Optogenetically有针对性的前脑电路的激光扫描光刺激

摘要

我们描述了一种使用光遗传学方法在体外光刺激神经元群来表征前脑回路的功能拓扑和突触特性的方法。

摘要

感觉前脑是由错综复杂的连接类型的细胞，其功能特性尚未完全阐明的。了解这些脑电路的相互作用最近已资助由光遗传学方法对神经元活动的光介导调制的发展。在这里，我们描述了一个协议，用于检查脑电路的体外功能组织使用channelrhodopsin的激光扫描光刺激，通过病毒介导的转染表达optogenetically。这种方法还利用了CRE-LOX重组的转基因小鼠的效用为目标表达的特定的神经元细胞类型。转染后，神经元采用全细胞膜片钳来衡量自己的诱发反应channelrhodopsin表达光纤激光扫描光刺激生理记录片的准备工作。这种方法使功能性地形和synapti的评估C性状。形态特征相关性可以通过使用成像活切片或后固定的组织的共聚焦显微镜channelrhodopsin表达纤维的神经解剖式求出。这些方法使脑电路，扩展后能更传统的方法的功能研究。

引言

哺乳动物前脑的复杂电路对剖析其相互交织的组成部分的功能作用提出了实验挑战。最近，用于专门激发和抑制神经元群及其投射的光遗传学方法的发展有助于解开这些关系^1-3。这些方法利用了对光有反应的膜通道的遗传控制表达^4-6。特别值得注意的是，通道视紫红质是一种光门控离子通道，在光刺激后使神经元膜去极化，导致表达神经元及其投射的兴奋^4,7。相反，halorhodopin 是一种光门控氯离子泵，可超极化膜，从而抑制靶向投射^6,8,9。这些视蛋白的几种变体已被改造，生产了用于在目标神经元群中转染和表达的多种载体，以及经过改造的转基因小鼠品系，这些蛋白组成性表达这些视蛋白或能够通过 cre-lox 介导控制其表达^1,2,10,11。

这些光遗传学方法和材料的实用性彻底改变了现代实验神经科学，使剖析特定神经回路在生物体生理学和行为中的作用^{成为可能 12-15}。特别是，这些方法可以有效地应用于使用体外切片制剂^16-20 的脑回路的功能解剖。在这种情况下，这种方法的主要优点之一是能够表征难以（如果不是不可能的）保存在厚切片中的长距离投射的生理学，例如大脑皮层半球之间的连合连接¹⁶。此外，该技术可实现其他方法无法实现的作，例如使用盐视紫红质^6,8,9 以精细的时间精度选择性抑制投影。此外，这些视蛋白的细胞类型特异性表达允许选择性刺激或抑制神经回路中的分离组分^1,2,11,15,21。因此，这些新颖的光遗传学工具能够对神经元对生理学和行为的贡献进行前所未有的分析。

在这里，我们描述了一种使用腺相关病毒 （AAV） 载体在小鼠大脑中表达通道视紫红质的方案^1,2。可以使用该方案完成目标神经元群的特异性转染，适当选择在目标神经元中表达 Cre 重组酶的启动子构建体或转基因小鼠和"絮凝"病毒构建体^1,11,15,21（图 1）。作为这里的例子，我们研究了初级视觉皮层 （V1） 和次级视觉皮层 （V2） 之间的皮质皮质投射，我们还研究了从初级赫子感觉皮层 （S1） 到腹后内侧核 （VPm） 的第 6 层皮质丘脑投射。我们将这种特异性表达与体外激光扫描光刺激相结合，以评估突触生理学和功能地形。这里介绍的设置可以实现光刺激轨迹的精确空间定位和控制。最后，我们描述了使用共聚焦显微镜对表达模式的可视化。

方案

1. 手术和注射

1. 使用腹膜内注射（推荐 22-25 G 针头）氯胺酮 （100-120 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （7.5-16 mg/kg） 麻醉小鼠。
   1. 使用强力捏住脚趾评估镇静作用，直到没有引起反应。对于描述的所有动物程序，请根据需要进行修改以遵循当地的 IACUC 指南。
2. 通过将头部和耳朵固定在各自的支架中，将镇静小鼠放入立体定位装置中。
   在
   1. 用无菌眼药膏将动物放入立体定位装置中之前，润滑眼睛。
3. 用剃须刀剃掉头皮，并用 Betadine 棉签对该区域进行消毒。
4. 使用手术刀切开中线切口，并将皮肤和下面的肌肉反射到要注射的区域上方。
5. 将手术刀刀片旋转为环钻，在要暴露的区域上方进行开颅手术。或者，使用连接到 Dremel 的小钻头进行开颅手术。
   1. 要进行开颅手术，请将手术刀刀片或钻头放在颅骨表面并缓慢旋转，直到挖出足够的骨头以露出下面的软脑膜。
   2. 进行初步挖掘后，使用细镊子扩大开颅手术，小心地从边缘去除骨头。
6. 用要注射的病毒溶液 （UNC Vector Core） 填充 1 μl 注射器。
   1. 为了提高转染功效，用 4 μg/ml 聚凝胺制备病毒溶液。
7. 将针头放入要注射的区域，并用注射泵压力注入 200 nl 含有病毒的溶液。
   1. 让注射器静置 10 分钟，然后再拔出针头。
8. 用不可吸收的单丝尼龙缝合皮肤，并用抗生素软膏覆盖切口。
   1. 7-10 天后应拆线。
9. 注射丁丙诺啡 （0.05-0.1 mg/kg） 用于术后镇痛。
10. 让动物术后恢复 14-21 天，以允许通道视紫红质的充分表达。

2. 切片准备

1. 恢复期后，用异氟醚麻醉对动物进行深度麻醉，当后脚和/或脚趾被牢牢挤压时没有撤退反射来验证。
2. 通过斩首解剖大脑，然后对颅骨进行中线和额部切割。
3. 从中线剥开颅骨，露出大脑。
4. 使用细勺刮刀小心地取出大脑，将颅神经与大脑底部分开。
5. 将解剖的大脑快速放入装有冷藏、冰冷的人工脑脊液（ACSF;以 mM 为单位：125 NaCl、3 KCl、1.25 NaH₂PO₄、1 MgCl₂、2 CaCl₂、25 NaHCO₃、25 葡萄糖）的 100 ml 小烧杯中。
6. 从 ACSF 中取出大脑，并放在覆盖有预湿 ACSF 的滤纸的显微镜载玻片上。
7. 使用干净的剃须刀片在所需的方向上切开大脑。
8. 使用瞬干胶将大脑的阻塞表面粘贴到切割阶段。
9. 将载物台转移到振动切片机切割室（保存在冰箱中，直到准备好切割）。
10. 将冰冷的 ACSF 倒入切割室中。
11. 使用振动组织切片机以 400-500 μm 的体积切片脑切片。
12. 将脑切片转移到含有含氧 ACSF 的保温室中，并在实验前在 30 °C 下孵育至少 1 小时。

3. 生理记录

1. 孵育期后，将切片转移到改良的显微镜载物台上的记录室中。
2. 在实验过程中，使用连接到铂丝切片架上的几根尼龙丝线将切片固定在浴中。
3. 不断用 ACSF 灌注切片。
4. 当填充含有以下物质（以 mM 为单位）的细胞内溶液时，将记录移液管拉至 3-6 MΩ 的尖端阻力：127 K-葡萄糖酸盐、3 KCl、1 MgCl₂、0.07 CaCl₂、10 HEPES、2 Na_2-ATP、0.3 Na-GTP、0.1 EGTA。细胞内溶液的 pH 值应为 7.3，用 KOH 或葡萄糖酸调节，渗透压为 280-290 mOsm。
5. 使用标准的可视化全细胞记录装置，将记录移液管放在要记录的神经元附近，同时施加正压^22,23。
6. 在施加吸力的同时释放正压以形成千兆级密封。
7. 进行短暂的抽吸以打破膜并形成全细胞构型记录。
8. 记录神经元在电压或电流钳中的响应。

4. 激光扫描光刺激

1. 启动数据采集软件和硬件，如之前的报告^23-29.
   中所述 注意：我们使用了 Tidelwave²⁵ 和最近的 Ephus²⁶ 采集程序，这些程序用 Matlab 编写，由 Janelia Farms³⁰ 的 Karel Svboda 实验室开发。有关 Ephus 中激光扫描光刺激的完整描述，请参阅 Suter 等人。²⁶ 和分步指南³⁰.
   注意：本文中描述的设置源自 Shepherd （2012）²³ 描述的设置。激光束通过镜子的开放光束系统通过物镜引导到显微镜的顶部端口，到达切片上（图 2）。
2. 将一小部分激光转移到光电二极管上，并在激光路径中放置显微镜盖玻片，并使用该光电二极管的电流输出来监测实验期间的激光强度。
   1. 在设备设置²³ 期间，使用功率计将软件中记录的光电二极管电流输出校准为物镜后焦平面处测得的激光功率。
3. 通过旋转可变中性密度轮来控制激光功率。在我们的实验中，使用的激光功率在 25-70 mW（在后焦平面）之间变化。
4. 通过修改激光和快门的脉冲参数来设置激光刺激的长度和时间。激光刺激通常为 2 毫秒长。
5. 使用 'Grab Video' 功能捕获要刺激的区域的图像。
6. 根据所需的尺寸选择刺激网格。我们通常使用 16 x 16 的刺激阵列，相邻行和列之间的间距为 80 μm。
将
7. 映射网格与采集的图像叠加，并将 x、y 和度偏移调整到所需的位置和方向。
8. 激活 'Map' 功能开始刺激和采集数据。
9. 在获取光刺激诱发的反应后，使用 Tidelwave²⁵ 中的离线地图分析程序或 Ephus²⁶ 中的"MapAnalysis"程序对映射数据进行分析。

5. 固定切片成像

1. 记录后，将脑切片转移到 0.01 M PBS （pH7.4） 中的 4% 多聚甲醛 （PFA） 中，在 4 ºC 下过夜。
2. 将切片在 4% PFA/0.01 M PBS 中的 30% 蔗糖中在 4 ºC 下转移过夜。
3. 使用低温恒温器切割 50 μm 切片并收集在 0.01 M PBS 中。
4. 在室温下用 0.01 M PBS 冲洗切片两次。
5. 将切片和盖玻片封固在适当的抗淬灭培养基中。
6. 将切片转移到共聚焦显微镜。
7. 使用白光聚焦 ROI。
8. 选择图像采集的波长、成像大小和重复次数。对于 YFP，我们使用 514 nm （Ex）/527 nm （Em）。

结果

在将 pAAV-CaMKIIa-hChR2 （H134R）-EYFP 注射到 Balb/C 小鼠的 V1 中后，完成了小鼠主要视觉区域 （V1） 和次要视觉区域 （V2） 之间投影的激光扫描光刺激（图 3）。该病毒构建体中的 CaMKIIa 启动子驱动通道视紫红质-EYFP 在兴奋性谷氨酸能神经元中的特异性表达^1,15。在制备用于生理记录的切片后，观察到通道视紫红质-EYFP 纤维的表达，即共轭 EYFP 的落射荧光，从 V1 到 V2（图 3A）。此外，还观察到外侧膝状核 （LGN） 中的皮质丘脑纤维（图 3A）。来自 V2 中神经元的全细胞膜片钳记录显示，在 V2 下层表达通道视紫红质-EYFP 的纤维的激光扫描光刺激后引发 EPSC（图 3B）。

在另一个例子中，使用该协议完成了从初级体感皮层 （S1） 第 6 层到腹后核 （VP） 的皮质丘脑投射的激光扫描光刺激。在这里，我们使用 Cre-Lox 方法特异性靶向感兴趣的第 6 层神经元和皮质丘脑投射中的通道视紫红质表达。明确地，我们将 pAAV-Ef1a-DIO-hChR2（H134R）-EYFP-WPRE-pA 注射到 B6 的 S1 中。Cg-Tg（Ntsr1-cre）GN220Gsat/Mmcd 小鼠 （图 1 和 4）。这种转基因小鼠菌株在第 6 层皮质丘脑神经元²¹ 中特异性表达 Cre 重组酶，因此仅在"絮凝"AAV 构建体转染后的那些神经元中产生 ChR-YFP 表达。制备切片后，在第 6 层神经元和突出到第 4 层和 VP 的纤维中观察到通道视紫红质-EYFP 纤维（图 4A 和 4B）。使用全细胞膜片钳对 VPm 神经元的生理记录显示，在记录的神经元附近进行激光扫描光刺激后，可以引发 EPSC（图 4C 和 4D）。

在生理记录后更容易评估标记纤维的形态。在这里，我们在第 6 层皮质丘脑神经元中切除了通道视紫红质-EYFP 表达的 （50 μm） 切片制剂（图 5）。这揭示了从第 6 层到第 4 层的标记纤维的精细模式，它们在那里端接并广泛地形成树枝（图 5A）。此外，观察到皮质丘脑纤维进入白质，穿过丘脑（图 5A 和 5B）。

图 1.通过 Cre-Lox 方法靶向表达通道视紫红质的示意图。 在感兴趣的神经元群中表达 Cre 重组酶的转基因小鼠注射编码与荧光蛋白（如 YFP）融合的通道视紫红质的"絮凝"病毒。转染后，只有具有 Cre 重组酶的神经元才会表达通道视紫红质-EYFP。点击这里查看大图。

图 2.光刺激设置的示意图。（A） 激光扫描光刺激装置的示意图。激光束依次通过开光束系统引导至快门和中性密度 （N.D.） 滤光片。盖玻片将光束的一部分反射到连接到放大器的光电二极管，用于激光功率测量。镜面振镜用于通过扫描透镜定位激光束，扫描透镜引导光束通过显微镜顶部的侧端口。然后，光束通过物镜向下反射到使用二向色镜制备的切片。有关更多详细信息，请参阅 Lam 和 Sherman²³ 和 Shepherd²⁹。（B） 图 3 所示的代表性实验的光刺激网格模式示例。16 x 16 刺激网格叠加在切片制备的显微照片上。红星表示使用全细胞膜片钳记录的神经元的位置。通过镜面检流计的计算机定位，激光束位置被引导到刺激网格中的 256 个位置中的每一个。图 1 前 5 个刺激部位的激光位置如图所示。图 3 描述了记录的神经元对每个位置的光刺激的响应。点击这里查看大图。

图 3.小鼠皮层从初级视觉皮层 （V1） 到次级视觉皮层 （V2） 的激光扫描光刺激。（A） 切片制备的落射荧光图像显示从 V1 到 V2 和外侧膝状核 （LGN） 中的通道视紫红质-EYFP 纤维。通道视紫红质-EYFP 在兴奋性谷氨酸能神经元中的特异性表达由含有 CaMKIIa 启动子的病毒构建体驱动。（B） 激光扫描光刺激后从 V2 中的神经元引发的兴奋性突触后电流 （EPSC）。红星表示录制地点。比例尺：（A） 500 μm，（B） 200 pA，100 毫秒。单击此处查看大图。

图 4.从初级体感皮层 （S1） 到小鼠腹后核 （VP） 的皮质丘脑投射的激光扫描光刺激。（A） 切片制备的落射荧光图像显示 S1 中的通道视紫红质-EYFP 纤维。（B） VP 中标记纤维的落射荧光图像。（C） 激光扫描光刺激后从 VP 神经元引发的兴奋性突触后电流 （EPSC）。（D） 平均 EPSC 图。红星表示录制地点。（C） 中的方框跟踪与 （D） 中的方框值相对应。比例尺：（A） 250 μm，（B） 250 μm，（C） 100 pA，100 毫秒。单击此处查看大图。

图 5.小鼠初级体感皮层 （S1） 中表达通道视紫红质-EYFP 的第 6 层神经元的成像。（A-B）第 6 层中的标记神经元和投射到第 4 层和白质的纤维。比例尺：（A） 250 μm，（B） 250 μm。单击此处查看大图。

讨论

所描述的协议详细介绍了一种体 外 评估神经元回路功能地形和生理学的方法，该方法不仅限于前脑回路的研究， 即 丘脑和皮层的回路。几种用于光遗传学转染的病毒构建体已提供给科学界，并且可以从北卡罗来纳大学载体核心中轻松获得。有关现成的病毒构建体的描述，请参阅 UNC Vector Core³¹、斯坦福大学 Deisseroth 实验室³² 和麻省理工学院³³ 的 Boyden 合成神经生物学实验室的光遗传学资源页面。这些视蛋白的变体已经由这些实验室开发，并实现了控制神经元兴奋性的广泛模式^1,2。从 UNC Vector Core 获取这些载体需要原始实验室的材料转移协议。在本协议中，我们注意到添加聚苯乙烯可增强转染功效。此外，另一个影响表达的变量是术后恢复期，我们注意到至少14天的时间足以在小鼠的前脑通路中获得稳健的表达。

对于特定神经元群的靶向转染，已经开发了几种Cre-转基因小鼠系，这些系可以与已经开发的“floxed”反向开放阅读框病毒构建体结合使用¹¹。几种与神经科学研究相关的菌株可通过突变小鼠区域资源中心获得³⁴。这些转基因品系中Cre-重组酶表达模式的图谱通过GENSAT数据库³⁵提供。此外，杰克逊实验室还提供几种 Cre 转基因菌株，以及其他在特定神经元群中组成型表达视蛋白的菌株。利用这些小鼠系的关键步骤是考虑获得和建立繁殖群所需的时间，该时间可能会根据感兴趣的特定品系而有所不同。

对于光刺激，我们利用并调整了西北大学 Shepherd 实验室开发的设置，该设置在最近的协议²⁹ 中进行了描述。尽管针对谷氨酸解壳进行了优化，但这种设置也适用于无需修改的通道视紫红质的光刺激。这种设置能够精确地控制和定位光刺激位点，从而能够评估记录神经元的通道视紫红质支配的功能地形图。尽管通过这种光刺激方法增强了空间控制，但它比利用基于LED的场照明的方法成本更高²⁰。此外，脑组织的不均匀性是光遗传学或任何涉及光纵的技术的局限性。但在实践中，它很少是一个因素，因为结果大多以定性的方式解释。如果需要在大脑区域之间进行更定量的比较，人们总是可以使用最大光强度来实现“饱和”反应。

此外，我们还使用了用Matlab编写的Tidelwave和Ephus软件程序来控制激光扫描光刺激和数据采集^25,26。然而，建议那些建立类似系统的人使用较新的Ephus软件²⁶，该软件通过Janelia Farms开发站点³⁰提供支持。一个关键步骤是选择使用这些软件包中的哪一个，因为它们的硬件要求略有不同。此外，地图分析程序是根据各自的数据采集程序量身定制的。

可以修改其中几个步骤以适应从业者的特定设置。除了注射器之外，还可以使用输送机制进行病毒溶液的注射， 例如 ，拉至~40μm尖端直径的毛细管玻璃移液器也可以很好地工作。对于手术，如果引导注射不需要此类坐标，则可以替代非立体定位头架。此外，ACSF和细胞内溶液组成可以根据特定的实验要求而改变， 例如， 用铯或高氯化物细胞内溶液代替以隔离抑制电流。此外，也可以在带有浴灌注系统的合适成像装置上的活切片中进行固定切片中表达模式成像的替代方法。

总之，该协议将使从业者能够表征 体外投射的功能地形图和突触生理学，这使用标准方法可能是不可能的， 例如。表征无法在切片中保留的远程投影。所描述的转染方案可应用于 体内光遗传学实验^1-3,12,14，因为递送机制相同。最后，尽管该协议描述了小鼠的转染，但许多可用的病毒载体理论上可用于在广泛的哺乳动物物种中转染和表达这些视蛋白，从而实现无数的比较和物种特异性研究^1-3。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚凝胺	Santa Cruz Biotech	SC134220
多聚甲醛 32% 溶液	EMS	15714
VECTASHIELD	Vector Labs	H-1400
AAV 病毒构建	UNC Vector Core	NA
小鼠立体定向头架	Stoelting	51730
Nanocool 注射器	Harvard	703040
紫外激光器法：355 nm，Nd：YVO4;1 W;	DPSS Lasers， Inc	3500
振镜	Cambridge Scanning	6210
镜子	Cambridge Scanning	6m2003S-A
安装	Cambridge Scanning	6102103L
电缆	Cambridge Scanning	6010-19-120
驱动程序/控制器	Cambridge Scanning	67121-1
快门 - ZM 涂层（紫外线兼容）	Uniblitz	L23-ZM2
快门控制器	Uniblitz	VMM-D1
电流放大器	斯坦福研究系统	SR570
6713 板	National Instruments	777741-01
2110 分线盒	National Instruments	777643-01
PCI-MIO-16E-4	National Instruments	777383-01
BNC-2090	National Instruments	777270-01
电缆	National Instruments	184749-01
MATLAB	Mathworks
TCS SP2	Leica Microsystems