在光刻定义的聚对二甲苯-C：SiO 上进行细胞图案化2 底物

摘要

本方案描述了一种与微加工工艺兼容的在SiO₂表面进行细胞图案化的技术。通过光刻法将预设的聚对二甲苯-C（parylene-C）图案印制在SiO₂晶圆上。在孵育血清（或其他激活溶液）后，细胞特异性地黏附于下方的聚对二甲苯-C区域，并沿其轮廓生长，而在SiO₂区域则被排斥。

摘要

细胞图案化平台支持广泛的研究目标，例如构建预定义的体外神经元网络以及探索细胞生理学的某些核心方面。为了将细胞图案化技术与多电极阵列（MEAs）和基于硅的“芯片实验室”技术简便地结合，需要一种与微加工工艺兼容的实验方案。本文描述了一种利用聚对二甲苯-C（parylene-C）在SiO₂ 晶圆上进行沉积的方法。通过光刻技术，可在微米级分辨率下实现对聚对二甲苯-C的精确且可靠的图案化。随后通过浸入胎牛血清（或其它特定激活溶液）进行活化，从而获得一种基底，使培养的细胞分别选择性地黏附于聚对二甲苯区域或被SiO₂区域排斥。该技术已成功实现多种细胞类型的图案化（包括原代小鼠海马神经元、HEK 293细胞系、人源类神经元畸胎瘤细胞系、原代小鼠小脑颗粒细胞以及原代人胶质瘤来源的类干细胞）。然而，值得注意的是，该平台并非适用于所有细胞类型，这反映了细胞特异性黏附分子的重要性。这种细胞图案化方法成本低、可靠性高，且重要的是可整合入标准微加工（芯片制造）流程中，为微电子技术的集成应用开辟了道路。

引言

理解决定细胞在合成材料上黏附和排列模式的机制，对于组织工程、药物发现以及生物传感器制备等应用具有重要意义^1-3。目前已有多种技术并持续发展，这些技术均利用了影响细胞黏附的多种生物、化学和物理因素。

本文介绍了一种细胞图案化技术，该技术利用了最初为微电子制造而开发的工艺。因此，该平台非常适合将微电子技术（如MEA）整合到图案化平台中，实现后续的集成应用。

细胞膜与邻近材料之间的界面具有双向性和复杂性。 在体细胞外基质蛋白通过与细胞黏附受体相互作用，为组织提供结构支撑和机械强度，并影响细胞行为。同样，细胞 体外 通过蛋白质吸附层与合成底物相互作用⁴ 同时，物理化学因素也能调节黏附作用。例如，通过离子处理、紫外线照射，或用酸或氢氧化物进行蚀刻，可使聚合物表面更具“可润湿性”（亲水性）。⁵已建立的细胞图案化方法利用了这些及其他细胞黏附介质，例如喷墨打印⁶微接触印刷⁷，物理固定⁸微流控技术⁹实时操控¹⁰以及选择性分子组装图案化（SMAP）¹¹每种方法都有其特定的优势和局限性。然而，我们工作的关键驱动力是将细胞图案化技术与微机电系统（MEMS）相整合。

微机电系统（MEMS）指由电力驱动的极小型机械装置，其与纳米尺度的对应系统——纳米机电系统——存在重叠。只有当半导体技术使得微米尺度的制造成为可能时，这一概念才得以实现。最初为半导体电子器件开发的微加工技术，意外地被发现可用于其他领域，例如细胞电生理学。一个关键的后续目标是将此类微电子技术与高保真度的细胞图案化工艺相结合（从而形成生物微机电系统，即bioMEMS器件）。然而，目前已有的一些可靠且实用的细胞图案化技术却与这一目标不兼容。例如，嵌入式微电子元件或生物传感器的精确定位对其功能有效性至关重要，但采用微接触印刷等技术难以实现这种精确对准。

为解决这一问题，我们正在开发一种基于SiO₂的图案化平台，该平台采用光刻印刷的聚对二甲苯-C（parylene-C）。光刻技术涉及通过紫外光照射，将掩模上的几何图形转移到基底上。首先使用适当的计算机辅助设计程序设计掩模。在玻璃板上，一层薄的不透明铬层代表所需的几何图案（可实现1-2 mm的特征分辨率）。待图案化的基底表面涂覆一层薄的光刻胶（一种对紫外光敏感的聚合物）。涂覆后的聚合物与掩模对准并紧密接触。然后施加紫外光源，使未被遮挡的区域受到辐照，从而在后续显影步骤中变得可溶并被去除，最终在基底上留下与掩模图案相对应的聚对二甲苯-C结构。该技术起源于半导体器件的开发过程，因此硅晶圆常被用作基底。在SiO₂上进行聚对二甲苯-C的光刻沉积是一种直接且可靠的过程，通常在微电子洁净室设施中常规进行。

尽管聚对二甲苯具有多种理想的生物工程特性（化学惰性、不可生物降解），但其固有的细胞黏附性差在一定程度上限制了其在细胞图案化中的直接应用，部分原因在于其极强的疏水性。尽管如此，聚对二甲苯-C 之前已被间接用于细胞图案化，例如作为可剥离的细胞模板^12,13。该方法受限于分辨率较低，且需要多个步骤。本文所述方法则采用酸蚀刻步骤，随后进行血清孵育，通过降低疏水性并结合血清蛋白的吸附，使聚对二甲苯-C 区域具备细胞黏附性。

最终结果是一种由两种不同基底组成的构建体，在经过生物活化后，分别表现出细胞黏附性或细胞排斥性特征，因此可作为一种有效的细胞图案化平台。重要的是，该方法无需将生物试剂引入洁净室环境，因为图案化基底可在使用前长期储存（使用时通过胎牛血清或其他活化溶液进行活化）。

因此，这种聚对二甲苯-C/SiO₂ 图案化平台非常适合与微机电系统（MEMS）组件结合，因为其制造工艺与微电子器件制造工艺非常相似。

方案

1. 在 SiO₂ 上制备聚对二甲苯图案：工艺流程（见图1）

1. 使用能够读取/写入CIF（Caltech中间格式）或GDS-II（图形数据库系统II）文件的版图编辑软件，设计所需的聚对二甲苯-C结构。CIF和GDS-II是集成电路版图设计的工业标准文件格式。
2. 委托适当的微电子加工机构制造光刻掩模，或在具备条件的情况下自行制备。
3. 在大气压水平管式炉中，于950 °C下通入H₂（1.88 SLM）和O₂（1.25 SLM）氧化硅片40分钟，生成200 nm厚的SiO₂层（使用小光斑光谱反射仪确认厚度）。
4. 使用硅烷类粘附促进剂对氧化后的硅片进行预处理。随后，在专用于沉积聚对二甲苯的真空沉积系统中，于22 °C下以每毫克二聚体1.298 nm的速率沉积聚对二甲苯-C。下文所有示例均采用100 nm厚的聚对二甲苯-C涂层。
5. 使用合适的光刻胶涂覆系统，在已涂覆聚对二甲苯的硅片上沉积六甲基二硅氮烷（HMDS）粘附促进剂。
6. 使用上述相同的光刻胶涂覆系统，以4,000 rpm的转速旋涂硅片30秒，同时施加正性光刻胶（理论厚度为1 μm）。
7. 在90 °C下对硅片进行前烘60秒。
8. 将硅片和预制的光刻掩模一同插入掩模对准仪中。
9. 使用所需聚对二甲苯-C结构的紫外负像对涂有光刻胶的硅片进行曝光。
10. 将曝光后的硅片在110 °C下烘烤60秒。
11. 使用适当的显影液显影，去除硅片上所有已曝光的光刻胶。
12. 刻蚀掉未受保护的聚对二甲苯层。采用氧气等离子体刻蚀系统（腔室压力50 mTorr，O₂流量49 sccm，射频功率100 W、频率13.56 MHz，刻蚀速率为100 nm/min），暴露出下方的SiO₂层。
13. 使用合适的划片机对硅片进行切割（主轴转速30,000 rpm，进给速度7 mm/sec）。
14. 用去离子H₂O冲洗芯片，并用氮气吹干。
15. 将芯片存放在无尘盒中，可长期保存直至使用。

2. 芯片清洗与活化：操作步骤

1. 用丙酮清洗芯片以去除残留的光刻胶，持续10秒。
2. 用去离子蒸馏水冲洗₂O 3x.
3. 配制新鲜的piranha酸（30%过氧化氢与98%硫酸按5:3比例混合）。
   警告：制备piranha酸时需格外小心。它是一种极强的氧化剂，具有强酸性，且过氧化氢与硫酸混合为放热反应。此步骤须在酸性通风橱中进行。静置2分钟 混合配制皮拉尼酸后需立即使用，且须在20分钟内用完。
4. 将芯片浸入piranha酸中清洗和蚀刻10分钟。
5. 用去离子水冲洗芯片 3 次₂O，并转移至无菌培养皿中。
6. 现在激活用于细胞图案化的芯片。例如，将两个芯片放入6孔板的每个孔中，然后加入2 ml胎牛血清，以完全浸没所有芯片。此步骤及后续所有细胞培养步骤均须在超净工作台的无菌条件下进行。
7. 将芯片在血清中孵育3-12小时 37 °C
   注意：步骤 2.4–2.7 应依次连续进行，各步骤之间不得延迟。若血清激活延迟 ≥24 小时 经piranha处理后，由于SiO对细胞的排斥作用降低，细胞图案化受到干扰₂ 区域
   可使用含有特定细胞黏附蛋白的替代激活溶液代替胎牛血清。此类溶液可改变两种不同基底的细胞黏附特性（参见代表性结果中的示例）。

3. 芯片上细胞系接种：实验方案

1. 将芯片从活化溶液中取出，并用Hank's平衡盐溶液冲洗一次，持续10秒。
2. 将芯片放入培养孔中，并在常规生长培养基中以悬浮状态接种选定的细胞类型。最佳的细胞接种密度取决于细胞类型以及芯片上聚对二甲苯-C的几何图案。5 × 10⁴ 个细胞/ml 是一个合理的起始密度。
3. 成像方式根据细胞图案化的具体研究目的进行调整，但活细胞行为可轻松通过解剖显微镜结合配备合适中继镜头的数码相机进行评估。

结果

使用聚对二甲苯-C（parylene-C）对二氧化硅（SiO₂）进行光刻图形化的工艺如图1所示。芯片制备完成后，在胎牛血清中活化即可实现在培养中对多种细胞类型进行图案化。本课题组已成功实现了小鼠原代海马神经元^14-16、HEK 293细胞系¹⁷、人神经样畸胎瘤（hNT）细胞系¹⁸、小鼠原代小脑颗粒细胞以及人胶质瘤来源的干细胞样细胞的图案化培养。

图3展示了HEK 293细胞在由带“十字线”延伸结构的圆形节点构成的聚对二甲苯图案上形成的稳定图案。本示例中，芯片的活化采用胎牛血清。相比之下，图4展示了通过使用其他活化溶液来增强图案化平台性能的潜力。在HBSS中使用含牛血清白蛋白（3 mg/ml）和纤连蛋白（1 μg/ml）的溶液后，先前的图案化模式被完全逆转。

图5展示了一种不同类型的细胞（一种来源于高级别胶质瘤的人源性原代类干细胞系）。在此，底层图案的几何形状影响了细胞行为，如图4A所示的图案可促进细胞突起沿细的聚对二甲苯-C轨迹生长，如图4B和图4C所示。

某些细胞类型在使用既定的胎牛血清激活方案时不会形成图案。图6展示了3T3-L1细胞生长至汇合状态，在聚对二甲苯-C和SiO₂区域之间未见明显的细胞排斥性或细胞黏附性差异。

图1. 说明在SiO₂上制备聚对二甲苯-C图案过程的流程图。

图2. 流程图，展示芯片活化步骤中图案化聚对二甲苯-C和SiO₂区域接触角的变化。

图3. 在聚对二甲苯-C/SiO₂上培养的HEK 293细胞的活细胞成像₂ 三天后 体外. 芯片在胎牛血清中孵育3小时后，将细胞以5 x 10的浓度悬浮接种⁴ 细胞/毫升。聚对二氯苯促进细胞黏附，而裸露的SiO₂ 排斥细胞。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图4. 在聚对二甲苯-C/SiO上培养的HEK 293细胞的活细胞成像₂ 三天后 体外. 不同优化激活溶液中活化3小时的芯片： A胎牛血清 B：HBSS 中的玻连蛋白（1 μg/ml）， C: HBSS 中的牛血清白蛋白（3 mg/ml）+ 玻连蛋白（1 μg/ml）， D牛血清白蛋白（3 mg/ml）+ 纤连蛋白（1 μg/ml）溶于HBSS中。接种的细胞处于悬浮状态，密度为5 x 10⁴ 细胞/毫升。注意芯片的不同处理如何导致了先前图案化范式发生逆转，其中SiO₂ 现在具有粘附性，而聚对二甲苯-C 具有排斥性。聚对二甲苯-C 节点直径为 250 μm，改编自 Hughes 等¹⁷ 请点击此处以查看此图的放大版本。

图5. 在二氧化硅表面不同图案化的派瑞琳-C上培养的原代人源胶质瘤干细胞样细胞的免疫荧光图像₂. A：示意图展示网状聚对二甲苯设计 B 和 C. B：固定细胞的荧光显微图像（培养4天后） 体外) 对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）进行染色。 C同一芯片上活细胞的光学显微照片。 D荧光图像，显示在另一种聚对二甲苯设计上经GFAP染色的细胞。 E：节点与轮辐状聚对二甲苯设计的反射图像 D. 请点击此处以查看此图的放大版本。

图6. 在聚对二甲苯-C/SiO₂上培养的3T3-L1细胞的活细胞成像₂ 四天后 体外 芯片在胎牛血清中活化3小时，随后将细胞以悬浮状态接种（3 × 10⁶）⁴ 细胞/ml）。在此情况下，该平台无法实现图案化，细胞在聚对二甲苯-C和SiO₂上均等达到汇合状态。₂ 区域 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

将芯片浸入piranha酸不仅可去除任何残留的有机物，还能蚀刻基底表面。这对于通过胎牛血清实现有效活化至关重要。若不进行此步骤，将无法实现细胞图案化，并显著改变芯片上细胞的行为。使用piranha酸清洗后无需对芯片进行灭菌。事实上，已有研究表明，紫外线照射灭菌会以剂量依赖的方式破坏细胞图案化¹³。在光刻工艺后，必须仔细清洗掉所有残留的光刻胶。残留的光刻胶可能形成非预期的细胞黏附层，从而干扰由聚对二甲苯-C/SiO₂几何结构所决定的图案化。在使用上述光刻工艺及指定试剂时，丙酮具有良好的去除效果。然而，其他类型的光刻胶可能需要使用不同的溶剂。

为了评估不同制备步骤的影响和成功率，可以测量两种不同基底的接触角。图2展示了芯片活化过程中发生的变化。然而，血清中特定的黏附性和排斥性蛋白质成分可能最终使聚对二甲苯图案化芯片表现出相应的细胞黏附性或细胞排斥性特征。

所有代表性结果均使用了聚对二甲苯厚度为100 nm的芯片，尽管我们已成功使用更厚和更薄的聚对二甲苯层进行图案化。重要的是，这种光刻蚀刻技术对聚对二甲苯结构的三维控制能力远超此处所示示例。例如，通过组合使用光掩模，可以制造出具有不同厚度区域的聚对二甲苯结构。这为构建具有明确定义三维形貌的细胞培养环境开辟了途径，不仅限于简单控制细胞黏附/排斥区域，还可能为将微流体通道整合到结构中提供方法。

然而，如所示，这种图案化平台并非在所有细胞类型中均普遍有效。不同的细胞系因其细胞黏附分子谱存在差异，在该平台上培养时表现出不同的行为，这并不令人意外。我们尚未确定血清中的关键组分，也未明确支持该细胞图案化平台的互补性细胞膜受体。未来若能解决这些问题，有望拓展该平台的应用范围和特异性。例如，可通过基因改造使“非图案化”细胞系表达所需的黏附分子，从而促进其图案化形成。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
版图编辑软件包	CleWin 5.0，来自 WieWeb		能够读取/写入 CIF 或 GDS-II 文件。用于创建用于光掩模制造的聚对二甲苯设计。http://www.wieweb.com/ns6/index.html
定制光掩模	Compugraphics International Ltd，苏格兰格伦罗西斯		可在具备条件的内部设施中制备，或委托加工。www.compugraphics-photomasks.com
3 英寸硅晶圆	Siltronix，法国阿尚		http://www.siltronix.com
常压水平管式炉	Sandvik		用于氧化硅晶圆。http://www.mrlind.com
小光斑光谱反射仪	Nanometrics		用于测量二氧化硅层的厚度。www.nanometrics.com/
硅烷偶联剂	Merck Chemicals	1076730050	预先涂覆于晶圆表面，以促进聚对二甲苯沉积。www.merck-chemicals.de/
聚对二甲苯-C	Ultra Electronics		www.ultra-cems.com
SCS Labcoter 2 沉积设备，型号 PDS2010	SCS Equipment，英国萨里	Model PDS2010	www.scscoatings.com/
六甲基二硅氮烷（HMDS）偶联剂	SpiChem		www.2spi.com
用于在晶圆上涂布光刻胶的自动涂胶轨道系统；3 英寸光刻胶涂布轨道	SVG（硅谷集团）		用于在晶圆上自动涂布光刻胶的轨道系统。前烘炉对晶圆进行烘焙并涂布偶联剂 HMDS。组合式匀胶机用于涂布光刻胶。预烘炉用于固化光刻胶。
光刻胶	Rohm & Haas	SPR350-1.2 正性光刻胶	www.rohmhaas.com/
MA/BA8 光掩模对准器	Suss Microtech		www.suss.com
Microchem MF-26A 显影液	Microchem		用于去除曝光区域的光刻胶。www.microchem.com
JLS RIE80 等离子体刻蚀系统	JLS Designs		用于去除暴露区域的聚对二甲苯。www.jlsdesigns.co.uk
[header]
DISCO DAD 680 晶圆划片机	DISCO Corporation，日本		www.disco.co.jp
丙酮	Fisher Scientific	A929-4	用于清洗残留的光刻胶。
30% 过氧化氢	Sigma-Aldrich	H1009	www.sigmaaldrich.com
98% 硫酸	Sigma-Aldrich	435589	www.sigmaaldrich.com
胎牛血清	Gibco-Invitrogen	10437	标准芯片活化。 www.invitrogen.com
Hank's 平衡盐溶液	Gibco-Invitrogen	14170	www.invitrogen.com