利用基于原子力显微镜的单分子力谱研究纤维素体的受体-配体系统

摘要

纤维素体是用于降解纤维素的多酶复合物。本研究采用基于原子力显微镜的单分子力谱技术（AFM-based SMFS）来研究与纤维素体相关的蛋白质组装体的力学性质及其折叠构型。我们提供了一套完整的工作流程，用于蛋白质固定、数据采集和数据分析，以研究参与纤维素体组装的单个受体-配体复合物之间的相互作用。

摘要

纤维素小体是一类由部分厌氧细菌和真菌用来降解木质纤维素底物的离散多酶复合物。这些酶通过一系列相关的受体-配体相互作用，组装到非催化性的骨架蛋白上，该过程由相互作用的黏连模块（cohesin）和对接模块（dockerin）介导。黏连模块与对接模块之间具有极强的结合力，解离常数处于低皮摩尔至纳摩尔范围，这可能阻碍传统群体方法对解离速率的精确测量。原子力显微镜单分子力谱（SMFS）可测量单个生物分子对施加力的响应，与其他单分子操纵技术相比，即 光镊）最适合研究高亲和力受体-配体相互作用，因其能够探测高力区间（>120 pN）。本文介绍了我们在单分子水平上研究纤维素体蛋白组装的完整实验方案。基于天然纤维素体的蛋白拓扑结构，我们采用了酶- dockerin 融合蛋白以及碳水化合物结合模块-共济素（CBM-cohesin）融合蛋白，每种蛋白均在设计的半胱氨酸残基处具有可及的游离巯基。我们展示了位点特异性表面固定化方案，以及用于获取高亲和力复合物详细结合参数的测量与数据分析流程。文中阐述了如何量化单个亚结构域的解折叠力、复合物解离力、解离速率常数（kinetic off-rates）以及结合势阱的势阱宽度。此外，还进一步描述了这些方法在表征介导多结构域纤维素降解复合物组装的共济素（cohesin）-dockerin 相互作用中的成功应用。

引言

纤维素小体是存在于厌氧纤维素降解细菌表面的大型多酶复合物（例如 C. thermocellum能够高效地将植物细胞壁中的木质纤维素降解为可溶性寡糖的微生物¹细胞表面体的一个核心特征是高亲和力的黏连素-对接素相互作用。在最典型的模式中，多种细菌酶的C末端展示出一个高度保守的约60-75个氨基酸组成的I型对接素模块。该对接素模块可引导多种酶协同组装到非催化性的骨架蛋白（“支架蛋白”）上，该骨架蛋白由多个对I型对接素模块具有特异性的黏连素结构域组成的多蛋白结构。在更高级的结构层次上，细胞表面体的构架可能变得非常复杂，包含其他类型的黏连素与对接素配对（例如 II型、III型）将这些结构锚定在细胞表面，并介导含有多个支架蛋白的分支结构的组装²不同的卷曲蛋白-对接蛋白类型尽管结构相似，却表现出差异性的结合特异性，从而抑制了与非目标支架蛋白或其他产纤维素体细菌物种组分之间的交叉反应。尽管生物信息学方法已在基因层面成功鉴定了数千种独特的纤维素体组分，但已知的蛋白质结构仍相对较少，卷曲蛋白与对接蛋白特异性识别的分子机制仍是结构生物学研究的活跃领域。

自从Binnig等人发明原子力显微镜（AFM）以来et al.³，已发展并持续改进了多种AFM操作模式，包括非接触成像、振荡模式成像⁴以及单分子力谱（SMFS）^....

方案

本研究中用于探究黏连蛋白-对接蛋白相互作用的拉伸几何构型示意图见图1A。本文报道的悬臂梁和盖玻片功能化所用的蛋白质固定方案，是此前发表方法²⁷的改进版本。蛋白质通过常规方法在E. coli中由质粒载体表达获得。这些蛋白质设计含有溶剂可及的巯基，可与马来酰亚胺化学结合，通过稳定的硫醚键将蛋白质共价连接至盖玻片表面和悬臂梁上。在CBM-黏连蛋白和木聚糖酶-对接蛋白融合蛋白中，人工引入的半胱氨酸残基均位于蛋白质的N端一侧，远离黏连蛋白-对接蛋白结合界面¹¹。蛋白质固定过程中所用化学键合的详细示意图见图1B。

1. 样品制备

1. 缓冲液
   1. 配制含钙的 Tris 缓冲盐水（TBS）：25 mM TRIS、75 mM NaCl、1 mM CaCl₂，pH 7.2
   2. 配制硼酸钠缓冲液：50 mM Na₂B₄O₇，pH 8.5
      样品制备步骤的流程图见图2。
      操作悬臂梁和盖玻片时，建议使用自锁镊子。
2. 盖玻片的氨基硅烷化（约 1.5 小时）

结果

我们采用所述方法研究了来自 C. thermocellum 的一种I型卷曲蛋白-对接蛋白配对。当卷曲蛋白与对接蛋白成功结合后，记录到的力-距离曲线显示出特征性的峰值模式。图4a展示了一条典型的曲线。曲线中的每个峰值代表一个蛋白质亚结构域的解折叠过程，最后一个峰值对应于受体-配体复合物的解离。

对于本研究中所考察的CBM-黏连素-对接素-木聚糖酶复合物，初始的力上升对应于PEG连接分子的拉伸。随后出现的最多三个递减的力谷反映了木聚糖酶结构域的展开。最终的峰值代表黏连素-对接素结合界面的断裂。

所有记录的力-距离曲线均被转换为力-轮廓长度空间。结果得到的能垒位置直方图如图4B所示。数据显示轮廓长度增加了约89 nm。木聚糖酶结构域由378个氨基酸组成，其中260个位于工程化半胱氨酸残基的C端。根据晶体结构，该结构域的折叠长度约为6 nm。进一步假设每个拉伸氨基酸的长度为0.365 nm³⁵，则测得的89 nm增量可明确归因于.......

讨论

为了从单分子力谱实验中获得有意义的数据，实现明确定义且可重复的拉伸几何构型至关重要。本实验所采用的方案可实现蛋白质复合物在特定拉伸几何构型下的位点特异性固定。

本研究中所使用的悬臂梁因其在水中的力灵敏度和高共振频率而被选用。此外，探针尖端曲率半径较小（约10 nm），有利于单分子实验，可降低发生多重相互作用的可能性。然而，悬臂梁臂部尺寸较小（38×16 µm²），在使用光学偏转法²⁹时会增加激光束调节的难度。本实验所用装置中聚焦激光束的直径与悬臂梁的宽度相当，因此获得稳定的总信号可能较为困难。我们已描述过，可通过分析数据曲线中的噪声来校正逆光学杠杆灵敏度，从而部分补偿激光在悬臂梁上的漂移。目前，我们课题组正在研发一种新型原子力显微镜，其具有更短的光路和更小的激光光斑尺寸，以提高数据质量。

为了获得有关断裂事件的可靠信息，必须对大量曲线进行分析。由于单分子力谱测量会受到多种波动的影响，在力-伸展空间内的平均化处理并无助于分析。然而，一旦在轮廓长度空间中对势垒位置直方图进行对齐，便可对其.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷	ABCR GmbH	AB110423
5 kDa NHS-PEG-马来酰亚胺	Rapp Polymer	13 5000-65-35
TCEP 二硫键还原凝胶	Thermo Scientific, Pierce	77712	www.thermoscientific.com/pierce
三(羟甲基)氨基甲烷
BioLever mini 氮化硅悬臂梁探针	Olympus	BL-AC40TS-C2	软批次
XYZ 压电驱动器	Physik Instrumente GmbH
红外 “宽谱” 红外激光器	Superlum
MFP-3D 原子力显微镜控制器	Asylum Research
Igor Pro 6.31	Wavemetrics		数据采集与分析
氯化钠
氯化钙
pH 计
硼酸钠
镊子
盖玻片	Thermo Scientific, Menzel-Gläser		直径 24 mm，厚度 0.5 mm
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