca sexta）早期变态阶段植入电极的新型外科手术方法。该技术可实现与神经肌肉组织在机械上的稳定性和电学上的可靠连接，用于研究飞行神经生理学动态。我们还介绍一种用于束缚昆虫偏航研究的新型磁悬浮平台。

摘要

早期变态植入技术（EMIT）是一种新颖的方法，可在昆虫变态发育过程中将其微加工的神经肌肉记录与驱动平台整合到体内。在此过程中，植入物随着变态期间组织的重塑而融合于神经肌肉系统的结构与功能之中。当昆虫发育成熟时，植入物随之显现，且在蛹期发育过程中，组织在电子元件周围生长，形成生物电与生物力学性能增强的组织界面。相较于成虫阶段植入所引发的创伤效应，这种相对更可靠且稳定的界面将有利于众多研究者探索昆虫运动的神经基础。本文中，我们将电极植入烟草天蛾（Manduca sexta）的间接飞行肌内。这些主要的飞行动力肌群——背腹肌与纵背肌，位于胸部背侧，负责驱动翅膀，为上下拍打提供机械动力。目前已有研究致力于探究这两组肌肉的相对收缩如何在神经生理学层面协调偏航（yaw）动作。为了表征飞行动态，通常将昆虫通过导线固定，并利用数字相机记录其飞行行为。我们还开发了一种新颖的方法，将烟草天蛾（Manduca sexta）固定于磁悬浮框架上，使昆虫与市售的无线神经信号放大器相连。该装置可用于限制昆虫仅在偏航方向上自由运动，同时传输来自背腹肌与纵背肌群的相关肌电图信号。

引言

将电极甚至带有电子系统的装置植入昆虫体内，用于遥测记录，一直是研究神经系统在自然飞行过程中如何发挥作用的主要方法¹。然而，在昆虫体内附着或植入人工系统面临诸多挑战，尤其是可能干扰昆虫的自然飞行行为。成虫体表附着或外科手术植入的人工平台并不可靠，因为昆虫身体产生的惯性力和应力可能导致植入装置发生位移。此外，体表附着或手术植入的电极也容易被昆虫识别为异物而遭到排斥。同时，植入操作需要去除昆虫外骨骼周围的鳞片和刚毛，还需穿透较厚的角质层以实现神经连接，这可能造成附带的组织损伤，从而影响昆虫的正常飞行。上述种种因素使得外科手术或体表植入操作成为一项复杂而精细的任务。为缓解在昆虫体外附着控制与传感系统所带来的上述问题，本文将介绍一种涉及变态发育过程的新型方法。

完全变态昆虫的变态发育始于幼虫（或若虫）向成虫的转变，并经历一个中间的蛹期（图1）。这一变态过程涉及广泛的组织重编程，包括组织退化继而重塑。该转变使陆生幼虫发育为能够表现出多种复杂行为的成虫^2,3。

已有研究表明，昆虫在早期变态阶段接受极端的寄生性外科手术后仍可存活^4,5。在此类手术中，发育过程中的组织发生使得手术创口能够在较短时间内得到修复。基于这些观察结果，研究人员开发出一种新技术，即在变态生长的早期阶段植入电导性电极（图1）⁶。该方法可实现电极在昆虫体表的生物力学稳定附着，同时也能与昆虫的神经及神经肌肉系统建立高度可靠的接口⁷。该技术被称为“早期变态植入技术”（Early Metamorphosis Insertion Technology，EMIT）⁸。

在组织系统完全重建后，蛹期形成的结构会随成虫的羽化而显现。飞行肌群可占胸部总质量的65%，因此是EMIT实验方法相对便捷的目标组织⁹。在基本的翅拍动过程中，驱动飞行的背纵肌（dl）和背腹肌（dv）形态发生变化，从而引起翅关节几何结构的改变以产生升力¹⁰。因此，dl与dv肌肉的功能协调一直是飞行神经生理学领域的研究热点。将昆虫固定于电子编程的视觉环境中，是研究复杂运动行为神经生理机制最常用的方法^11,12。由发光二极管面板构成的圆柱形实验场已被用于构建此类虚拟现实环境，其中飞行昆虫被固定于中央，通过动态更新周围全景视觉显示来模拟运动。对于果蝇（Drosophila）等体型较小的昆虫，通常通过将金属针固定于昆虫背部胸部，并将该针置于永磁体下方实现固定^13,14。该方法仅能借助高速摄像机进行视觉观察，从而量化运动反应，无法开展任何电生理分析。此外，该方法难以有效悬浮体型更大、更重的烟草天蛾（Manduca sexta）。为解决这一问题，我们采用了磁悬浮框架技术，即利用电磁力使底部附有磁体的轻质框架实现悬浮。结合市售的神经信号放大器与LED阵列，该系统为控制烟草天蛾（Manduca sexta）的飞行运动输出并记录其相关电生理活动提供了有效平台。

方案

注意：本实验方案所需材料与试剂的来源详见下表“试剂”部分。

1. 准备用于记录电极连接的印刷电路板（PCB）

注意：为了提供一种实用的实验操作步骤，需将导线电极焊接到印刷电路板（PCB）上，以便将这些电极插入扁平柔性电缆（FFC）连接器中。

1. 裁剪一块 0.5×5 cm² 的覆铜板。
2. 使用细头记号笔，在板上绘制三个 0.1×5 cm² 的矩形焊盘，作为蚀刻掩模图案。
3. 在通风橱或通风良好的区域中，使用印制电路板（PCB）蚀刻剂蚀刻暴露的覆铜板。用惰性胶带覆盖裁切部分约 1 cm 长度。向量筒烧杯中加入至少 100 ml 的 PCB 蚀刻剂，并用透明胶带将覆铜板固定在烧杯内壁，使覆铜板的一半浸入蚀刻剂中。
4. 将烧杯置于旋转平台上，持续 20 分钟。
5. 将覆铜板从蚀刻剂中取出，放入盛有水的烧杯中浸泡 10 分钟。
6. 用纸巾蘸取异丙醇，擦除标记，暴露出未被蚀刻的铜焊盘。
7. 将印制电路板切割成若干边长约 1 cm 的小方块。
8. 使用锋利刀片将两段带涂层的退火不锈钢丝（涂层直径 0.11 英寸，裸丝直径 0.008 英寸）各切成 3 cm 长。这些不锈钢丝即为将插入昆虫胸腔的活性电极。
9. 使用刀片从每根导线的两端去除 4–5 mm 的塑料涂层。建议在显微镜下操作。
10. 截取一段 0.7 cm 长的绝缘不锈钢丝，作为接地电极的尖端延长部分。用刀片小心去除涂层，或如步骤 1.9 所述，使用电烙铁加热熔化涂层。
11. 为接地连接，截取一段长度为 4.5 cm 的柔性导线（利兹线或电感线）。
12. 将步骤 1.10 中制备的 0.7 cm 不锈钢丝焊接到步骤 1.11 中制备的接地连接导线上。接地连接末端应露出一段不锈钢尖端。
13. 使用惰性胶带将制备好的电极板牢固地固定在焊接工作区。用胶带遮蔽电极板上除 1–2 mm 以外的所有焊盘区域，仅留出将要焊接电极的位置。该被遮蔽且无焊料的焊盘末端将插入步骤 4.1 中所述的 FFC 连接器。
14. 对齐三根电极导线，使每根导线的一端可焊接到电极板上对应的焊盘。在电极焊盘上涂抹不锈钢助焊剂，以利于焊接。
15. 将各暴露的电极焊接到焊盘上。
16. 将电极先后浸入丙酮和异丙醇中各 10 分钟，以清除焊渣。使用超声波清洗仪可提高清洁效果。

2. 手术植入至 烟草天蛾（Manduca sexta） 蛹

注意：昆虫在昼夜交替期间最为活跃。因此，应使用自动插座定时器在昆虫培养箱内建立人工昼夜循环，设定为模拟7小时黑暗和17小时光照的周期。

1. 每天检查烟草天蛾（Manduca sexta）蛹，以确定合适的电极插入时间。通常在翅膀出现深色斑点约一天后，蛹即适合进行电极插入。
2. 为使蛹麻醉，将其置于冰箱（4°C）中约6小时。
3. 准备电极插入的工作区域。工作区应配备异丙醇、尖头镊子、刀片和30 G皮下注射针头。可选地，可使用氰基丙烯酸酯胶水以增强电极的固定效果。
4. 通过将针头、镊子和电极浸入或擦拭异丙醇进行消毒。
5. 将蛹从冰箱中取出，并转移至工作区。
6. 确定胸部对应目标肌群的位置。本示例研究的重点是负责翅膀上拍运动的背腹肌。
7. 使用锋利刀片，轻轻在体壁外层划出一个1×1 cm²的矩形区域，并用镊子缓慢剥离该区域的表皮。
8. （可选）使用真空装置清除胸部暴露区域的翅毛。
9. 将针头缓慢插入中胸约5 mm深，插入位置应位于翅膀与胸部连接处，形成两个针对目标肌群的穿刺点。
10. 使用镊子将两个记录电极引导插入上述两个穿刺点中。
11. （可选）为提高机械稳定性，用导线涂抹器在胸部每个穿刺点周围充分涂抹氰基丙烯酸酯胶水，并清理电极周围的毛发。
12. 准备一个成虫羽化用的笼子，笼壁和顶部应覆盖适当材料（粗糙且有纹理），以便昆虫羽化后能够攀爬。可使用打孔纸板盒或包装纸。
13. 准备一根长约6 cm、直径约2 mm的刚性固定棒。塑料搅拌棒、棉签或金属丝均可用于此步骤。
14. 小心地将此固定棒从喙管下方的孔洞中穿入。
15. 将固定棒两端固定在笼壁表面，防止蛹滚动。将蛹置于笼内，使中胸朝上。过度移动可能导致电极损伤、血淋巴流失或使插入失效。

3. 将接地电极插入烟草天蛾（Manduca sexta）

注意：应将接地（参考）电极插入腹部或胸部的远端部位，以避免信号耦合。该插入操作可在蛹发育的后期阶段进行，也可在昆虫羽化后进行。无论计划在蛹期还是成虫期插入接地电极，都必须在蛹期制备好接地电极的开窗位置。

1. 对于蛹期插入：在剥离活动电极周围的中胸表皮后（见步骤2.7），使用30 G皮下针头在靠近胸部的腹部背侧外角质层上刮出另一个矩形区域（约0.5×0.5 cm²）。按照第2节所述技术，将接地电极插入此窗口。
2. 对于成虫期接地电极插入：昆虫羽化后，将其置于4 °C冰箱中6至24小时以固定不动。
   后续步骤在蛹期和成虫期插入中均相同。
3. 准备插入操作区域，包括异丙醇、尖头镊子、30 G皮下针头、氰基丙烯酸酯粘合剂、一段用于涂胶的金属丝、热灼器（可选）以及牙科蜡棒（可选）。
4. 在记录电极后方约1-2 cm处的腹部后段，确定一个插入点。
5. 缓慢插入针头以刺破腹部，形成电极插入位点。
6. 用镊子小心地将接地电极插入该位点，并施加压力使其深入3-4 mm。固定电极位置，并用金属丝将胶水涂抹于插入部位周围。
7. （可选）为增强机械稳定性，可使用热灼器在尖端熔化收集一小滴蜡（2-3 mm），将尖端靠近插入部位并加热，使蜡包裹电极并牢固固定其位置。

4. 适配板的制备

注意：需要使用转接板通过 FFC（扁平柔性电缆）连接器将电极板连接到无线记录前置放大器。为此，需按照步骤 1.1 至 1.7 制备一块与电极板类似的电路板。

1. 将FFC连接器焊接到已准备好的电路板一端。
2. 将三根30 AWG（美国线规）导线焊接到另一端的三个焊盘上。
3. 根据下一阶段的说明，将三个微型连接器焊接到适配板上的三个焊盘，用于示波器读数。
4. 将这三根导线的另一端焊接到前置放大器连接器上。
5. 将前置放大器电路板固定在悬浮框架的顶部。

5. 使用示波器进行预录制（可选）

注意：为了评估电极的可靠性并观察信噪比，可在部署无线记录系统之前获取有线示波器记录。应使用转接板上的微型导线连接器进行此项操作。

1. 将示波器连接至细胞外神经记录放大器。将放大器参数设置为高通截止频率 1 Hz，低通截止频率 20 kHz，增益为 100。
2. 将适配板上的每个雌性微型导线连接器连接至放大器的输入通道。
3. 当昆虫处于活跃状态（黎明时段）时，将其从饲养笼中取出。在测量前，在昆虫下方放置一张纸巾供其静止休息。
4. 使用镊子将电极板滑入适配板上的 FFC 接口。当昆虫静止时，观察示波器上平坦且低电压的基线；当昆虫拍打翅膀时，可观察到肌电图（EMG）尖峰信号。
   注：有关示波器结果的代表性示例，请参见第 6 节：使用无线记录系统观察昆虫飞行。
5. 根据需要调整示波器的显示参数。捕获示波器上的数据并保存。

6. 使用无线记录系统观察昆虫飞行

注意：可构建一种电磁悬浮平台，用于在束缚状态下对烟草天蛾（Manduca sexta）飞行期间进行无线肌电（EMG）信号记录。该悬浮平台由一个框架构成，设计用于平衡束缚装置。悬浮结构使得框架及附着其上的昆虫在测试过程中可自由偏航，而无需受束缚导线的限制。该框架可通过熔融沉积成型（FDM）设备快速原型制造。需在框架底部安装磁铁，使其可通过基座平台中的一组磁铁实现悬浮。昆虫通过连接至框架顶部悬挂的FFC连接器进行固定。该悬浮平台置于LED刺激场内，刺激场由60块面板构成，每块面板包含5×7阵列的独立LED。该系统基于果蝇视觉刺激环境构建的成熟方法¹⁵,¹⁶,¹⁷。刺激场由微控制器控制，可模拟顺时针与逆时针旋转，并可调节旋转速度。

1. 通过将头戴装置连接到悬浮平台上的适配器板连接器，设置无线记录系统。
2. 当昆虫处于活跃状态时（最好在其黎明活动期），将其从笼中取出。
3. 使用镊子小心地将电极板插入悬浮框架上的FFC接收端口中，使昆虫在装置内稳定悬浮。
4. 将磁棒靠近头戴装置上的磁性开关以激活无线数据传输。蓝色指示灯亮起，表示头戴装置已激活。
5. 关闭房间灯光以实现完全黑暗环境。可使用红灯为房间提供照明。在计算机上打开遥测数据采集软件，并选择相应的预加载配置文件（如提供）。启动数据采集以开始查看信号。
6. 在无线记录系统上选择相应的用户界面以观察EMG信号，确保无线连接和电极工作可靠。
7. 打开所有LED实验区组件：稳压直流电源和微控制器。微控制器可调节循环光模式的每分钟转速，并可控制光旋转的方向。
8. 在实验区内缓慢平衡悬浮平台。仔细将框架对准悬浮底座中心，否则框架会迅速被拉向地面，可能导致昆虫受伤。
9. 启动视频记录系统。
10. 选择软件界面中的相应记录选项卡。设定记录时间和文件保存路径。选择适当的输出设置以保存数据。点击开始按钮，在软件中启动记录会话。这将保存可导入数值计算环境的数据文件。
11. 观察昆虫是否沿LED移动方向飞行。反转LED方向，并确认昆虫随之反向飞行。可根据需要重复此操作多次。

结果

整体EMIT流程的示意图见图1，展示了天蛾变态周期的主要阶段以及相应的电极植入步骤。电极植入应在羽化前4至7天的晚期蛹阶段进行。这使得肌纤维能够在电极周围发育，从而将植入物牢固地固定在昆虫体内。

完成晚期蛹期阶段插入的典型结果如图2所示，其中两个记录电极和接地电极均已插入。

完成成年阶段插入后的典型结果如图3所示，其中两个有源电极和接地电极均已插入。

用于诱导 Manduca sexta 飞行过程中转向的LED arena如图4所示。通过编程微控制器以控制LED阵列垂直图案的旋转速度，LED图案的角速度设定为7.3度每秒。将磁悬浮平台置于LED arena的中心，使昆虫能够自由地响应LED阵列而转动。

图5显示了在翅膀拍打前后，通过...

讨论

在手术植入记录电极的过程中，有几个关键步骤会影响后续实验步骤中的数据记录能力。记录电极应在蛹体背部出现翅斑后一天插入。如果插入操作在此时间点之后两天或更久才进行，昆虫的组织将没有足够时间在电极周围发育并使其稳定。这可能导致成虫阶段植入电极发生移动，从而造成记录结果不可靠。

记录电极插入蛹期飞行肌的深度不得超过5 mm，否则血淋巴会从插入点渗出，导致飞行肌发育较弱。如果出现血淋巴渗出，应立即停止操作，让蛹恢复24小时后再尝试插入电极。在将电极插入蛹体前，应彻底清除插入部位的所有翅毛，以防止毛发进入插入孔并干扰电极与组织之间的接触界面。

为了确保成年蛾翅膀的健康，应在羽化前一天使用镊子重新清理插入部位的翅毛。此外，建议使用镊子松动之前用皮下注射针头切开的角质层窗口边缘，以帮助蛾在次日顺利羽化。如果角质层窗口边缘附近有胶水或血淋巴干涸，蛾在羽化后将无法充盈其翅膀，该样本将无法用于实验。

尽管插入时间以天数给出，但由于变温动物的变态发育时间进程取决于饲养温度，这些时间可能会略有差...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
包被不锈钢丝	A-M Systems	791900	0.008’’ 裸线，0.011’’ 包被，经退火处理
柔性电极导线			可使用利兹线（Litz）或电感线。
表面贴装FFC连接器	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
镊子	Grobet USA		使用前需用70%酒精清洁。
Kim-Wipes 擦拭纸	Kimberly-Clark Worldwide	34155	可使用任意尺寸的精细擦拭纸巾。
聚四氟乙烯胶带			5 mm 宽的聚四氟乙烯胶带。
皮下注射针头	Becton Dickinson & Co.	30511	可使用20–30 G的皮下注射针头。视频中展示的是30 G针头。
刚性固定棒			可使用多种材料（例如，咖啡搅拌棒）
昆虫羽化笼			塑料宠物笼，内衬包装纸或类似缓冲材料，需有通风孔。
热灼器	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	可选设备，用于加热牙科蜡。
牙科蜡	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		可选材料，用于稳定昆虫上的电极。
磁悬浮平台			自行设计并利用3D打印技术制作的定制框架。