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光遗传靶向前脑环路的激光扫描光刺激

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DOI：

10.3791/50915

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2013年12月27日

 ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, Louisiana State University, 2Department of Neurobiology, University of Chicago

本文内容

摘要

我们描述了一种利用光遗传学方法在体外光刺激神经元群体，以表征前脑环路功能拓扑结构和突触特性的方法 in vitro。

摘要

感觉前脑由多种复杂连接的细胞类型构成，其功能特性尚未完全阐明。近年来，随着光遗传学技术的发展，可通过光介导调控神经元活动，从而促进了对这些前脑环路相互作用的理解。本文描述了一种在体外利用激光扫描光刺激表达通道视紫红质（channelrhodopsin）的神经纤维，结合全细胞膜片钳记录技术检测神经元反应，以研究前脑环路功能组织的实验方案 in vitro。该方法还利用了转基因小鼠中 cre-lox 重组系统，实现特定神经元细胞类型中的靶向表达。转染后，通过脑片制备并采用全细胞膜片钳技术记录神经元的生理活动，测量其对通道视紫红质表达纤维的激光扫描光刺激所产生的诱发反应。该方法可评估功能拓扑结构及突触特性。通过共聚焦显微镜对活体脑片或固定后组织中表达通道视紫红质的纤维进行成像，可获得相应的形态学信息。这些方法拓展了传统研究手段，为前脑环路的功能研究提供了有力支持。

引言

哺乳动物前脑复杂的神经环路为解析其相互交织的组成部分的功能角色带来了实验上的挑战。近年来，光遗传学方法的发展有助于揭示这些组成部分之间的关系，这些方法能够特异性地激活或抑制神经元群体及其投射通路1-3。这些技术依赖于基因调控的光敏感膜通道的表达4-6。其中尤为突出的是通道视紫红质（channelrhodopsin），这是一种光控离子通道，在光学刺激后可使神经元膜去极化，从而激活表达该通道的神经元及其投射通路4,7。相反，盐视紫红质（halorhodopin）是一种光控氯离子泵，可使细胞膜超极化，从而抑制目标投射通路6,8,9。目前已开发出多种此类视蛋白的变体，构建了多种可用于转染和在特定神经元群体中表达这些视蛋白的载体，并且还研制出可组成性表达这些视蛋白的转基因小鼠品系，或可通过cre-lox系统调控其表达的转基因小鼠模型1,2,10,11。

这些光遗传学方法和材料的应用已彻底改变了现代实验神经科学，使得研究人员能够解析特定神经回路在生物体生理与行为中的作用12-15。尤其在使用离体脑片制备（in vitro slice preparations）对脑回路进行功能解析时，这些方法展现出强大的应用潜力16-20。在此背景下，该方法的主要优势之一在于能够表征长程投射的生理特性，而这些投射在厚脑片中难以甚至无法保存，例如大脑半球之间的连合纤维连接16。此外，该技术实现了其他方法无法实现的操作，例如利用嗜盐菌视紫红质（halorhodopsin）以高时间精度选择性抑制神经投射6,8,9。更重要的是，这些视蛋白的细胞类型特异性表达，使得神经回路中的特定组分能够被选择性地激活或抑制1,2,11,15,21。因此，这些新型光遗传学工具为前所未有地分析神经元在生理与行为中的贡献提供了可能。

本文介绍了一种利用腺相关病毒（AAV）载体在小鼠脑中表达光敏通道蛋白的实验方案1,2。通过选择适当的启动子构建体或使用在特定目标神经元中表达Cre重组酶的转基因小鼠，结合“floxed”病毒构建体，可实现对特定神经元群体的特异性转染1,11,15,21（图 1）。本文以实例展示了初级视觉皮层（V1）与次级视觉皮层（V2）之间的皮层-皮层投射，以及初级躯体感觉皮层（S1）第6层向腹后内侧核（VPm）发出的皮层-丘脑投射。我们将这种特异性表达与体外激光扫描光刺激技术 in vitro 相结合，用于评估突触生理特性及功能拓扑结构。本文所介绍的实验装置可实现光刺激位点的精确定位与空间控制。最后，我们描述了通过共聚焦显微镜对表达模式进行可视化观察的方法。

方案

1. 手术与注射

  1. 使用氯胺酮（100–120 mg/kg）和赛拉嗪（7.5–16 mg/kg）通过腹腔注射（推荐使用22–25 G针头）对小鼠进行麻醉。
    1. 通过强烈夹捏脚趾评估镇静程度，直至无反应为止。对于文中所述所有动物实验操作，应根据需要调整以符合当地IACUC指南。
  2. 将已镇静的小鼠固定于立体定位仪中，使其头部和耳朵分别固定于相应的固定夹中。
    1. 在将动物置于立体定位仪之前，使用无菌眼用软膏润滑其眼睛。
  3. 使用剃刀剃除头皮毛发，并用碘伏棉签消毒手术区域。
  4. 使用手术刀沿中线做切口，分离并翻转注射区域上方的皮肤及皮下肌肉组织。
  5. 将手术刀片作为环钻使用，在目标区域上方实施开颅手术；或者，也可使用连接至Dremel工具的小型钻头完成开颅。
    1. 进行开颅时，将手术刀片或钻头置于颅骨表面，缓慢旋转，直至去除足够骨质以暴露下方的软脑膜。
    2. 完成初步骨质去除后，使用精细镊子小心地从边缘进一步扩大开颅孔径。
  6. 用待注射的病毒溶液（UNC Vector Core）填充1 μl注射器。
    1. 为提高转染效率，可在病毒溶液中加入4 μg/ml的聚凝胺（polybrene）。
  7. 将注射针缓慢插入目标注射区域，并通过微量注射泵以压力方式注入200 nl含病毒的溶液。
    1. 注射完成后，留针10分钟后再缓慢撤出针头。
  8. 使用不可吸收的单丝尼龙线缝合皮肤，并在切口处涂抹抗生素软膏。
    1. 缝线应在术后7–10天拆除。
  9. 术后给予布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg）以提供镇痛。
  10. 术后让动物恢复14–21天，以确保视蛋白通道（channel rhodopsin）得到充分表达。

2. 切片制备

  1. 恢复期结束后，用异氟烷麻醉剂对动物进行深度麻醉，通过牢固捏压后肢脚部和/或脚趾时无回缩反射来确认麻醉效果。
  2. 通过断头法处死动物，随后在颅骨正中线及额部进行切口，以暴露脑组织。
  3. 从正中线将颅骨剥离，以暴露脑组织。
  4. 使用精细的刮勺小心取出脑组织，同时分离颅神经与脑基底部的连接。
  5. 迅速将取出的脑组织放入盛有冰浴、冰冷人工脑脊液（ACSF；单位：mM：125 NaCl，3 KCl，1.25 NaH2PO4，1 MgCl2，2 CaCl2，25 NaHCO3，25 葡萄糖）的小烧杯（100 ml）中。
  6. 将脑组织从 ACSF 中取出，置于预先用 ACSF 润湿的滤纸覆盖的载玻片上。
  7. 使用洁净的剃刀片按所需方向对脑组织进行修块切割。
  8. 使用速干胶将脑组织的修块面固定在切片台上。
  9. 将切片台转移至振动切片机的切片室（切片前应保存在冷冻环境中）。
  10. 向切片室中倒入冰冻的 ACSF。
  11. 使用振动组织切片机将脑组织切成 400–500 µm 厚的切片。
  12. 将脑切片转移至盛有氧合 ACSF 的储存室中，并在 30 °C 下孵育至少 1 小时，然后进行实验。

3. 生理记录

  1. 孵育结束后，将脑片转移至改装显微镜载物台上的记录浴槽中。
  2. 实验过程中使用固定在铂丝支架上的尼龙细丝将脑片固定在灌流槽内。
  3. 持续用人工脑脊液（ACSF）灌流脑片。
  4. 使用以下成分的细胞内液（单位：mM）填充记录电极，拉制电极使其尖端电阻为 3–6 MΩ：127 K-葡萄糖酸盐、3 KCl、1 MgCl2、0.07 CaCl2、10 HEPES、2 Na2-ATP、0.3 Na-GTP、0.1 EGTA。细胞内液的pH值应调至7.3（用KOH或葡萄糖酸调节），渗透压为280–290 mOsm。
  5. 利用标准的可视化全细胞记录装置，在施加正压的同时将记录电极移至待记录神经元附近22,23。
  6. 撤去正压并施加负压，以形成吉欧姆（Gigaohm）封接。
  7. 短暂施加负压以破裂膜片，建立全细胞记录构型。
  8. 在电压钳或电流钳模式下记录神经元的反应。

4. 激光扫描光刺激

  1. 启动数据采集软件和硬件，具体方法见先前报道23-29.
    注意：我们已同时使用了 Tidelwave25 以及最近的 Ephus26 使用Matlab编写的采集程序，由珍妮娅农场Karel Svoboda实验室开发30. 有关 Ephus 中激光扫描光刺激的完整描述，请参见 Suter 等26 以及逐步指南30.
    注：本文所述装置基于Shepherd（2012）所描述的装置改进而来23激光束通过开放式光路进行引导 通过物镜将镜面系统反射的光线导入显微镜顶部接口，照射至切片上（图 2).
  2. 将一小部分激光引导至光电二极管，激光光路中放置显微镜盖玻片，利用该光电二极管的电流输出在实验过程中监测激光强度。
    1. 在设备组装期间，使用功率计测量物镜后焦平面处的激光功率，将软件中记录的光电二极管电流输出进行校准23.
  3. 通过旋转可变中性密度滤光轮来控制激光功率。在本实验中，所用激光功率在25-70 mW（后焦平面处）之间变化。
  4. 通过调整激光脉冲参数和快门参数来设定激光刺激的持续时间和时序。激光刺激通常持续2毫秒。
  5. 使用“抓取视频”功能拍摄待刺激区域的图像。
  6. 根据所需尺寸选择刺激网格。我们通常使用一个 16 × 16 的刺激阵列，相邻行和列之间的间距为 80 μm。
  7. 将采集的图像与定位网格叠加，并调整x、y方向及角度偏移，以达到所需的位置和方向。
  8. 启动“Map”功能以开始刺激并采集数据。
  9. 在获取光刺激诱发的反应后，使用 Tidelwave 中的离线地图分析程序对映射数据进行分析25 或 Ephus 中的“MapAnalysis”程序26.

5. 固定切片成像

  1. 记录完成后，将脑片转移至含4%多聚甲醛（PFA）的0.01 M PBS（pH 7.4）中，4 ºC下固定过夜。
  2. 将脑片转移至含4% PFA的30%蔗糖溶液中，4 ºC下浸泡过夜。
  3. 使用冷冻切片机切出50 µm厚的切片，并收集于0.01 M PBS中。
  4. 在室温下用0.01 M PBS漂洗切片两次。
  5. 将切片用适当的抗荧光淬灭封片剂封片。
  6. 将切片转移至共聚焦显微镜进行观察。
  7. 使用白光对感兴趣区域（ROI）进行调焦。
  8. 选择成像波长、成像尺寸和扫描重复次数。对于YFP，我们采用514 nm（激发）/527 nm（发射）。

结果

小鼠初级视觉区（V1）与次级视觉区（V2）之间投射的激光扫描光刺激，是在将pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP注入Balb/C小鼠V1区后实现的（图3CaMKIIa 启动子在此病毒载体中驱动通道视紫红质-EYFP 在兴奋性谷氨酸能神经元中的特异性表达1,15生理记录用脑片制备完成后，通道视紫红质-EYFP纤维的表达， 即 观察到共轭EYFP的落射荧光从V1区穿越至V2区（图3A）。此外，还观察到了外侧膝状体核（LGN）中的皮质丘脑纤维（图3A). 对V2区神经元进行全细胞膜片钳记录，结果显示在激光扫描光刺激表达channelrhodopsin-EYFP的纤维后，可诱发来自V2下层的兴奋性突触后电流（EPSCs）图3B).

在另一个示例中，采用本方案实现了对初级躯体感觉皮层（S1）第6层至腹后核（VP）的皮层丘脑投射进行激光扫描光刺激。在此，我们使用Cre-Lox方法特异性靶向在目标的第6层神经元及其皮层丘脑投射中表达光敏通道蛋白。具体而言，我们将pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA注射到B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd小鼠的S1区（图1和4）。该转基因小鼠品系特异性地在第6层皮层丘脑神经元中表达Cre重组酶21，因此在“loxP”修饰的AAV载体转染后，仅在这些神经元中表达ChR-YFP。切片制备后，可在第6层神经元以及投射至第4层和VP的纤维中观察到光敏通道蛋白-EYFP标记的纤维（图4A和4B）。通过全细胞膜片钳技术对VPm神经元进行生理记录，结果显示，在记录神经元附近进行激光扫描光刺激可诱发兴奋性突触后电流（EPSCs）（图4C和4D）。

在完成生理记录后，可更方便地评估标记纤维的形态。此处，我们对表达通道视紫红质-EYFP的第6层皮层丘脑神经元的脑片标本重新切片（50 μm）（图5）。结果显示，标记纤维从第6层延伸至第4层，呈现出精细的走行路径，并在第4层终止且广泛分支（图5A）。此外，还可观察到皮层丘脑纤维进入白质，并向丘脑方向延伸（图5A和5B）。

利用Cre-loxP进行小鼠模型中ChR-YFP靶向表达的基因编辑示意图。
图1. 通过Cre-Lox方法实现通道视紫红质靶向表达的示意图。 在特定神经元群体中表达Cre重组酶的转基因小鼠，被注射一种编码通道视紫红质与荧光蛋白（如YFP）融合蛋白的“floxed”病毒。转染后，仅表达Cre重组酶的神经元才会表达通道视紫红质-EYFP。点击此处查看高清图像。

激光显微镜示意图，包含激光光学元件、二向色镜、CCD相机和扫描装置。
图 2. 光刺激装置的示意图。 (A) 激光扫描光刺激装置的示意图。激光束依次通过开放式光路系统，进入快门和中性密度（N.D.）滤光片。盖玻片将部分光束反射至与放大器相连的光电二极管，用于测量激光功率。使用镜面检流计通过扫描透镜定位激光束，该光束经显微镜顶部的侧端口进入显微镜。随后，光束经二向色镜反射，通过物镜向下照射至脑片标本。更多细节参见 Lam 和 Sherman23 以及 Shepherd29。(B) 代表性实验中所用光刺激网格模式的示例，如 图 3 所示。16 × 16 的刺激网格叠加在脑片标本的显微照片上。红色星号表示通过全细胞膜片钳记录的神经元位置。通过计算机控制镜面检流计，将激光束依次引导至刺激网格中的 256 个位置。图中显示了前 5 个刺激位点的激光位置。记录神经元对每个刺激位点的光刺激反应见 图 3。点击此处查看高分辨率图像。

神经影像图解；外侧膝状体、V1、V2视皮层分析；神经连接研究
图3. 小鼠初级视皮层（V1）至次级视皮层（V2）皮层-皮层投射的激光扫描光刺激研究。 （A）脑片制备的落射荧光图像，显示从V1到V2以及外侧膝状体（LGN）的通道视紫红质-EYFP纤维。通道视紫红质-EYFP在兴奋性谷氨酸能神经元中的特异性表达由含有CaMKIIa启动子的病毒载体驱动。（B）在V2中某一神经元上，通过激光扫描光刺激诱发的兴奋性突触后电流（EPSCs）。红色星号表示记录位点。标尺：（A）500 µm，（B）200 pA，100 msec。点击此处查看高分辨率图像。

皮层分层示意图显示VP区域分析；映射微电活动；电生理数据。
图4. 小鼠初级躯体感觉皮层（S1）至丘脑腹后核（VP）的皮层-丘脑投射的激光扫描光刺激。（A）脑片制备的落射荧光图像，显示S1区表达通道视紫红质-EYFP的纤维。（B）VP区标记纤维的落射荧光图像。（C）激光扫描光刺激后，VP神经元诱发的兴奋性突触后电流（EPSCs）。（D）平均EPSCs的统计图。红色星号表示记录位点。（C）中加框的迹线对应于（D）中加框的数值。标尺：（A）250 µm，（B）250 µm，（C）100 pA，100 msec。点击此处查看高分辨率图像。

显示神经元结构的荧光显微图像，绿色标记；比较示意图。
图5. 小鼠初级躯体感觉皮层（S1）中表达通道视紫红质-EYFP的第6层神经元的成像。 （A-B）第6层中标记的神经元及其向第4层和白质投射的纤维。比例尺：（A）250 µm，（B）250 µm。 点击此处查看高分辨率图像。

讨论

所描述的方案详细说明了一种方法 体外 神经环路功能拓扑与生理学特性的评估，不仅限于前脑环路的研究 即 丘脑和皮层。目前已有多种用于光遗传转染的病毒载体构建体向科学界提供，并可直接从北卡罗来纳大学病毒载体中心（UNC Vector Core）获取。有关 readily available 病毒载体构建体的详细描述，请参见 UNC Vector Core31斯坦福大学戴瑟罗斯实验室的光遗传学资源页面32 麻省理工学院博伊登合成神经生物学实验室33这些实验室已开发出这些视蛋白的多种变体，可实现对神经元兴奋性的广泛调控模式1,2从北卡罗来纳大学病毒载体核心（UNC Vector Core）获取这些载体需要来自原始实验室的材料转移协议。在本方案中，我们指出添加polybrene可增强转染效率。此外，另一个影响表达的因素是术后恢复时间，我们注意到至少14天的恢复期足以在小鼠前脑通路中获得稳定的表达。

为了实现对特定神经元群体的靶向转染，已开发出多种Cre转基因小鼠品系，这些品系可与“floxed”反向开放阅读框病毒载体联合使用11。目前可通过突变小鼠区域资源中心获取多种与神经科学研究相关的品系34。这些转基因品系中Cre重组酶表达模式的图谱可通过GENSAT数据库获得35。此外，杰克逊实验室（Jackson Labs）也提供多种Cre转基因品系，以及其他可在特定神经元群体中组成型表达视蛋白的品系。使用这些小鼠品系的关键步骤之一是需考虑获取并建立繁殖群体所需的时间，该时间可能因具体品系的不同而有所差异。

对于光刺激，我们采用并改进了西北大学Shepherd实验室开发的实验装置，该装置在近期的一份实验方案中有详细描述29。尽管该装置最初是为谷氨酸解笼反应优化设计的，但无需任何修改即可用于通道视紫红质的光刺激。该装置能够对光刺激位点实现精确的空间控制与定位，从而可评估记录神经元中通道视紫红质支配的功能性拓扑结构。虽然该光刺激方法提高了空间控制精度，但其成本高于使用基于LED全场照明的方法20。此外，脑组织的非均一性是光遗传学或任何涉及光操控技术的固有限制。然而在实际应用中，由于结果通常以定性方式解读，这一因素很少构成影响。若需在不同脑区之间进行更定量的比较，始终可采用最大光强以获得"饱和"反应。

此外，我们使用了基于 Matlab 编写的 Tidelwave 和 Ephus 软件程序，用于控制激光扫描光刺激和数据采集25,26。然而，建议搭建类似系统的用户采用较新的 Ephus 软件26，该软件可通过 Janelia Farms 开发网站获得支持30。选择使用哪个软件包是一个关键步骤，因为它们的硬件需求略有不同。此外，地图分析程序是针对各自对应的数据采集程序专门设计的。

这些步骤中的若干步骤可根据操作者的具体实验条件进行调整。病毒溶液的注射可使用除注射器以外的递送装置来完成， 例如 尖端直径约为40 μm的玻璃毛细移液管同样适用。对于手术操作，若无需精确定位坐标引导注射，则可使用非立体定位头固定装置替代。此外，人工脑脊液（ACSF）和细胞内液的成分可根据特定实验需求进行调整。 例如 用铯基或高氯化物细胞内液替代，以分离抑制性电流。此外，也可在配备灌流系统的活体脑片上，使用合适的成像装置替代对固定脑片进行表达模式的成像观察。

总之，本方案将使研究人员能够表征投射的功能拓扑结构及突触生理特性 体外，这可能无法通过标准方法实现 例如表征在脑片中无法保存的长程投射。所述转染方案可应用于 体内 光遗传学实验1-3,12,14，因为递送机制相同。最后，尽管本方案描述的是小鼠的转染，但理论上可利用现有的多种病毒载体将这些视蛋白转染并表达于多种哺乳动物物种中，从而实现大量比较性及物种特异性研究1-3.

披露

作者声明不存在利益冲突。 作者（CCL）收到了徕卡显微系统公司（Leica Microsystems）提供的出版资助，该公司生产了本实验方案拍摄中所使用的一种仪器。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院/国家耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH/NIDCD）资助项目R03 DC 011361、SVM公司资助项目LAV3202、美国国家科学基金会-路易斯安那州实验伙伴计划（NSF-LA EPSCoR）资助项目PFUND86、徕卡显微系统公司（Leica Microsystems）出版资助项目（CCL）以及NIH/NIDCD资助项目R01 DC 008794（SMS）支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚凝胺Santa Cruz BiotechSC134220
32% 甲醛溶液EMS15714
VECTASHIELDVector LabsH-1400
AAV 病毒载体UNC Vector CoreNA
小鼠立体定位头架Stoelting51730
纳升注射器Harvard Apparatus703040
紫外激光器：355 nm，Nd:YVO4；1 WDPSS Lasers, Inc3500
检流计Cambridge Scanning6210
反射镜Cambridge Scanning6m2003S-A
镜座Cambridge Scanning6102103L
电缆Cambridge Scanning6010-19-120
驱动器/控制器Cambridge Scanning67121-1
快门 - ZM 涂层（紫外兼容）UniblitzL23-ZM2
快门控制器UniblitzVMM-D1
电流放大器Stanford Research SystemsSR570
6713 板卡National Instruments777741-01
2110 接线盒National Instruments777643-01
PCI-MIO-16E-4National Instruments777383-01
BNC-2090National Instruments777270-01
电缆National Instruments184749-01
MATLABMathworks
TCS SP2Leica Microsystems

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