脑微血管内皮细胞（cEND）中的拉伸作用 体外 血脑屏障的创伤性脑损伤模型

摘要

体外创伤性脑损伤模型正在被开发以重现体内脑组织的形变。拉伸诱导损伤已被用于星形胶质细胞、神经元、胶质细胞、主动脉以及脑微血管内皮细胞的研究。然而，我们的系统采用了一种具有完整血脑屏障（BBB）特性的血脑屏障模型，以建立一种可靠的体外 创伤性脑损伤（TBI）模型。

摘要

由于创伤性脑损伤（TBI）导致的高死亡率，能够帮助人们更深入理解其潜在机制的方法对于治疗具有重要意义。目前既有 体内 和 体外 可用于此目的的方法。 在体 模型能够模拟创伤性脑损伤（TBI）发生时的真实头部损伤情况。然而， 体内 这些技术可能不适用于细胞生理学水平的研究。因此， 体外 对于此目的而言，这些方法更具优势，因为它们更便于对细胞及其胞外环境进行操作。

我们的方案展示了一种 体外 利用脑微血管内皮细胞的拉伸损伤建立创伤性脑损伤（TBI）模型。该模型通过向培养在柔性底壁孔板中的细胞施加可控压力，实现损伤程度从轻度至重度的精确调控。本实验室制备的鼠脑微血管内皮细胞（cEND）是血脑屏障（BBB）研究的适宜模型，相较于采用类似技术的其他系统具有明显优势。此外，该方法操作简便，实验装置易于重复。因此，该模型可用于研究TBI过程中血脑屏障水平的细胞与分子机制。

引言

创伤性脑损伤（TBI）是全球范围内导致死亡的主要原因之一。每年约有1000万人受到TBI影响，使其成为一个重大的公共卫生和医学问题¹。因此，已建立并开发了多种TBI的体内和体外模型，以研究其发病机制^2,3,4.。对TBI的更深入理解有助于改善患者治疗，降低相关死亡率、发病率及医疗成本。

许多利用两者的大脑损伤模型 体内 和 体外 方法存在。 体内 模型可以模拟真实的头部损伤事件。然而，由于其复杂性 体内 情况，对目标组织的可及性变得受限²在研究细胞因损伤而产生的生理反应时，将细胞与可能抑制或改变其个体反应的系统性效应隔离开来至关重要。⁵因此，细胞创伤模型相较于动物模型具有显著优势，因为可以精确控制细胞的力学环境。⁶.

体外 已开发出利用机械负荷作用于细胞或组织以确定由此类损伤方法所诱导变化的系统。例如，已有方法用于研究机械性损伤对星形胶质细胞、神经元、胶质细胞和主动脉内皮细胞的影响。^7,8,9。该 体外 为研究啮齿类和人类星形胶质细胞反应性而建立的创伤模型¹⁰ 采用与本模型所用相同的压力控制装置，对小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd3）施加拉伸以诱导损伤。¹¹ 以及皮层神经元^12,13 以及来自新生仔猪的脑微血管内皮细胞¹⁴该装置通过变形培养孔底部，从而产生机械拉伸损伤¹⁰通过在细胞上方施加气压，对培养的细胞造成损伤。该压力可使细胞生长的膜发生形变，从而拉伸细胞。不同程度的拉伸（即 "低 "中等" 或 "严重"通过相应地设置气压脉冲的持续时间和强度，可实现上述效果。这种拉伸诱导损伤的方法已与创伤性损伤相关联。 体内⁷此外，这种损伤方法能够精确控制细胞外环境，且易于重复。

尽管类似的方法已被用于包括bEnd3在内的多种其他脑细胞类型，但我们的模型具有优势，即采用了本实验室制备的小鼠脑微血管内皮细胞（cEND）。该细胞系是血脑屏障（BBB）的适宜模型。体外培养的细胞若用作BBB模型，应具备可作为通透性筛选工具的特性。一个理想的体外细胞模型若要准确预测BBB通透性，其必须具有生理上真实的细胞结构¹⁵。尽管bEnd3细胞在培养中表现出明显的纺锤形鳞状形态¹⁶，但其在体外表现出不规则的形态发生行为，在纤维蛋白凝胶中形成囊样空腔，而非规则的管状结构¹⁷。此外，当将这些细胞注射到胚胎期和新生小鼠体内时，它们会诱导快速生长的肿瘤，对胚胎小鼠具有致死性，但在新生和幼年小鼠中则不会。因此推测，该细胞系中调控正常内皮细胞生长、迁移和分化的某些过程可能已被改变或缺失¹⁸。相比之下，形态学、免疫细胞化学对内皮细胞及BBB标志物表达的评估，以及生物电特性和旁细胞通量的测量结果均表明，我们建立的BBB模型cEND确实是BBB的合适模型¹⁹。

脑血管内皮 体内 其特征是具有极低的通透性，跨内皮电阻（TEER）范围为 2,000–5,000 Ω·cm²对于研究脑微血管屏障对药物的通透性，应考虑细胞的细胞旁通透限制性和紧密性。在大多数脑毛细血管内皮细胞（BCEC）中，这种特性并未得到保持，因为这些细胞的跨内皮电阻（TEER）范围仅为50–100 Ω·cm^{2 20}永生化脑微血管内皮细胞系 bEnd3 产生的跨内皮电阻值不超过 60 Ω·cm^2 15相比之下，使用低血清培养基诱导cEND细胞分化时，其跨内皮电阻（TEER）值范围为300-500 Ω·cm²。^2 19,21.

迄今为止， 体外 培养的脑内皮细胞拉伸损伤模型较为稀缺。因此，一种 体外 使用培养的脑微血管内皮细胞作为血脑屏障模型来模拟拉伸损伤所致创伤的模型可能具有重要价值。在本方案中，我们介绍了一种 体外 一种能够模拟创伤性脑损伤（TBI）期间脑细胞——特别是血脑屏障（BBB）的脑微血管内皮细胞——所受实际影响的模型。该模型的主要优势在于，施加于细胞的损伤程度以及细胞外环境均可被精确控制，从而实现实验条件的高度可重复性。

方案

1. 将内皮细胞接种至培养板孔中

1. 在T75培养瓶中培养小鼠脑微血管内皮细胞（cEND），每周更换两次培养基（含10%胎牛血清、50 U/ml青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺的DMEM），直至细胞达到汇合状态。（关于脑微血管内皮细胞的建立与永生化方法，请参见Burek） 等，2012；Förster 等., 2005^21,19).
2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸除 PBS，加入 2 ml 温热的胰蛋白酶-EDTA 溶液消化细胞。
3. 在37 °C下孵育细胞5分钟 或直至细胞层完全分散。
4. 加入8 ml培养基至细胞中。轻轻拍打培养瓶数次，使细胞脱落。
5. 在显微镜下观察细胞，以确保其完全从培养瓶脱落。
6. 用移液管将含有脱落细胞的培养基上下吹打。轻轻旋动培养瓶以混匀细胞悬液。
7. 取20 µl细胞悬液，加入血细胞计数板，计数细胞数量。
8. 确定细胞密度，并以 20,000 个细胞/cm² 接种² 到孔中。
9. 将细胞悬液转移至经胶原蛋白1预包被的6孔板中 柔性底培养板（57.75 cm²）²) 总体积为 3 ml/孔。每孔面积为 9.62 cm²².
10. 在37 °C下培养细胞一周至汇合，每周更换两次培养基。

2. 拉伸损伤前的细胞分化

1. 用分化培养基（含1%去血清胎牛血清（ssFCS）、50 U/ml 青霉素/链霉素的DMEM）更换细胞的培养液。
2. 将细胞在37 °C下孵育24小时。

3. 内皮细胞的牵张诱导损伤

1. 打开细胞损伤控制器设备。
2. 将延迟时间设置为 50 毫秒。
3. 将调节器压力设为 15 psi，并按压触发器数次，直至记录的峰值压力趋于稳定。
4. 将调节器压力调整至所需数值。可参考表 1以产生不同程度的拉伸损伤。
5. 将6孔柔性底培养板（57.75 cm²）放入托盘架中。确保井孔选择器已设置为正确的孔径（i.e. 大孔）。
6. 将适配器插头牢固地盖在孔上。一只手稳稳固定插头，另一只手按下触发器。
7. 记录产生的峰值压力。
8. 立即将培养板放回 37 °C 培养箱中，孵育所需时间，或立即用于后续实验或检测。

4. 通过染料摄取实验评估拉伸损伤

1. 细胞拉伸后立即（步骤 3.7），向细胞培养基中加入 30 µl 浓度为 1 mg/ml 的活率染料溶液，该染料可作为细胞毒性标记物（请参见材料与设备补充表）（注意：每毫升细胞培养基使用 10 µl 染料溶液）。
2. 将染料加入细胞后，立即在荧光显微镜下观察。

5. 通过乳酸脱氢酶（LDH）释放评估拉伸损伤

1. 细胞拉伸后立即（步骤 3.7）从孔中移除 200 µl 细胞培养基。对于您希望纳入乳酸脱氢酶（LDH）释放研究的每个损伤后时间点，均需进行相同操作。即 例如 30 分钟，1 小时，2 小时 等等.)
2. 在微型离心机中以最高转速离心细胞培养基5分钟，以去除细胞碎片。弃去上清液，将上清液用于后续步骤。
3. 完成步骤5.1并采集所需各个时间点的样品后，使用LDH检测试剂盒中包含的裂解液裂解细胞（详见材料与设备补充表）。
4. 将检测试剂盒中提供的检测培养基各100 µl加入试剂盒提供的96孔板的每个孔中。
5. 将100 µl无细胞的细胞培养基加入检测试剂盒中包含的96孔板的两个平行孔中。
6. 在37 °C下孵育平板30分钟。
7. 在 492 nm 处读取吸光度。

结果

将细胞接种于预先包被I型胶原的6孔柔性底培养板（57.75 cm²）中，使用细胞拉伸装置施加不同程度的拉伸损伤。损伤后，在显微镜下观察细胞形态学变化以评估拉伸所致损伤效应。结果显示，随着施加的拉伸程度增加，细胞形变也更加明显（图1）。如图1A所示，未受损伤的对照组细胞呈现规则形态的脑血管内皮细胞（cEND），无细胞肿胀或形变迹象。当施加拉伸损伤后（图1B-D），在光学显微镜下可观察到细胞发生变形。当以3.5–4.5 psi的峰值压力对细胞进行重度拉伸时，cEND细胞明显回缩、肿胀并出现显著变形，细胞间隙增宽。此外，随着拉伸损伤程度的增加，细胞对活力染料的摄取也相应增强（图2）。所用的活力染料无法穿透健康细胞，仅在细胞质膜完整性受损时方可进入细胞。该染料被大多数对照组细胞排斥，因此仅有少量细胞被染色（图2A），而拉伸后的细胞染色比例明显升高（图2B-D）。随着拉伸损伤程度的增加，呈现绿色荧光的细胞数量增多。

作为一种损伤的生物化学标志物，根据制造商说明书检测了乳酸脱氢酶（LDH）的释放情况。图3显示，细胞拉伸损伤程度增加导致LDH释放量随之增加。

图1. 正常细胞与损伤细胞的光学显微镜检查。 (A正常未拉伸的汇合单层细胞排列紧密且呈长梭形。当施加1.8–2.0 psi的峰值压力脉冲进行拉伸时（即 低拉伸）下显得较为松散，箭头所指为间隙B）。当细胞受到2.5–3.0峰值压力脉冲的中度损伤时，部分细胞出现肿胀和变形（C）。在3.5–4.5 psi的强烈拉伸作用下，细胞出现收缩，如箭头所示（D100倍放大。 单击此处查看大图.

图2. 正常细胞与受损细胞的荧光显微镜观察。细胞在损伤后2小时用活细胞染料处理。A：未拉伸的对照细胞。B-D：拉伸后的细胞（B - 轻度，C - 中度，D - 重度）。放大倍数为100倍。点击此处查看高分辨率图像。

图3. 拉伸损伤后乳酸脱氢酶（LDH）在上清液中的释放情况。在拉伸损伤后不同时间点测定培养基中释放的LDH含量。LDH释放量以总可释放LDH（培养基与细胞内LDH之和）的百分比表示。数据以±标准误（SEM）表示。每个时间点的n值为5，仅严重拉伸组0小时时间点n=3。经低强度和中等强度拉伸的细胞LDH释放量与未拉伸对照组相比无显著差异，彼此之间亦无显著差异。经高强度拉伸的细胞在除1小时中等拉伸组外的所有样本中均释放了显著更高水平的LDH（p < 0.05，单因素方差分析，Holm-Sidak法）。点击此处查看高清图像。

表1. 产生不同程度拉伸损伤的指南。

调节压力	峰值压力	损伤程度
15 psi	1.2-1.5 psi	< 轻度
20-25 psi	1.8-2.0 psi	轻度
30-35 psi	2.5-3.0 psi	中度
40-50 psi	3.5-4.5 psi	重度
60 psi	4.8-6.0 psi	> 重度

讨论

机械损伤的影响 体外 已对星形胶质细胞、神经元、胶质细胞和主动脉内皮细胞进行了研究，并建立了相应的方法^{8, 9, 22}然而，迄今为止仍无已知的 体外 体外培养脑微血管内皮细胞的拉伸损伤模型。相较于动物模型，细胞创伤模型具有重要优势，因其可精确控制细胞所处的机械环境。⁶因此，一个 体外 使用培养的脑内皮细胞作为血脑屏障（BBB）模型，通过拉伸损伤建立创伤模型，例如本方案所展示的方法，可能被证明具有重要应用价值。

本方案使用cEND细胞，这是我们实验室建立的血脑屏障（BBB）模型。由于在创伤性脑损伤（TBI）患者中常观察到血脑屏障的破坏，且TBI常与血脑屏障功能障碍相关，后者可能导致水肿形成^{23, 24}，因此本文所述方法可专门用于与TBI相关的血脑屏障研究。

在此模型中，需注意施加给细胞的拉伸损伤程度。无论何种情况，细胞都会受到损伤，而不同压力大小所导致的内皮细胞损伤程度与其他细胞类型相比存在显著差异。主动脉内皮细胞对拉伸损伤的耐受性高于星形胶质细胞或混合胶质细胞⁹。此外，与其它细胞类型相比，它们在损伤后的修复速度也更快。因此，对于脑内皮细胞，尤其是cEND细胞，需要施加更大程度的拉伸损伤才能达到较高的损伤水平。可通过应用表1中所示的相应压力来实现所需的损伤程度。然而，由于cEND细胞对拉伸具有较强耐受性，通常更倾向于造成严重损伤。乳酸脱氢酶（LDH）检测结果显示，随着拉伸程度的增加，释放到上清液中的LDH量也随之增多。相反，接受较低程度拉伸损伤的细胞所释放的LDH量与对照组细胞相近。如实验方案中所述，必须注意使用适量的培养基，因为培养基体积的增加或减少可能导致施加于孔板中的峰值压力出现差异。例如，当施加45 psi压力时，含有5 ml液体的孔板其平均峰值压力为4.0 psi，而空孔板的平均峰值压力为3.8 psi。因此，最好先在对照孔板上多次触发装置，以确保所产生的峰值压力符合预期值。

在我们的实验中，使用了活细胞染色剂来确定拉伸对细胞膜通透性的影响。我们所使用的柔性底培养板具有良好的光学特性，可直接在显微镜下观察染色后的细胞。然而，若希望在拉伸损伤后立即进行免疫标记研究，则可能会遇到一些困难。首先，培养板的尺寸和厚度可能与某些显微镜观察平台不兼容。其次，培养孔中柔性膜的光学性质可能会影响清晰成像。

尽管存在上述局限性，但所述方案仍可作为模型使用 体外 血脑屏障的机械性损伤。创伤性脑损伤（TBI）包含两个组成部分，即缺血和创伤。缺血可继发于TBI之后，常见于严重失血导致低血压，或脑肿胀限制脑部氧气供应的情况。缺血被视为一种延迟发生的非机械性损伤，代表了在损伤发生时即已启动的一系列继发性病理过程。²⁵严重创伤性脑损伤后出现缺氧的情况很常见²⁶氧气葡萄糖剥夺（OGD）是目前用于模拟缺血的常用方法 体外因此，将细胞在拉伸损伤后再次暴露于氧糖剥夺（OGD）可模拟创伤性脑损伤（TBI）继发缺血的病理过程。因此，为改进我们目前的 体外 创伤性脑损伤模型，并尽可能使其模式接近实际发生的创伤性脑损伤 体内在未来 我们还将采用氧糖剥夺（OGD）与拉伸损伤相结合的方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞损伤控制器 II	美国弗吉尼亚州定制设计与制造
Bioflex 培养板 - I 型胶原蛋白	Flexcell，Dunn实验室技术	BF - 3001C
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM培养基	Sigma-Aldrich	D5796
胎牛血清（FCS）	PAA Laboratories	A15110-1333	终浓度10%，56℃加热灭活30分钟 °C)
L-谷氨酰胺	Biochrom AG	K0282	储存： ≤ -15 °C
MEM维生素	Biochrom AG	K0373	储存： ≤ -15 °C
Na-丙酮酸	Biochrom AG	L0473
非必需氨基酸（NEA）	Biochrom AG	K0293	4℃保存 °C
青霉素/链霉素	Biochrom AG	A2212	储存： ≤ -15 °C
胎牛血清，炭吸附处理（ssFCS）	Life Technologies	12676-011
胰蛋白酶-EDTA 溶液	PAA Laboratories	L11-004	储存： ≤ -15 °C
Image-iT DEAD Green	Life Technologies	I10291	储存： ≤ -15 °避光，4°C 保存
细胞毒性检测试剂盒PLUS（LDH）	罗氏	4744926001	储存： ≤ -15 °C