建立小鼠手术诱导模型以研究颗粒体蛋白前体在骨关节炎中的保护作用

摘要

我们描述了一种在小鼠中建立内侧半月板失稳（DMM）模型的实验方案，该模型是骨关节炎（OA）研究的有效工具。此外，我们通过该模型证实，颗粒蛋白前体缺乏会加剧OA的发展和进展，表明颗粒蛋白前体在OA的发病机制中具有保护作用。

摘要

内侧半月板失稳（DMM）模型是研究多种关节炎相关分子在骨关节炎（OA）发病机制中病理生理作用的重要工具 体内然而，目前尚无建立小鼠该复杂模型的详细可视化操作方案。本文以野生型和颗粒蛋白前体（PGRN）-/- 小鼠为例，介绍一种在小鼠中建立DMM模型的操作流程，并比较手术诱导模型建立后骨关节炎的发生情况。对小鼠实施的操作包括假手术（仅切开关节囊）或DMM手术（切断半月板-胫骨韧带，导致内侧半月板失稳）。骨关节炎严重程度通过组织学检测进行评估（例如 番红 O染色）、OA相关基因的表达、软骨细胞外基质分子的降解以及骨赘形成。DMM手术在野生型和PGRN-/-小鼠中均成功诱导了OA的发生与发展，而PGRN生长因子的缺失导致该手术诱导模型中OA表型更为严重。

引言

骨关节炎（OA），也称为退行性关节炎，影响全球15%的人口以及美国超过4600万人，其特征为滑膜炎、软骨退变和骨赘形成¹。该病可能是遗传、代谢、生物力学和生化因素复杂相互作用的结果。目前，骨关节炎的潜在发病机制仍不明确。现有多种动物模型可模拟骨关节炎的发病过程^2,3。建立小鼠动物模型尤为重要，原因在于可获得多种基因修饰小鼠，且实验成本相对较低。在各类实验性骨关节炎模型中，通过手术诱导内侧半月板失稳（DMM）的模型因其良好的可重复性以及骨关节炎发展进程相对较慢，被广泛接受为一种标准模型 。这些特性对于评估不同治疗手段或转基因对骨关节炎进展的影响至关重要^3-8。然而，手术诱导骨关节炎模型的一致性在手术过程中受到多种因素影响，因而限制了该小鼠模型的应用。

颗粒蛋白前体（Progranulin, PGRN）是一种在多种细胞中表达的多功能生长因子。已知PGRN在多种生理和疾病过程中发挥关键作用，如伤口愈合⁹、肿瘤发生¹⁰以及炎症反应^11-15。研究还表明，PGRN的缺乏可导致人类和小鼠神经系统退行性疾病^16-18。已知PGRN在人关节软骨中表达，并且在骨关节炎（OA）和类风湿性关节炎患者的软骨中其表达水平显著升高¹⁹。此外，PGRN在软骨细胞增殖²⁰、分化以及发育过程中生长板的软骨....

方案

所有涉及动物的外科手术均应获得当地机构动物护理与伦理委员会的批准，并应尽力将手术引起的疼痛和不适降至最低。

1. 准备

1. 选择8至12周龄、体重约25 g的雄性C57BL/6小鼠用于手术。
2. 通过腹腔注射混合麻醉剂进行麻醉，其中包含赛拉嗪（5 mg/kg）和氯胺酮（40 mg/kg）。
3. 用剃刀剃除膝关节部位毛发，对手术动物进行外科铺巾，使用聚维酮碘和酒精对手术区域消毒（3次），并用眼膏覆盖小鼠眼睛。

2. 手术过程

1. 做一个1 cm长的纵行内侧髌旁切口，以暴露膝关节。
2. 通过髌骨和髌韧带的外侧脱位轻柔地打开膝关节。
   1. 在步骤 2.1中，通过内侧髌旁切口纵向切开膝关节关节囊。
   2. 用镊子分离膝关节关节囊。
   3. 用左手握住后肢足部远端，用镊子进行髌骨和髌韧带的外侧脱位。操作时应轻柔握住后肢足部，避免造成足部损伤。关节囊分离得越充分，脱位所需的力量就越小。
3. 术中在关节软骨表面滴加无菌生理盐水，以防止软骨表面干燥。
4. 切断将内侧半月板固定于胫骨平台的内侧半月板胫骨韧带。注意避免损伤内侧半月板下方的软骨。
   1. 辨认位于股骨内侧髁与胫骨内侧平台之间的内侧半月板。

结果

小鼠中成功建立了DMM模型，PGRN缺乏加剧了手术诱导的骨关节炎发展。

对野生型（WT）和PGRN-/-小鼠进行了假手术和DMM手术（图1）。术后8周处死小鼠，对膝关节切片进行番红O染色，并根据组织学结果进行关节炎评分的统计分析。如图2A所示，假手术组中两种基因型小鼠的软骨均无明显退变（上图），表明基线条件相似。DMM手术8周后（下图），WT和PGRN-/-小鼠均出现蛋白聚糖丢失和软骨结构破坏（红色箭头）。蛋白聚糖的丢失和软骨降解均表明骨关节炎（OA）表型成功诱导。柱状图的误差线表示DMM手术组内个体间的差异，但误差线相对较短。与野生型小鼠相比，PGRN基因敲除小鼠表现出更明显的蛋白聚糖丢失，且软骨结构破坏更为严重。此外，软骨评分的统计分析按先前所述方法进行²⁵，结果显示PGRN基因敲除组的软骨评分显著高于WT组。我们的结果表明，PGRN的缺失导致更严重的OA表型。

讨论

据报道，小鼠品系对DMM模型的建立至关重要，因为不同品系的小鼠在DMM术后发生骨关节炎（OA）的严重程度存在差异，其中129/SvEv品系最严重，其次为C57BL6、129/SvInJ，最后是FVB/n²⁶。目前大多数转基因小鼠模型均建立在C57BL6背景上，例如本研究中使用的PGRN-/-小鼠，该品系对DMM相对敏感。然而，如果转基因小鼠基于FVB/n等不敏感品系，则在进行DMM手术前需将其与敏感品系进行回交。用于DMM建模的小鼠性别也非常重要，已有研究表明雌性小鼠的敏感性低于雄性小鼠²⁷。此外，根据文献报道，DMM手术小鼠的年龄通常在8至12周之间²⁹，年龄因素在OA发病机制中亦起关键作用，因此应选择相同年龄的小鼠进行手术以消除该影响。术后需进行疼痛控制，以促进小鼠术后活动。由于DMM模型通过运动介导的软骨磨损导致OA发生，术后疼痛引起的活动不足可能导致OA进展不一致。目前关于DMM定义尚存争议，即是否应切除 内侧半月板^4,28。在本研究中，我们仅对内侧半月板进行去稳定化处理而未将其切除。DMM模型中的病变主要位于胫骨内侧平台的中央负重.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10号外科手术刀片	Feather	25-2976#10
6-0 缝合线	Applied Dental	WG-N53133