原位 液相中生物组装体的透射电子显微镜观察

摘要

本文介绍了一种利用透射电子显微镜在液体环境中以纳米级分辨率对病毒复合物进行成像的方法。

摘要

研究人员经常使用透射电子显微镜（TEM）来观察生物实体并评估新材料。本文介绍这些仪器的另一项应用——在液体环境中观察病毒组装体。这种令人振奋且新颖的生物结构可视化方法利用了 recently developed 基于微流控技术的样品台。我们的视频文章展示了如何组装和使用微流控样品台，在透射电子显微镜中对液体样品进行成像。具体而言，我们以灵长类轮状病毒双层颗粒（DLPs）作为模型系统。我们还描述了用亲和生物膜包被液体腔室表面的步骤，以将 DLPs 固定在观察窗口上。这使得我们能够以适用于三维结构解析的方式对组装体进行成像。因此，本文首次展示了亚病毒颗粒在天然液体环境中的形态。

引言

生物学家和工程师的共同目标是理解分子机器的内部工作机制。透射电子显微镜（TEM）是用于在接近原子分辨率下观察这些复杂细节的理想仪器^1-2。为了维持透射电子显微镜的高真空系统，生物样本通常被包埋在玻璃态冰薄层³、糖类⁴、重金属盐⁵或其某种组合中⁶。因此，包埋样本的图像可能仅能揭示动态过程的有限快照。

帕森斯（Parsons）及其同事曾利用差分抽气腔室，尝试在环境液体腔中保持生物样本的水合状态。未染色的过氧化氢酶晶体在水合状态下成功获得了分辨率为3 Å的电子衍射图谱^7-8。此外，还可观察人红细胞水合膜中的相分离脂质区域^9-10。然而，由于液体扩散引起的样本运动及其对电子束的干扰，导致分辨率严重下降，因此直到最近之前，尚未再开展针对生物样本的进一步实验。

新开发的微流控样品 holder 采用半导体微芯片构建微尺度环境腔室。这些装置可在样品置于透射电子显微镜（TEM）镜筒内的同时，使其保持在液态环境中^11-12。这一透射电镜成像技术的突破，首次使研究人员能够观察到分子水平上的动态过程¹³。我们将这种新兴技术模式称为“原位分子显微术”（in situ molecular microscopy），因为实验现在可以直接在电镜镜筒“内部”进行^14-15。该方法的总体目标是在液态环境中对生物大分子组装体进行成像，以纳米级分辨率观察其动态行为。该技术的设计理念在于记录实时观测结果，并探究溶液中生物分子机器的新特性。这一方法拓展了透射电子显微镜在细胞与分子生物学领域更广泛的应用前景^12-16。

在本视频文章中，我们介绍了一种组装和使用市售微流控样品 holder 的全面方案。这些专用的 holder 利用带有集成式间隔层的氮化硅微芯片，形成可封闭微量液体的液相腔室。微芯片上刻蚀有薄而透明的窗口，用于成像¹²。我们展示了如何正确使用微流控 holder，通过透射电子显微镜（TEM）在液相环境中观察灵长类轮状病毒双层颗粒（DLPs）。为了确保生物组装体（如 DLPs）在成像过程中不会迅速扩散至较大距离，我们采用亲和捕获（Affinity Capture）方法将其固定在微流控腔室的表面¹⁶。这种分子捕获步骤在液相生物样品成像方面具有相较于其他技术的显著优势，因为它能够获取可用于后续处理流程的图像。将该捕获步骤与微流控成像结合使用，是本实验流程的独特之处¹⁷。使用透射电镜（TEM）或微流控成像腔室进行结构生物学研究的读者，若最终目标是实现分子水平的动态观察，可考虑采用亲和捕获技术。

方案

1. 准备亲和捕获装置¹⁶

1. 将硅氮化物E芯片在15 ml丙酮中孵育2分钟，随后在15 ml甲醇 中孵育2分钟，以清洁芯片（图 1A）。在层流通风条件下使芯片自然干燥。
2. 将干燥后的芯片置于加热搅拌板上（不搅拌），在150 °C下孵育1.5小时，然后冷却至室温后再使用。
3. 使用汉密尔顿注射器在小玻璃管中配制脂质混合物，其中包含25%氯仿、55% DLPC（1,2-二月桂酰基-磷脂酰胆碱）氯仿溶液（1 mg/ml）和20% Ni-NTA脂质（1,2-二油酰基-亚氨基二乙酸-琥珀酰-镍盐）氯仿溶液（1 mg/ml），总体积为40 μl。
4. 在湿润的培养皿中，将1 μl该混合物滴加至Parafilm表面的每滴15 μl Milli-Q水中（图 1B）。将样品在冰上孵育至少60分钟。

2. 捕获大分子¹⁷

1. 将带有150 nm集成垫片的E芯片置于单层样品上方，孵育1 min（图 1C）。
2. 轻轻将芯片从样品上提起，加入3 μl His标签蛋白A。室温孵育1 min（图 1D）。
3. 用Whatman #1滤纸吸去多余的液滴，立即加入3 μl抗体溶液。室温孵育1 min。
4. 使用Hamilton注射器除去多余的溶液，立即加入1 μl 缓冲液中的轮状病毒DLPs（0.1 mg/ml），缓冲液组成为50 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl、10 mM MgCl₂和10 mM CaCl₂。室温孵育至少2 min。DLPs的制备方法此前已有描述¹⁸。

3. 组装微流控芯片并加样 原位 样品台

1. 将含有病毒样本的湿态E芯片装入微流控样本 holder 的尖端。对另一片平的E芯片进行辉光放电处理1分钟，然后将其加载到间隔芯片的上方（图 2，图示1-5）。
2. 或者，为了增强生物大分子的对比度，在将第二片E芯片放置于湿态样本之上前，可在样本中加入重金属染色剂（例如 0.2% 甲酸铀酰）。然而，在添加对比度增强试剂之前，需先用Milli-Q水清洗含有样本的E芯片。
3. 将整个组件夹紧形成一个密封腔体，并通过3个黄铜螺丝在holder内进行机械固定（图 2，图示6-8）。
4. 组装完成后，在将holder放入透射电子显微镜（TEM）之前，使用涡轮分子泵驱动的无油抽气站将holder尖端抽真空至10^-6 Torr。

4. 使用透射电子显微镜在液体中成像

1. 将 原位样品台装入配备LaB₆灯丝、工作电压为120 kV的透射电子显微镜（FEI公司）中。
2. 开启透射电镜灯丝，并使用摇摆（wobbler）功能在镜筒内将样品从-15°至+15°来回倾斜，以调节显微镜载物台相对于样品的同心高度。该步骤通过在z方向上调节载物台，以补偿液体腔室的适当厚度，同时确保在记录图像时使用准确的放大倍数。
3. 首先在微流控腔室的边缘和角落区域记录图像。这些区域通常含有最薄的溶液。使用CCD相机在低剂量条件下（1–3 电子/Ų）记录样品图像，选用6,000X至30,000X的标称放大倍数。
4. 通过在流体腔室边缘聚焦来确定合适的离焦值。在30,000X放大倍数下成像时，采用-1.5 μm的离焦值。若遇到较厚的溶液，或在样品制备过程中未使用对比剂，则应使用-2至-4 μm范围内的更高离焦值。
5. 为确保在整个实验过程中溶液始终被封闭在微流控腔室内，需聚焦电子束直至装置内的液体中形成气泡。

结果

使用经过辉光放电处理的E芯片在液体中观察双层颗粒（DLPs）的代表性图像显示，在给定视野范围内DLPs数量较少（图3A），这可能是由于扩散作用所致，相比之下，通过亲和捕获装置富集的DLPs更为集中（图3B）。在成像腔室中加入甲酸铀酰可增强样品的对比度，从而提高溶液中单个DLPs的可见性（图3C，上图）。更高的对比度有利于后续的图像处理，例如颗粒平均化（图3C，下图）和三维重构分析（图3C，插图），如先前所述¹⁷。简而言之，在进行三维重构时，我们使用SPIDER软件包¹⁹选取了600个DLP颗粒。所选颗粒基于一个初始的轮状病毒DLP模型进行优化²⁰，该模型被滤波至80 Å分辨率。我们采用RELION软件包²¹计算得到一个分辨率约为25 Å的三维重构图。我们的三维密度图与初始模型以及使用相同参数和DLP样品计算出的独立冷冻电镜三维重构结果均具有良好一致性¹⁷。

讨论

在本研究中，我们采用亲和捕获方法将轮状病毒双层颗粒（DLPs）固定于微流控平台，从而实现了 原位 在液体微环境中的大分子复合物成像。该 捕获方法相较于其他微流控成像技术具有重要意义 因为它能将生物样本定位到成像窗口，从而避免在液体中记录图像时出现的大范围扩散问题。然而，其中一个 我们方案中最关键的步骤 涉及将脂质生物膜转移至微芯片表面。若脂质单层未能均匀铺展在网格上，则会导致实验失败。转移步骤不佳的一个表现是流体芯片上结合的病毒组装颗粒极少甚至没有。转移步骤的一个限制因素是脂质层流动性相关的热稳定性。若经评估发现液滴铺展不均，表明转移步骤不充分，此时应将脂质层在冰上或无振动的低温环境中孵育更长时间。此外，培养皿必须用Parafilm充分密封，以维持适当的湿度。

微芯片样品中病毒复合物或衔接蛋白过量可能导致颗粒过度聚集。这是该实验方案中的一个局限性，但可轻松控制。为尽量减少聚集效应，可缩短蛋白因子的孵育时间，或对病毒样品进行进一步稀释。若检测到非特异性蛋白过量，可在缓冲液中加入新鲜配制的咪唑（约50 m...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E-chips，间隔芯片	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 μm × 50 μm 窗口
E-chip，顶芯片	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 μm × 50 μm 窗口
Ni-NTA 脂质	Avanti Polar Lipids	790404P	粉末形态
DLPC (12:0) 脂质	Avanti Polar Lipids	850335P	粉末形态
容量瓶	Fisher Scientific	20-812A；20-812C	1 ml；5 ml
Hamilton 注射器	Hamilton Co.	80300，80400	1–10 μl；1–25 μl
Whatman #1 滤纸	Whatman	1001 090	100 张，90 mm
玻璃培养皿	Corning	70165-101	100 mm × 15 mm
玻璃巴斯德吸管	VWR	14673-010	14673-010
玻璃培养管	VWR	47729-566	6 mm × 50 mm
丙酮	Fisher Scientific	A11-1	1 L
甲醇	Fisher Scientific	A412-1	1 L
氯仿	Electron Microscopy Sciences	12550	100 ml
带 His 标签的 Protein A	Abcam, Inc.	ab52953	10 mg
Milli-Q 超纯水系统	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	超纯水
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	500 g
设备
Poseidon 原位样品台	Protochips, Inc.		与 FEI 兼容
FEI Spirit BioTwin 透射电子显微镜（TEM）	FEI Co.		120 kV
Eagle 2k HS CCD 相机	FEI Co.		在 30,000× 下采样分辨率为 10 Å/像素
Gatan 655 干泵站	Gatan, Inc.		将样品台尖端抽至 10-6  范围
PELCO easiGlow 电晕放电仪	Ted Pella, Inc.		负极性模式
Isotemp 加热搅拌器	Fisher Scientific		加热至 150 ºC，持续 1.5 小时