利用标准培养皿制成的单个无菌微环境培养Medicago truncatula植物，使其与固氮细菌Sinorhizobium meliloti建立共生关系，可在不破坏无菌条件的情况下频繁观察根系和根瘤。这些生长装置中的植物可维持长达9周。
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方法文章
单株无菌微环境系统用于豆科植物Medicago truncatula与根瘤菌共生体Sinorhizobium meliloti的结瘤及生长研究
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
根瘤菌可在相容的宿主豆科植物根部形成共生固氮根瘤。研究这类互作关系最成熟的模式系统之一是植物Medicago truncatula cv. Jemalong A17与根瘤菌Sinorhizobium meliloti 1021。对植物根部进行重复成像并评估共生表型，需要采用对植物或细菌均无损伤的方法。某些植物和细菌突变体的共生表型在相对较短的生长期后即可显现，无需对宿主/共生体互作进行长期观察。然而，根瘤发育早期阶段不明显的共生效率差异和根瘤衰老表型，则需要相对较长的生长时间后才能进行评估。目前已建立多种用于该宿主/共生体长期生长与观察的方法。但许多方法需要反复浇水，从而增加了其他微生物污染的可能性；另一些方法则需要较大的空间以培养大量植物。本文所述方法——在无菌、单株微环境系统中进行M. truncatula/S. meliloti共生培养——具有多项优势。该微环境系统中的植物可获得充足的水分和养分，最多9周内无需浇水，从而避免了浇水过程中可能发生的交叉污染。该方法使得在短期生长系统中可能被忽略的表型（如根瘤发育的细微延迟和早期根瘤衰老）得以被定量分析。此外，通过培养皿盖即可方便地观察微环境中的根系和根瘤，无需将植物挖出进行观察。
引言
豆科植物宿主与 Medicago truncatula A17 与根瘤菌 Sinorhizobium meliloti 1021 是研究根瘤发育和固氮共生最易操作的模式系统之一。两种共生伙伴的基因组均已测序。1,2 且植物和细菌均易于进行遗传操作3,4 对植物和细菌突变体表型的分析需要能够观察根瘤发育的各个阶段，并随时间量化共生效率。本文描述了一种观察根瘤发育的方法 M. truncatula cv. Jemalong A17 接种 S. meliloti 1021 个独立的微宇宙系统，由标准的圆形实验室培养皿制成，直径 100 mm，深度 15 mm（图1A）。芽体暴露后从培养板侧面的缺口孔中生长出来（图1B、1C和1E）。根系被限制在微宇宙系统内并保持无菌状态，同时可通过培养皿盖进行观察（图1D）。由于茎部易于接触，其生长不受限制，且可在不破坏根部无菌状态的情况下定期测量。带凹槽培养板微环境的构建方法最初由Leigh开发， 等5 用于紫花苜蓿植株的培养，尽管该方法相较于其他方法具有诸多优势，但并未得到广泛应用。此外，还发展出该方法的一种变体，用于分析植物根系与菌根真菌之间的相互作用6我们现已对该方法进行了改进和优化，以适用于生长 M. trun....
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方案
建议在无菌超净工作台中进行步骤 1、2、4 和 6。
1. 准备 M. truncatula A17 幼苗
注意：本研究中使用的蒺藜苜蓿（M. truncatula）A17种子是在约22 °C的低温温室条件下，或在22–26 °C、光照强度为约150–400 mmol/m-2 s-1的植物生长室中培育获得的。
- 倒入种子萌发平板：使用100 mm的方形培养皿（15 mm深），倒入高压灭菌的1.1-1.2% w/v纯化琼脂10，深度为3-5 mm。每个培养皿用于萌发约0.25-0.5 g种子（相当于每皿63-125粒种子）。
注意：本实验方案中所述的所有培养皿均必须使用经过植物细胞培养测试的纯化琼脂。琼脂的供应商及货号信息见“特定试剂与设备表”。 - 对M. truncatula A17种子进行划伤/灭菌处理：称取所需数量幼苗对应的种子量。（M. truncatula A17种子每粒约4 mg）将种子放入带有无菌铝箔封口的无菌125 ml三角瓶中（每瓶0.25-0.5 g种子；即约63-125粒种子），沿瓶壁加入20 ml浓硫酸（96% H2SO4）。
注意：酸处理可实现种子灭菌....
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结果
与引言中描述的大多数其他方法相比，这些平板微宇宙系统的制备和接种相对简单。使用这些微宇宙系统还允许植物长期生长（长达9周），无需浇水或补充营养，同时可维持根部无菌状态，便于观察根部并保护根部免受光照，植物地上部分能够自由生长，易于对茎秆进行长度测量，并可在对根毛造成最小损伤的情况下将植株从微宇宙系统中取出。 图1A 显示在培养箱中微宇宙环境下生长的幼苗。图中的 图1B-1E 显示含有微宇宙的多个不同视角 M. truncatula 接种了野生型的A17植株 S. meliloti 1021. 如果紧密包装， >220个微宇宙可放置在73.8 cm × 67.5 cm的培养箱搁板上。 图1B 和 1C 展示用铝箔包裹成堆的微宇宙装置，其中植物正从微宇宙的孔口生长而出。 图1D 显示一个微宇宙装置，铝箔已移除，根系和根瘤从前侧可见。 图1E 显示同一微宇宙平放状态，.......
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讨论
该实验方案中有多个步骤对成功至关重要：1）必须使用经过纯化且经植物细胞培养验证的琼脂，这一点再怎么强调也不为过。虽然苜蓿幼苗对此要求不高，但对于M. truncatula A17的生长而言，这一步极为关键。2）按照步骤1所述，在垂直琼脂平板上进行幼苗萌发非常重要。本方案不建议采用在15 mm深的平板中将幼苗置于倒置水平面上萌发的常用技术7，因为这样会导致幼苗根过短和/或不直。根长2–4 cm且笔直生长的幼苗最适合从萌发平板转移至微培养系统。通常情况下，在垂直萌发平板中培养3天，根即可达到理想长度。3）在接种前避免幼苗被根瘤菌污染也至关重要。在将幼苗从萌发平板转移至微培养系统之前，操作区域应彻底用乙醇清洁，所有转移过程中使用的器械应频繁进行火焰灭菌。另一个潜在的污染源可通过在与幼苗制备区域分离的工作区配制用于微培养系统接种的S. meliloti菌株悬浮液来避免。此外，可通过清除微培养系统内部所有种皮残留物来防止真菌污染，因为真菌孢子可能嵌在种皮中。4）通过在整个操作过程中始终保持幼苗根部湿润并与琼脂接触，并在转移时操作轻柔，可最大限度提高幼苗存活率。若幼苗根部在萌发平板中被琼脂卡.......
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披露
作者无任何披露信息。
致谢
本研究由美国农业部国家食品与农业研究所农业与食品研究计划基金资助，项目编号2010-65108-20582，授予K.M.J。我们感谢Brian K. Washburn对本文稿的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 经琼脂纯化，植物细胞培养测试 | Sigma | A7921 |
参考文献
- Galibert, F., et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293, 668-672 (2001).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520....
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重印与许可
