我们描述了一种在小鼠中建立内侧半月板失稳（DMM）模型的实验方案，该模型是骨关节炎（OA）研究的有效工具。此外，我们通过该模型证实，颗粒蛋白前体缺乏会加剧OA的发展和进展，表明颗粒蛋白前体在OA的发病机制中具有保护作用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
内侧半月板失稳（DMM）模型是研究多种关节炎相关分子在骨关节炎（OA）发病机制中病理生理作用的重要工具 体内然而，目前尚无建立小鼠该复杂模型的详细可视化操作方案。本文以野生型和颗粒蛋白前体（PGRN）-/- 小鼠为例，介绍一种在小鼠中建立DMM模型的操作流程，并比较手术诱导模型建立后骨关节炎的发生情况。对小鼠实施的操作包括假手术（仅切开关节囊）或DMM手术（切断半月板-胫骨韧带，导致内侧半月板失稳）。骨关节炎严重程度通过组织学检测进行评估（例如 番红 O染色）、OA相关基因的表达、软骨细胞外基质分子的降解以及骨赘形成。DMM手术在野生型和PGRN-/-小鼠中均成功诱导了OA的发生与发展，而PGRN生长因子的缺失导致该手术诱导模型中OA表型更为严重。
引言
骨关节炎（OA），也称为退行性关节炎，影响全球15%的人口以及美国超过4600万人，其特征为滑膜炎、软骨退变和骨赘形成1。该病可能是遗传、代谢、生物力学和生化因素复杂相互作用的结果。目前，骨关节炎的潜在发病机制仍不明确。现有多种动物模型可模拟骨关节炎的发病过程2,3。建立小鼠动物模型尤为重要，原因在于可获得多种基因修饰小鼠，且实验成本相对较低。在各类实验性骨关节炎模型中，通过手术诱导内侧半月板失稳（DMM）的模型因其良好的可重复性以及骨关节炎发展进程相对较慢，被广泛接受为一种标准模型 。这些特性对于评估不同治疗手段或转基因对骨关节炎进展的影响至关重要3-8。然而，手术诱导骨关节炎模型的一致性在手术过程中受到多种因素影响，因而限制了该小鼠模型的应用。
颗粒蛋白前体（Progranulin, PGRN）是一种在多种细胞中表达的多功能生长因子。已知PGRN在多种生理和疾病过程中发挥关键作用，如伤口愈合9、肿瘤发生10以及炎症反应11-15。研究还表明，PGRN的缺乏可导致人类和小鼠神经系统退行性疾病16-18。已知PGRN在人关节软骨中表达，并且在骨关节炎（OA）和类风湿性关节炎患者的软骨中其表达水平显著升高19。此外，PGRN在软骨细胞增殖20、分化以及发育过程中生长板的软骨内成骨21,22中也发挥着至关重要的作用。最近，我们报道了PGRN通过与TNF受体结合拮抗TNF-α的作用，并在炎症性关节炎模型中表现出抗炎功能13,14,23,24。然而，PGRN在骨关节炎（OA）中的作用，尤其是in vivo条件下的作用，仍不明确。本文中，我们介绍建立手术诱导DMM模型的方法，并通过在野生型（WT）和PGRN基因敲除（PGRN-/-）小鼠中构建DMM模型，研究PGRN在OA发展过程中的作用。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有涉及动物的外科手术均应获得当地机构动物护理与伦理委员会的批准，并应尽力将手术引起的疼痛和不适降至最低。
1. 准备
- 选择8至12周龄、体重约25 g的雄性C57BL/6小鼠用于手术。
- 通过腹腔注射混合麻醉剂进行麻醉，其中包含赛拉嗪（5 mg/kg）和氯胺酮（40 mg/kg）。
- 用剃刀剃除膝关节部位毛发，对手术动物进行外科铺巾，使用聚维酮碘和酒精对手术区域消毒（3次），并用眼膏覆盖小鼠眼睛。
2. 手术过程
- 做一个1 cm长的纵行内侧髌旁切口，以暴露膝关节。
- 通过髌骨和髌韧带的外侧脱位轻柔地打开膝关节。
- 在步骤 2.1中，通过内侧髌旁切口纵向切开膝关节关节囊。
- 用镊子分离膝关节关节囊。
- 用左手握住后肢足部远端，用镊子进行髌骨和髌韧带的外侧脱位。操作时应轻柔握住后肢足部，避免造成足部损伤。关节囊分离得越充分，脱位所需的力量就越小。
- 术中在关节软骨表面滴加无菌生理盐水，以防止软骨表面干燥。
- 切断将内侧半月板固定于胫骨平台的内侧半月板胫骨韧带。注意避免损伤内侧半月板下方的软骨。
- 辨认位于股骨内侧髁与胫骨内侧平台之间的内侧半月板。
- 辨认连接内侧半月板外侧缘与胫骨髁间隆起的半月板胫骨韧带。
- 用手轻柔固定后肢足部，使用10号手术刀片小心切断内侧半月板胫骨韧带。务必避免损伤关节软骨及其他韧带。在多数情况下，需将覆盖其上的脂肪垫牵拉至一侧以便辨认该韧带，但不应将其切除。
- 使用6-0可吸收缝线缝合膝关节关节囊。
- 使用6-0丝线缝合皮肤。
3. 术后护理
- 在每只小鼠的手术部位滴加一滴 0.25% 布比卡因，以减轻术后疼痛。
- 让术后小鼠自由获取水和食物。
4. 外科DMM模型的组织学评分
- 在指定时间点处死小鼠（例如 4周、8周和12周。本文展示术后8周的结果作为代表性数据。
- 整个膝关节经固定、脱钙、石蜡包埋后，连续切片，厚度为5 µm。
- 使用10号刀片切割整个后肢。
- 小心解剖后肢的皮肤和肌肉，并在室温下用4% PFA固定样本3天。
- 去除多聚甲醛，用水清洗样本。随后在4 °C下用EDTA脱钙2周。
- 使用乙醇梯度对样品进行脱水。具体操作如下：将样品置于70%乙醇中1小时，然后更换乙醇，将样品置于新鲜配制的70%乙醇中过夜（O/N）。随后依次将样品转移至80%和90%乙醇中，每种浓度各处理1小时，最后置于100%乙醇中过夜（O/N）。
- 除去乙醇。将样品置于二甲苯中 1 小时，然后更换为新鲜的二甲苯。重复此步骤 3 次。
- 使用徕卡包埋仪将样本包埋于石蜡模具中。随后，使用旋转式切片机（Leica RM2255，德国）将样本切片至5 μm。 然后收集 载于玻片上。
- 每个样本均切割连续的矢状面切片，切片范围从外侧髁中心延伸至内侧髁中心。
- 番红O染色完成后，采用此前所述的OARSI评分系统进行评分及统计分析25.
- 首先，将切片在二甲苯中脱蜡，并通过梯度乙醇水化至蒸馏水。随后，依次使用Weigert铁苏木精溶液、0.05%快绿（FCF）溶液、1%乙酸溶液和0.1%沙黄O溶液对切片进行染色。最后，使用树脂封片剂封片。
- 根据软骨中蛋白多糖（红色）的丢失程度以及软骨结构破坏所占的百分比，对番红O染色的切片进行评分，并对组织学评分进行统计学分析。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
小鼠中成功建立了DMM模型，PGRN缺乏加剧了手术诱导的骨关节炎发展。
对野生型（WT）和PGRN-/-小鼠进行了假手术和DMM手术（图1）。术后8周处死小鼠，对膝关节切片进行番红O染色，并根据组织学结果进行关节炎评分的统计分析。如图2A所示，假手术组中两种基因型小鼠的软骨均无明显退变（上图），表明基线条件相似。DMM手术8周后（下图），WT和PGRN-/-小鼠均出现蛋白聚糖丢失和软骨结构破坏（红色箭头）。蛋白聚糖的丢失和软骨降解均表明骨关节炎（OA）表型成功诱导。柱状图的误差线表示DMM手术组内个体间的差异，但误差线相对较短。与野生型小鼠相比，PGRN基因敲除小鼠表现出更明显的蛋白聚糖丢失，且软骨结构破坏更为严重。此外，软骨评分的统计分析按先前所述方法进行25，结果显示PGRN基因敲除组的软骨评分显著高于WT组。我们的结果表明，PGRN的缺失导致更严重的OA表型。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
据报道，小鼠品系对DMM模型的建立至关重要，因为不同品系的小鼠在DMM术后发生骨关节炎（OA）的严重程度存在差异，其中129/SvEv品系最严重，其次为C57BL6、129/SvInJ，最后是FVB/n26。目前大多数转基因小鼠模型均建立在C57BL6背景上，例如本研究中使用的PGRN-/-小鼠，该品系对DMM相对敏感。然而，如果转基因小鼠基于FVB/n等不敏感品系，则在进行DMM手术前需将其与敏感品系进行回交。用于DMM建模的小鼠性别也非常重要，已有研究表明雌性小鼠的敏感性低于雄性小鼠27。此外，根据文献报道，DMM手术小鼠的年龄通常在8至12周之间29，年龄因素在OA发病机制中亦起关键作用，因此应选择相同年龄的小鼠进行手术以消除该影响。术后需进行疼痛控制，以促进小鼠术后活动。由于DMM模型通过运动介导的软骨磨损导致OA发生，术后疼痛引起的活动不足可能导致OA进展不一致。目前关于DMM定义尚存争议，即是否应切除 内侧半月板4,28。在本研究中，我们仅对内侧半月板进行去稳定化处理而未将其切除。DMM模型中的病变主要位于胫骨内侧平台的中央负重...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
我们在此声明不存在利益冲突。
致谢
本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）研究基金 R01AR062207、R01AR061484、R56AI100901、K01AR053210 以及风湿病研究基金会（Rheumatology Research Foundation）的疾病靶向研究基金（授予 C. J. Liu）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10号外科手术刀片 | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 缝合线 | Applied Dental | WG-N53133 |
参考文献
- Herndon, J. H., Davidson, S. M., Apazidis, A. Recent socioeconomic trends in orthopaedic practice. J. Bone Joint Surg. Am. 83, 1097-1105 (2001).
- Johnson, K., et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science. 336, 717-721 (2012).
- Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nat. Med. 16, 687-693 (2010).
- Glasson, S. S., et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature. 434, 644-648 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthr. Cart. 15, 1061-1069 (2007).
- Chia, S. L., et al. Fibroblast growth factor 2 is an intrinsic chondroprotective agent that suppresses ADAMTS-5 and delays cartilage degradation in murine osteoarthritis. Arthritis Rheum. 60, 2019-2027 (2009).
- Miller, R. E., et al. CCR2 chemokine receptor signaling mediates pain in experimental osteoarthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20602-20607 (2012).
- Wang, Q., et al. Identification of a central role for complement in osteoarthritis. Nat. Med. 17, 1674-1679 (2011).
- He, Z., Ong, C. H., Halper, J., Bateman, A. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
- Bateman, A., Bennett, H. P. The granulin gene family: from cancer to dementia. Bioessays. 31, 1245-1254 (2009).
- Kessenbrock, K., et al. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatoryprogranulin. J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).
- Yin, F., et al. Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice. J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).
- Liu, C. J. Progranulin: A promising therapeutic target for rheumatoid arthritis. FEBS Lett. , (2011).
- Tang, W., et al. The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice. Science. 332, 478-484 (2011).
- Zhu, J., et al. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
- Baker, M., et al. Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17. Nature. 442, 916-919 (2006).
- Cruts, M., et al. Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21. Nature. 442, 920-924 (2006).
- Wils, H., et al. Cellular ageing, increased mortality and FTLD-TDP-associated neuropathology in progranulin knockout mice. J. Pathol. , (2012).
- Guo, F., et al. Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein. Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).
- Xu, K., et al. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation. J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).
- Bai, X. H., et al. ADAMTS-7, a direct target of PTHrP, adversely regulates endochondral bone growth by associating with and inactivating GEP growth factor. Mol. Cell. Biol. 29, 4201-4219 (2009).
- Feng, J. Q., et al. Granulinepithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis. FASEB J. 24, 1879-1892 (2010).
- Liu, C. J., Bosch, X. Progranulin: A growth factor, a novel TNFR ligand and a drug target. Pharmacol. Therap. 133, 124-132 (2012).
- Wu, H., Siegel, R. M. Progranulin Resolves Inflammation. Science. 332, 427-428 (2011).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Den Berg, W. B. V. an, Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthr. Cart. 18, 17-23 (2010).
- Glasson, S. S. In vivo osteoarthritis target validation utilizing genetically-modified mice. Curr. Drug Targets. 8, 367-376 (2007).
- Ma, H. L. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthr. Cart. 15, 695-700 (2007).
- Lin, A. C., et al. Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis. Nat. Med. 15, 1421-1425 (2009).
- Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthr. Cart. 18, 572-580 (2010).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
