单株无菌微环境系统用于豆科植物Medicago truncatula与根瘤菌共生体Sinorhizobium meliloti的结瘤及生长研究

摘要

利用标准培养皿制成的单个无菌微环境培养Medicago truncatula植物，使其与固氮细菌Sinorhizobium meliloti建立共生关系，可在不破坏无菌条件的情况下频繁观察根系和根瘤。这些生长装置中的植物可维持长达9周。

摘要

根瘤菌可在相容的宿主豆科植物根部形成共生固氮根瘤。研究这类互作关系最成熟的模式系统之一是植物Medicago truncatula cv. Jemalong A17与根瘤菌Sinorhizobium meliloti 1021。对植物根部进行重复成像并评估共生表型，需要采用对植物或细菌均无损伤的方法。某些植物和细菌突变体的共生表型在相对较短的生长期后即可显现，无需对宿主/共生体互作进行长期观察。然而，根瘤发育早期阶段不明显的共生效率差异和根瘤衰老表型，则需要相对较长的生长时间后才能进行评估。目前已建立多种用于该宿主/共生体长期生长与观察的方法。但许多方法需要反复浇水，从而增加了其他微生物污染的可能性；另一些方法则需要较大的空间以培养大量植物。本文所述方法——在无菌、单株微环境系统中进行M. truncatula/S. meliloti共生培养——具有多项优势。该微环境系统中的植物可获得充足的水分和养分，最多9周内无需浇水，从而避免了浇水过程中可能发生的交叉污染。该方法使得在短期生长系统中可能被忽略的表型（如根瘤发育的细微延迟和早期根瘤衰老）得以被定量分析。此外，通过培养皿盖即可方便地观察微环境中的根系和根瘤，无需将植物挖出进行观察。

引言

豆科植物宿主与 Medicago truncatula A17 与根瘤菌 Sinorhizobium meliloti 1021 是研究根瘤发育和固氮共生最易操作的模式系统之一。两种共生伙伴的基因组均已测序。^1,2 且植物和细菌均易于进行遗传操作^3,4 对植物和细菌突变体表型的分析需要能够观察根瘤发育的各个阶段，并随时间量化共生效率。本文描述了一种观察根瘤发育的方法 M. truncatula cv. Jemalong A17 接种 S. meliloti 1021 个独立的微宇宙系统，由标准的圆形实验室培养皿制成，直径 100 mm，深度 15 mm（图1A）。芽体暴露后从培养板侧面的缺口孔中生长出来（图1B、1C和1E）。根系被限制在微宇宙系统内并保持无菌状态，同时可通过培养皿盖进行观察（图1D）。由于茎部易于接触，其生长不受限制，且可在不破坏根部无菌状态的情况下定期测量。带凹槽培养板微环境的构建方法最初由Leigh开发， 等⁵ 用于紫花苜蓿植株的培养，尽管该方法相较于其他方法具有诸多优势，但并未得到广泛应用。此外，还发展出该方法的一种变体，用于分析植物根系与菌根真菌之间的相互作用⁶我们现已对该方法进行了改进和优化，以适用于生长 M. truncatula 植物。本方案相较于更常用方法的优势如下所述。

目前有多种方法广泛用于研究接种S. meliloti的M. truncatula结瘤情况⁷。用于大量制备结瘤根系最常用的方法是在气雾式箱体中进行培养⁷。在此方法中，植物被悬置于大型容器上方，根系通过喷雾装置接受含有S. meliloti的营养液混合物进行供气培养⁷。该方法仅在测试单一S. meliloti基因型时较为实用。由于需要将高浓度细菌雾化，因此在接种不同菌株的箱体之间极易发生交叉污染。另一种常用于制备大量接种植物的方法是在珍珠岩、蛭石、沙子或煅烧黏土的桶或盆中进行培养，这些基质需浸润营养液并接种S. meliloti⁷。该方法需使用敞口桶或盆，并需定期浇水和补充营养液。盆栽法的另一个缺点是，在检查根系和根瘤时必须将植株从颗粒基质中取出。此外，当需要比较多种不同的S. meliloti基因型时，该方法还需占用大量培养箱空间，因为每种细菌基因型都必须使用独立的盆器。""伦纳德瓶""是该方法的一种改良形式^8,9。伦纳德瓶由两个灭菌容器上下堆叠组成，通过灯芯相连。培养基置于下部容器中，通过毛细作用经灯芯被输送到上部容器中的生长基质（如珍珠岩、蛭石、沙子或煅烧黏土）中。将幼苗置于上部基质中，并接种S. meliloti。该方法无需频繁浇水，但在观察根系和根瘤时仍需将幼苗从颗粒状生长基质中取出。

有几种方法确实允许对根系进行方便的观察。其中一种是使用透明塑料"生长袋"⁷。该方法的一个缺点是需要频繁浇水，因为在生长袋中培养M. truncatula时，仅需≤10 ml液体培养基即为最佳条件⁷。此外，由于袋内滤纸芯会降解，生长袋实验通常也只能维持约2周时间⁷。另外两种常用的方法与我们的方法类似，即植物在琼脂上生长且根系可见，但这些方法存在一些我们的实验方案可以避免的缺点。在这两种方法中，植物完全封闭在24.5 cm × 24.5 cm的琼脂平板内，平板顶部用多孔外科胶带密封，或生长于斜置的琼脂试管中，试管口用棉塞或塑料盖封住⁷。这两种方法均便于根系观察，并可保持无菌状态。然而，琼脂斜面试管通常仅含约20 ml琼脂培养基⁷，需定期补充水分和营养，以支持植物长期生长。在24.5 cm × 24.5 cm琼脂平板微生态系统中生长的植物虽具有足够的水分和养分以支持长期生长，但地上部分在封闭的微生态系统内迅速生长受限，且乙烯气体会积聚，抑制根瘤形成⁷。而在本文所述的实验方案中，植株的地上部分暴露在外，可自由生长，而微生态系统内含有约70 ml培养基，从而支持植物的长期生长。

此处描述的方法不仅可能对豆科植物结瘤的研究有用，也可能适用于其他中等大小植物根系表型的研究。与传统的聚碳酸酯植物组织培养瓶不同，此处所述的平板微环境系统中，根系在琼脂的垂直表面生长，而不是向下生长至培养瓶底部的水平琼脂层中。这种方法使得根系能够被轻柔地从琼脂表面抬起，最大程度减少对根毛的损伤，并避免琼脂黏附在根系表面，从而便于通过显微镜观察根毛结构。

方案

建议在无菌超净工作台中进行步骤 1、2、4 和 6。

1. 准备 M. truncatula A17 幼苗

注意：本研究中使用的蒺藜苜蓿（M. truncatula）A17种子是在约22 °C的低温温室条件下，或在22–26 °C、光照强度为约150–400 mmol/m^-2 s^-1的植物生长室中培育获得的。

1. 倒入种子萌发平板：使用100 mm的方形培养皿（15 mm深），倒入高压灭菌的1.1-1.2% w/v纯化琼脂¹⁰，深度为3-5 mm。每个培养皿用于萌发约0.25-0.5 g种子（相当于每皿63-125粒种子）。
   注意：本实验方案中所述的所有培养皿均必须使用经过植物细胞培养测试的纯化琼脂。琼脂的供应商及货号信息见“特定试剂与设备表”。
2. 对M. truncatula A17种子进行划伤/灭菌处理：称取所需数量幼苗对应的种子量。（M. truncatula A17种子每粒约4 mg）将种子放入带有无菌铝箔封口的无菌125 ml三角瓶中（每瓶0.25-0.5 g种子；即约63-125粒种子），沿瓶壁加入20 ml浓硫酸（96% H₂SO₄）。
   注意：酸处理可实现种子灭菌。此外，将酸沿瓶壁加入可重新灭菌瓶内壁与未灭菌种子接触过的区域。
3. 用无菌玻璃移液管打散种子团块。每瓶频繁轻轻摇动10-12分钟。种子表面将出现微小的棕色凹坑，这些是种皮上的微小穿孔¹¹。
   注意：操作浓H₂SO₄时需佩戴护目镜和手套。
4. 去除H₂SO₄并冲洗种子：当至少10%的种子出现棕色小凹坑，或处理时间已达12分钟（以先到者为准），用无菌玻璃移液管将所有酸液从三角瓶中移除。（将废酸倒入盛有至少300 ml自来水的1-2 L烧杯中，以稀释酸液并防止过热。）倾斜三角瓶，使残留酸液汇集于瓶壁弯曲处，用小玻璃移液管彻底吸除所有残余酸液。若残留酸液未清除，其将与冲洗水反应，导致种子受热而死亡。
   1. 通过快速向每个三角瓶中倒入100 ml无菌超纯水来冲洗种子。大量水可稀释残余酸液，防止酸与水反应时产生高温而损伤种子。倒去水后，用火焰灼烧三角瓶口进行灭菌。
   2. 用50 ml无菌超纯水冲洗种子8-10次。每次冲洗时轻轻摇动三角瓶。此时三角瓶应视为无菌环境，每次冲洗前均需灼烧瓶口灭菌。
5. 让种子在4 °C黑暗条件下过夜吸胀：最后一次冲洗后，向每个三角瓶中加入50 ml无菌超纯水，盖上无菌铝箔，置于4 °C黑暗环境中过夜。
6. 将种子转移至萌发平板：过夜吸胀后，倒去水，用约25 ml超纯水冲洗两次，然后加入20 ml无菌超纯水，轻轻摇动使种子重悬，将悬液倒入第1.1步制备的1.1-1.2%琼脂萌发平板中。若三角瓶中仍有残留种子，可加入更多水再次倾倒。将每个三角瓶中的种子分配至一个平板（每板63-125粒种子）。
   1. 轻轻摇动平板使种子分布均匀。种子应集中分布在平板一端4-5 cm宽的区域，此端定义为平板的"顶部"。平板另一端5-6 cm区域"底部"应保持无种子（图2A）。
   2. 用无菌移液管吸除多余水分。将平板倾斜45°角，使残余水分流向底部。在倾斜状态下盖上皿盖，并避光保存。让平板自然沥干10-20分钟（图2B）。
7. 设置萌发条件：用无菌移液管吸除倾斜平板底部积聚的所有水分。
   1. 盖上皿盖，并用封口膜密封平板。操作时佩戴手套并保持无菌（图2C）。
   2. 将萌发平板叠放后整体竖立成90°角。种子将贴附在琼脂的垂直表面。充分吸胀的种子应能牢固粘附于琼脂表面。根将向下生长（图2D）。
   3. 用铝箔包裹整叠萌发平板以避光，并在25 °C条件下培养3天。

注意：如果萌发时间少于3天，根系可能过短，无法在微生态系统中接触到琼脂。如果在转移到微生态系统培养板之前萌发时间超过4天，幼苗的存活率将显著降低。如果需要比较萌发速度较慢的M. truncatula生态型或突变体，应允许萌发较慢的生态型萌发时间超过3天。

2. 单个平板微宇宙的制备

1. 制备 Jensen 培养基¹²（培养基成分见表 1），每个微宇宙系统准备约 70 ml 培养基。使用便于快速倾倒的烧杯或烧瓶进行制备（每个烧杯不超过 1–2 L），并在高压灭菌过程中将磁力搅拌子留在烧杯内。
   1. 待培养基冷却至约 55–65 °C，加入补充成分并检测 pH 值后（见表 1），倒入直径 100 mm、深度 15 mm 的圆形培养皿中。每皿倾倒深度约为 0.9–1 cm（约 70 ml/皿）。
   2. Jensen 培养基中的某些成分可能形成浑浊沉淀，因此在倾倒过程中需定期将烧杯放回磁力搅拌器上搅拌，以防止成分沉降。培养基凝固后培养皿中可能出现可见沉淀，只要沉淀在各培养皿之间分布均匀，便不会影响实验效果。
   3. 倾倒时应将培养皿叠放，以防止皿盖上形成冷凝水。
2. Jensen 培养基凝固后，使用已弯成 U 形的称量铲在培养皿及皿盖上切出缺口⁵（图 3A）。用火焰加热称量铲的弯曲部分至发红，切出 5–6 个缺口后再次加热。当带缺口的皿盖盖在带缺口的培养皿上时，将形成一个椭圆形开口，供幼苗的茎从中生长（图 3B）。若需储存已切缺口的培养皿，应使用石蜡膜单独包裹。

3. 根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）培养物的制备

在植物接种前两天，开始培养所有将用于幼苗接种的S. meliloti菌株。菌株应在添加了2.5 mM MgSO₄、2.5 mM CaCl₂以及适当抗生素的LBMC（Luria-Bertani [Miller]）培养基中培养¹³（TY培养基同样适用）。每种菌液培养2–3 ml即足够使用。

1. 在30 °C下振荡培养2天，直至菌体生长至浓密。
2. 对于大多数植物接种实验，S. meliloti 的生长阶段并非关键因素。通常使用对数生长后期或稳定期初期的菌体。

4. 在单个微宇宙中放置M. truncatula 幼苗

1. 3天后，打开一个发芽培养皿（按步骤1制备），立即用无菌超纯水浸没。将镊子浸入乙醇中并短暂灼烧以灭菌。用无菌镊子轻轻将所有幼苗的根尖推入水中，防止干燥。根的长度范围为2-6 cm，多数为3-4 cm。选择根部笔直且无明显缺陷的幼苗。
2. 检查詹森培养基微环境容器盖上是否积聚冷凝水。轻弹盖子以去除冷凝水，或更换为新的带缺口盖子。若盖子上有过多冷凝水，幼苗根部可能粘附于盖子上，待水分蒸发后导致幼苗死亡。
3. 用镊子轻轻夹住发芽培养皿中的子叶部位取出一株幼苗，并将其根部放置于詹森培养基微环境中。确保根尖与琼脂接触。
4. 若种皮仍存在，应轻轻去除。种皮在水中浸泡5-10分钟后应已松动。用镊子轻轻拨动种皮直至其脱落，并丢弃。子叶及约0.5 cm的茎部应从培养皿的U形缺口处伸出（图4A）。小心盖上盖子，使盖子的U形缺口对准幼苗，形成幼苗的通道（图4B）。将培养皿水平叠放，静置一旁，直至所有幼苗均被转移至微环境中。
5. 使用每个发芽培养皿中所有外观健康且根部笔直的幼苗。（如有可能，保留一盘未打开的幼苗，用于在接种前替换萎蔫的幼苗。）
6. 在放置完所有幼苗后，让其静置于水平的詹森微环境中，同时准备S. meliloti菌液接种悬液。

5. 根癌农杆菌（S. meliloti）接种液的制备

1. 接种后定期检查 S. meliloti 培养物，确保其正常生长。培养 2 天后，OD₆₀₀ 应在 2 至 4 之间。
2. 用移液器将每种培养物各 0.5 ml 转移至无菌 1.5 ml 离心管中，离心收集菌体，弃去上清液。
3. 用 0.85% 无菌 NaCl 溶液或无菌超纯水洗涤菌体两次，然后将菌体重悬于 0.5 ml 0.85% 无菌 NaCl 溶液或超纯水中。
4. 测定第 5.3 步重悬的 S. meliloti 培养物经 1/10 稀释后的 OD₆₀₀。根据该测定值，将每种培养物用无菌超纯水配制成 OD₆₀₀ = 0.05 的菌悬液。若细胞密度过高，可能抑制结瘤。需配制足够量的稀释菌悬液，以保证每株幼苗接种 100 μl。OD₆₀₀ = 0.05 的菌悬液浑浊度应仅能通过肉眼勉强观察到。

6. 微型生态系统的接种与密封

1. 在开始接种前，立即检查是否有在转移至 Jensen 培养基微生态系统后未能存活而出现萎蔫的幼苗。将这些幼苗替换为萌发平板中新鲜的幼苗。
2. 打开每个微生态系统，将 100 μl 相应的 S. meliloti 菌悬液接种到幼苗根部。盖上盖子，并将微生态系统以每堆 6–10 个水平堆叠的方式放置。对于每个待比较的 S. meliloti 菌株，至少接种 15 株植物。对于共生生产力差异较细微的菌株，接种 30–35 株植物。至少保留 10 株植物不接种，作为阴性对照。使用 S. meliloti 1021 或其他合适的野生型菌株接种 30–35 株植物，作为阳性对照。
3. 待 S. meliloti 菌悬液有足够时间吸附至根表且液体渗入琼脂后（至少 20 分钟），用石蜡膜单独包裹每个平板。包裹时应紧贴缺口边缘，但石蜡膜不得阻碍幼苗生长（图 4C）。
4. 在包裹的同时，最后检查一次是否有根黏附在平板盖内侧。若根黏附在盖上，将平板平放在实验台上，轻敲或轻弹盖子，使根重新落回琼脂表面。
5. 将每堆 6–10 个平板的幼苗通孔对齐，使整堆平板呈 90° 垂直放置，幼苗朝上（图 4D）。石蜡膜的黏性足以使平板在包裹铝箔期间保持稳定，包裹时在幼苗伸出的位置留出 1–2 cm 未包裹的区域（图 4E）。铝箔可保护根部免受光照。
6. 将包裹好铝箔的堆叠平板置于光照培养箱或培养室中，培养条件为 21–25 °C、相对湿度 60–70%、光照强度 100–175 μmol/m^-2 s^-1，光照周期为 16 小时光照/8 小时黑暗（图 1A）。在此培养条件下，长时间暴露于高于 200 μmol/m^-2 s^-1 的光照强度会对植物生长产生不利影响。

7. 根系结构的观察与共生表型的定量分析

植物可在微型生态系统中维持长达9周。

1. 可通过打开每个培养皿的锡箔纸，在一系列时间点观察并计数根瘤数量。接种了S. meliloti 1021野生型菌株的植物，通常在接种后10至14天即可观察到发育中的根瘤。
2. 共生效率也可在每个时间点通过测量新生茎的长度来评估。
3. 共生效率的最终定量通常在接种后7周进行，通过切下茎部并测量其鲜重完成。若需要更长时间的生长，此步骤最晚可延迟至接种后9周进行。

结果

与引言中描述的大多数其他方法相比，这些平板微宇宙系统的制备和接种相对简单。使用这些微宇宙系统还允许植物长期生长（长达9周），无需浇水或补充营养，同时可维持根部无菌状态，便于观察根部并保护根部免受光照，植物地上部分能够自由生长，易于对茎秆进行长度测量，并可在对根毛造成最小损伤的情况下将植株从微宇宙系统中取出。 图1A 显示在培养箱中微宇宙环境下生长的幼苗。图中的 图1B-1E 显示含有微宇宙的多个不同视角 M. truncatula 接种了野生型的A17植株 S. meliloti 1021. 如果紧密包装， >220个微宇宙可放置在73.8 cm × 67.5 cm的培养箱搁板上。 图1B 和 1C 展示用铝箔包裹成堆的微宇宙装置，其中植物正从微宇宙的孔口生长而出。 图1D 显示一个微宇宙装置，铝箔已移除，根系和根瘤从前侧可见。 图1E 显示同一微宇宙平放状态，...

讨论

该实验方案中有多个步骤对成功至关重要：1）必须使用经过纯化且经植物细胞培养验证的琼脂，这一点再怎么强调也不为过。虽然苜蓿幼苗对此要求不高，但对于M. truncatula A17的生长而言，这一步极为关键。2）按照步骤1所述，在垂直琼脂平板上进行幼苗萌发非常重要。本方案不建议采用在15 mm深的平板中将幼苗置于倒置水平面上萌发的常用技术⁷，因为这样会导致幼苗根过短和/或不直。根长2–4 cm且笔直生长的幼苗最适合从萌发平板转移至微培养系统。通常情况下，在垂直萌发平板中培养3天，根即可达到理想长度。3）在接种前避免幼苗被根瘤菌污染也至关重要。在将幼苗从萌发平板转移至微培养系统之前，操作区域应彻底用乙醇清洁，所有转移过程中使用的器械应频繁进行火焰灭菌。另一个潜在的污染源可通过在与幼苗制备区域分离的工作区配制用于微培养系统接种的S. meliloti菌株悬浮液来避免。此外，可通过清除微培养系统内部所有种皮残留物来防止真菌污染，因为真菌孢子可能嵌在种皮中。4）通过在整个操作过程中始终保持幼苗根部湿润并与琼脂接触，并在转移时操作轻柔，可最大限度提高幼苗存活率。若幼苗根部在萌发平板中被琼脂卡...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
经琼脂纯化，植物细胞培养测试	Sigma	A7921