早期变态期植入技术用于昆虫飞行行为监测

摘要

我们介绍一种在烟草天蛾（Manduca sexta）早期变态阶段植入电极的新型外科手术方法。该技术可实现与神经肌肉组织在机械上的稳定性和电学上的可靠连接，用于研究飞行神经生理学动态。我们还介绍一种用于束缚昆虫偏航研究的新型磁悬浮平台。

摘要

早期变态植入技术（EMIT）是一种新颖的方法，可在昆虫变态发育过程中将其微加工的神经肌肉记录与驱动平台整合到体内。在此过程中，植入物随着变态期间组织的重塑而融合于神经肌肉系统的结构与功能之中。当昆虫发育成熟时，植入物随之显现，且在蛹期发育过程中，组织在电子元件周围生长，形成生物电与生物力学性能增强的组织界面。相较于成虫阶段植入所引发的创伤效应，这种相对更可靠且稳定的界面将有利于众多研究者探索昆虫运动的神经基础。本文中，我们将电极植入烟草天蛾（Manduca sexta）的间接飞行肌内。这些主要的飞行动力肌群——背腹肌与纵背肌，位于胸部背侧，负责驱动翅膀，为上下拍打提供机械动力。目前已有研究致力于探究这两组肌肉的相对收缩如何在神经生理学层面协调偏航（yaw）动作。为了表征飞行动态，通常将昆虫通过导线固定，并利用数字相机记录其飞行行为。我们还开发了一种新颖的方法，将烟草天蛾（Manduca sexta）固定于磁悬浮框架上，使昆虫与市售的无线神经信号放大器相连。该装置可用于限制昆虫仅在偏航方向上自由运动，同时传输来自背腹肌与纵背肌群的相关肌电图信号。

引言

将电极甚至带有电子系统的装置植入昆虫体内，用于遥测记录，一直是研究神经系统在自然飞行过程中如何发挥作用的主要方法¹。然而，在昆虫体内附着或植入人工系统面临诸多挑战，尤其是可能干扰昆虫的自然飞行行为。成虫体表附着或外科手术植入的人工平台并不可靠，因为昆虫身体产生的惯性力和应力可能导致植入装置发生位移。此外，体表附着或手术植入的电极也容易被昆虫识别为异物而遭到排斥。同时，植入操作需要去除昆虫外骨骼周围的鳞片和刚毛，还需穿透较厚的角质层以实现神经连接，这可能造成附带的组织损伤，从而影响昆虫的正常飞行。上述种种因素使得外科手术或体表植入操作成为一项复杂而精细的任务。为缓解在昆虫体外附着控制与传感系统所带来的上述问题，本文将介绍一种涉及变态发育过程的新型方法。

完全变态昆虫的变态发育始于幼虫（或若虫）向成虫的转变，并经历一个中间的蛹期（图1）。这一变态过程涉及广泛的组织重编程，包括组织退化继而重塑。该转变使陆生幼虫发育为能够表现出多种复杂行为的成虫^2,3。

已有研究表明，昆虫在早期变态阶段接受极端的寄生性外科手术后仍可存活^4,5。在此类手术中，发育过程中的组织发生使得手术创口能够在较短时间内得到修复。基于这些观察结果，研究人员开发出一种新技术，即在变态生长的早期阶段植入电导性电极（图1）⁶。该方法可实现电极在昆....

方案

注意：本实验方案所需材料与试剂的来源详见下表“试剂”部分。

1. 准备用于记录电极连接的印刷电路板（PCB）

注意：为了提供一种实用的实验操作步骤，需将导线电极焊接到印刷电路板（PCB）上，以便将这些电极插入扁平柔性电缆（FFC）连接器中。

1. 裁剪一块 0.5×5 cm² 的覆铜板。
2. 使用细头记号笔，在板上绘制三个 0.1×5 cm² 的矩形焊盘，作为蚀刻掩模图案。
3. 在通风橱或通风良好的区域中，使用印制电路板（PCB）蚀刻剂蚀刻暴露的覆铜板。用惰性胶带覆盖裁切部分约 1 cm 长度。向量筒烧杯中加入至少 100 ml 的 PCB 蚀刻剂，并用透明胶带将覆铜板固定在烧杯内壁，使覆铜板的一半浸入蚀刻剂中。
4. 将烧杯置于旋转平台上，持续 20 分钟。
5. 将覆铜板从蚀刻剂中取出，放入盛有水的烧杯中浸泡 10 分钟。
6. 用纸巾蘸取异丙醇，擦除标记，暴露出未被蚀刻的铜焊盘。
7. 将印制电路板切割成若干边长约 1 cm 的小方块。
8. 使用锋利刀片将两段带涂层的退火不锈钢丝（涂层直径 0.11 英寸，裸丝直径 0.008 英寸）各切成 3 cm 长。这些不锈钢丝即为将插入昆虫胸腔的活性电极。
9. 使用刀片从每根导线的两端去除 4–....

结果

整体EMIT流程的示意图见图1，展示了天蛾变态周期的主要阶段以及相应的电极植入步骤。电极植入应在羽化前4至7天的晚期蛹阶段进行。这使得肌纤维能够在电极周围发育，从而将植入物牢固地固定在昆虫体内。

完成晚期蛹期阶段插入的典型结果如图2所示，其中两个记录电极和接地电极均已插入。

完成成年阶段插入后的典型结果如图3所示，其中两个有源电极和接地电极均已插入。

用于诱导 Manduca sexta 飞行过程中转向的LED arena如图4所示。通过编程微控制器以控制LED阵列垂直图案的旋转速度，LED图案的角速度设定为7.3度每秒。将磁悬浮平台置于LED arena的中心，使昆虫能够自由地响应LED阵列而转动。

图5显示了在翅膀拍打前后，通过.......

讨论

在手术植入记录电极的过程中，有几个关键步骤会影响后续实验步骤中的数据记录能力。记录电极应在蛹体背部出现翅斑后一天插入。如果插入操作在此时间点之后两天或更久才进行，昆虫的组织将没有足够时间在电极周围发育并使其稳定。这可能导致成虫阶段植入电极发生移动，从而造成记录结果不可靠。

记录电极插入蛹期飞行肌的深度不得超过5 mm，否则血淋巴会从插入点渗出，导致飞行肌发育较弱。如果出现血淋巴渗出，应立即停止操作，让蛹恢复24小时后再尝试插入电极。在将电极插入蛹体前，应彻底清除插入部位的所有翅毛，以防止毛发进入插入孔并干扰电极与组织之间的接触界面。

为了确保成年蛾翅膀的健康，应在羽化前一天使用镊子重新清理插入部位的翅毛。此外，建议使用镊子松动之前用皮下注射针头切开的角质层窗口边缘，以帮助蛾在次日顺利羽化。如果角质层窗口边缘附近有胶水或血淋巴干涸，蛾在羽化后将无法充盈其翅膀，该样本将无法用于实验。

尽管插入时间以天数给出，但由于变温动物的变态发育时间进程取决于饲养温度，这些时间可能会略有差.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
包被不锈钢丝	A-M Systems	791900	0.008’’ 裸线，0.011’’ 包被，经退火处理
柔性电极导线			可使用利兹线（Litz）或电感线。
表面贴装FFC连接器	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
镊子	Grobet USA		使用前需用70%酒精清洁。
Kim-Wipes 擦拭纸	Kimberly-Clark Worldwide	34155	可使用任意尺寸的精细擦拭纸巾。
聚四氟乙烯胶带			5 mm 宽的聚四氟乙烯胶带。
皮下注射针头	Becton Dickinson & Co.	30511	可使用20–30 G的皮下注射针头。视频中展示的是30 G针头。
刚性固定棒			可使用多种材料（例如，咖啡搅拌棒）
昆虫羽化笼			塑料宠物笼，内衬包装纸或类似缓冲材料，需有通风孔。
热灼器	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	可选设备，用于加热牙科蜡。
牙科蜡	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		可选材料，用于稳定昆虫上的电极。
磁悬浮平台			自行设计并利用3D打印技术制作的定制框架。