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方法文章

生成淋巴结-脂肪垫嵌合体以研究淋巴结基质细胞来源

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DOI：

10.3791/50952

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2013年12月16日

 , 
1School of Immunity and Infection, IBR-MRC Centre for Immune Regulation, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 2Centre for Cardiovascular Sciences, University of Edinburgh

本文内容

摘要

本文描述了用于研究淋巴结基质细胞来源的淋巴结/脂肪垫嵌合体的构建方法。该方法包括从小鼠新生个体和胚胎中分离淋巴结和脂肪垫组织，构建嵌合型淋巴结-脂肪垫，并将其移植至宿主小鼠肾包膜下。

摘要

基质是淋巴结结构与功能的关键组成部分。然而，目前对其起源、确切的细胞组成以及调控其形成的机制仍知之甚少。淋巴结始终被脂肪组织包裹，我们近期的研究证明了这种关系在淋巴结基质形成过程中的重要性。在淋巴结发育过程中，脂肪细胞前体细胞会迁移进入淋巴结，并在淋巴毒素-β受体激活后关闭脂肪生成程序，转而分化为淋巴样基质细胞（Bénézech et al.14）。基于脂肪组织具有生成淋巴样基质的潜能，本文介绍一种利用淋巴结/脂肪垫嵌合体的方法，可用于追踪淋巴结基质细胞前体的谱系。我们展示了如何分离新生小鼠的淋巴结和EYFP+胚胎期脂肪组织，并构建LN/EYFP+脂肪垫嵌合体。将该嵌合体移植至受体小鼠肾包膜下后，淋巴结可整合局部的脂肪组织前体细胞并完成其发育过程。通过流式细胞术分析经酶消化后的淋巴结，或通过免疫荧光法分析淋巴结冷冻切片，可对嵌合淋巴结中EYFP+脂肪垫来源细胞的后代进行谱系追踪分析。通过使用来自不同基因敲除小鼠模型的脂肪垫，该方法将为研究不同淋巴结基质细胞群体的起源提供一种高效的分析手段。

引言

淋巴结（LNs）是免疫系统的关键器官，位于全身淋巴管网络的战略位置。它们能够过滤抗原和病原体，并为抗原向淋巴细胞呈递以及诱导适应性免疫应答提供场所。构成淋巴结基本结构的基质在这些器官的功能中起核心作用，它协调适应性免疫应答中各类造血细胞的迁移。不同类型的基质细胞为免疫系统造血组分的迁移、定位、存活、增殖和成熟提供必要且特异的信号1-3。成年个体淋巴结的基质细胞可分为三类：血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞和成纤维细胞。这三类细胞各自包含异质性的细胞群体。其中成纤维细胞群体包括纤维状网状细胞（FRC）、滤泡树突状细胞（FDC）、边缘区网状细胞（MRC），以及构成被膜、髓质的成纤维细胞和其他尚未明确鉴定的细胞类型1-5。目前，不同淋巴结基质细胞群体的来源及其成熟机制尚不清楚，且缺乏可用于特定淋巴结基质细胞群体命运图谱分析的特异性标记物，使得对这些细胞的研究尤为困难。然而，全面理解淋巴结基质细胞的发育起源，对于阐明适应性免疫应答机制、免疫耐受的形成机制，以及人工淋巴结的构建均具有基础性意义。

迄今为止，对淋巴结基质细胞起源和发育的研究主要局限于在野生型小鼠和不同基因敲除小鼠品系中直接评估胚胎期和新生期淋巴结的发育情况6-9。这些方法受到某些与淋巴结发育相关基因缺失小鼠品系在胚胎期或围产期致死的限制。此外，一些对淋巴组织发育至关重要的基因还参与多种生物学过程，例如 RANK10-11 或 NF-κB212。为解决这些问题，已有研究将胚胎期淋巴结分离后移植至宿主小鼠肾包膜下12-13。该技术可实现将基因修饰的胚胎淋巴结移植到野生型环境中，从而评估器官发育以及宿主细胞的招募与组织化过程。然而，移植于成年宿主肾包膜下的胚胎淋巴结生长受限，因而限制了该技术的应用。

淋巴结与脂肪沉积物在解剖学上密切相关，并在胚胎发育过程中同时形成。我们近期的研究表明，淋巴结与脂肪组织的关联在为淋巴结提供基质细胞前体方面发挥着关键作用。特别是，通过LTβR的信号传导可调控脂肪细胞前体细胞的命运，抑制脂肪生成，转而促进其向淋巴结基质细胞表型的成熟14。本文描述了一种基于生成淋巴结-脂肪垫嵌合体的方法，可用于追踪发育中淋巴结内源自脂肪组织的细胞。该方法有助于确定脂肪组织对不同淋巴结基质细胞群体的贡献，结合使用遗传修饰小鼠品系的组织，将有助于更深入理解调控各类淋巴结基质细胞亚群分化的分子机制。

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方案

小鼠在英国伯明翰大学生物医学服务部门的SPF条件下进行繁育和饲养，遵循英国内政部及当地伦理委员会的规定。本方案中所述的所有操作均包含在经当地伦理委员会和内政部批准的项目许可证范围内。

1. 新生小鼠淋巴结的分离

  1. 通过颈椎脱位法处死新生小鼠。
  2. 切开头部，并用剪刀从胸腔顶部至腹腔底部剪开体腔，小心移除腹腔内所有内脏（心脏、肺、肝脏、肠道、肾脏、膀胱）。
  3. 将尸体转移至含有RF10培养基（RPMI1640培养基添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素和2 mM L-谷氨酰胺）的90 mm培养皿中。从这一步开始，组织需保持无菌条件，并在组织培养超净台中操作。
  4. 将尸体转移至另一个含有RF10培养基的90 mm培养皿中。
  5. 在解剖显微镜下，小心将腹股沟区域的皮肤与腹膜分离。腹股沟淋巴结位于脂肪垫中三条血管的交汇处。
  6. 小心取出淋巴结，确保彻底去除所有脂肪组织。将淋巴结转移至含有RF10培养基的50 mm培养皿中。继续操作过程中，将组织保持在冰上。

2. E18.5 脂肪垫的分离

  1. 为获得妊娠第18.5天（E18.5）的小鼠胚胎，将雌鼠和雄鼠按每笼一对进行夜间合笼以建立定时妊娠。次日早晨将小鼠分开，并检查阴道栓（妊娠第E0.5天）。
    1. 通过颈椎脱位法处死带有阴道栓的雌鼠，处死时间为妊娠第18.5天。
    2. 取出胚胎并将其置于含有RF10培养基的90 mm培养皿中。
  2. 从本步骤开始，所有组织操作均须在组织培养超净台中采用无菌技术进行。在解剖显微镜下，切下头部，用剪刀从胸部区域向下沿腹部区域剪开体腔，并小心地从体腔中移除所有内脏组织（心脏、肺、肝脏、肠道、肾脏、膀胱）。
  3. 清除体腔内残留的所有内脏组织，并用PBS洗涤以彻底去除可能影响解剖操作的血液痕迹。
  4. 将清洁后的躯体转移至一个新的含有RF10培养基的90 mm培养皿中。
  5. 在腹股沟区域小心地将腹膜从皮肤上分离。腹股沟淋巴结位于脂肪垫中三条血管的交汇处。
  6. 小心取出淋巴结并弃去。彻底清除淋巴结至关重要，以确保用于嵌合体实验的脂肪垫不会被任何淋巴样基质细胞污染。
  7. 取出腹股沟脂肪垫并转移至含有RF10培养基的50 mm培养皿中。在继续后续操作期间，将组织置于冰上保存。

3. 淋巴结-脂肪垫嵌合体的构建

  1. 准备 体外 器官培养系统15.
    1. 海绵与滤器的准备：可提前进行，将海绵和滤器无菌存放于培养皿中，并置于超净台内保存。
      1. 将Vulkan衬垫剪成1-1.5厘米2 碎片
      2. 将海绵在蒸馏水中煮沸2小时。
      3. 在细胞培养超净台中让海绵干燥数小时。
      4. 将滤膜煮沸 20 分钟。
      5. 在细胞培养罩中让滤膜干燥数小时。
    2. 配制添加10%胎牛血清、10 mM HEPES、1x 青霉素-链霉素的DMEM培养基 MEM 非必需氨基酸溶液，50 mM 2-巯基乙醇，100 U/ml 青霉素，100 mg/ml 链霉素，2 mM L-谷氨酰胺。
    3. 在50 mm的培养皿中加入2 ml培养基。
    4. 在培养皿底部放置一块海绵。将海绵的两面浸入培养基中，使其充分湿润。
    5. 将一个滤膜置于海绵上方，滤膜位于液体-空气界面处。
  2. 在解剖显微镜下，将一个新生淋巴结小心地与一个胚胎脂肪垫重新结合。
  3. 将LN-脂肪垫嵌合体置于滤膜上方。
  4. 将培养皿转移至一个矩形塑料盒中，盒盖上带有若干小孔，盒底盛有水以维持湿度。
  5. 用胶带将盒盖封好，保留盖上的两个孔洞敞开。
  6. 将盒子转移至37 °C、含5% CO₂的细胞培养孵育箱中2让盒子平衡2小时，然后用胶带封住盖子上的孔。
  7. 将组织孵育至少2天，以使淋巴结附着于脂肪垫，并可转移至肾包膜下。

4. 将淋巴结-脂肪垫嵌合体移植至受体小鼠肾包膜下

  1. 从滤器中收集淋巴结-脂肪垫嵌合体，并将其移植至宿主小鼠的肾包膜下。肾包膜下移植方法已有文献描述16。

5. 转移淋巴结的分离

  1. 在肾包膜下移植3-4周后，淋巴结-脂肪垫嵌合体已准备就绪，可以进行收获。按照批准的指导方案对宿主小鼠实施安乐死。
  2. 从小鼠体内取出肾脏。
  3. 在解剖显微镜下，分离淋巴结-脂肪垫嵌合体，并解剖出淋巴结。

6. 用于流式细胞术分析的移植淋巴结的酶消化

  1. 用小剪刀在淋巴结上做一个切口，以便酶液渗透器官并促进消化。
  2. 将一个淋巴结放入含有 600 μl 消化缓冲液（RPMI 1% FCS、2.5 mg/ml Collagenase D、100 μg/ml DNase I）的 1.5 ml 离心管中。
  3. 在 37 °C 振荡温控仪中孵育 30 分钟。每 10 分钟用移液器吹打数次，以帮助组织解离。
  4. 向管中加入 6 μl 0.5 M EDTA，并用移液器吹打以完成组织的解离。
  5. 在 490 × g 条件下离心 5 分钟。
  6. 用染色溶液（PBS、0.1% BSA、5% 大鼠血清和 5% 小鼠血清）重悬细胞沉淀，并加入一抗混合物。
  7. 冰上孵育 30 分钟。
  8. 用 PBS 洗涤两次。
  9. 如需要，加入二抗孵育 20 分钟。
  10. 用 PBS 洗涤两次。
  11. 上流式细胞仪分析。

7. 通过免疫荧光分析转移的淋巴结

  1. 在冷冻及冷冻切片过程中固定以保存EYFP：将淋巴结（LN）置于含PBS、4%多聚甲醛（PFA）和10%蔗糖的溶液中，固定3-4小时。
  2. 在一小片铝箔上滴加少量低温O.C.T.包埋剂，避免产生气泡。将淋巴结（LN）小心地置于液滴中央，确保无液体残留。
  3. 将铝箔置于干冰上，使组织快速冷冻。
  4. 使用冷冻切片机将组织切成8-10 μm的切片，并贴附于带正电荷的载玻片上。切片在-20 °C保存前，需室温干燥2小时。
  5. 染色步骤可根据所用一抗进行调整，以下为通用染色流程：使用含PBS、1% BSA的染色液，加入适当组合的一抗进行孵育。
  6. 在湿盒中室温孵育1小时。
  7. 用PBS洗涤两次，每次5分钟。
  8. 加入二抗，室温孵育1小时。
  9. 用PBS洗涤两次，每次5分钟。
  10. 使用含DAPI的封片剂封片。
  11. 使用荧光显微镜或共聚焦显微镜采集图像。

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结果

移植后三周，从肾脏处回收淋巴结/脂肪垫嵌合体。此时嵌合体已非常类似于位于自身脂肪垫中的正常淋巴结，且淋巴结可见于脂肪组织的中央（图1）。若无法识别淋巴结，可能是移植至肾脏过程中丢失所致。在评估可能对淋巴结发育具有重要作用的基因功能时，所回收的淋巴结可能仍然非常微小，难以发现。当使用LTβR-/-小鼠的脂肪组织与新生淋巴结重新联合时，即出现此种情况14。

仔细分离淋巴结（LN）可进一步分析EYFP+脂肪来源细胞的后代。对淋巴结进行冰冻切片和免疫荧光分析显示，EYFP+脂肪来源细胞迁移至淋巴结内，并参与构成Gp38+ERTR-7+淋巴结基质细胞网络（图2A）。流式细胞术分析证实，淋巴结基质细胞中有相当一部分来源于局部的EYFP+脂肪组织前体细胞，其贡献了CD45-Gp38+CD31-成纤维细胞亚群的30...

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讨论

本文介绍了一种检测和量化脂肪组织前体细胞对发育中淋巴结贡献的方法，以及两种可用于分析其子代细胞的技术。胚胎期脂肪垫和新生小鼠淋巴结的分离操作较为精细，需要经过大量实践以掌握必要的手工技巧，方可进行实际的淋巴结-脂肪垫嵌合体制备。为控制分离操作的质量，可对脂肪垫和淋巴结进行流式细胞术分析。胚胎脂肪垫制备物中应不含淋巴结，且不应含有任何CD45+CD4+IL-7Ra+淋巴组织诱导细胞。新生小鼠淋巴结制备物应完全不含脂肪组织，并含有高比例的CD45-CD31-ICAM-1highVCAM-1high淋巴组织组织细胞6,13-14。组织培养和手术操作应遵循标准的无菌技术，以降低污染风险。

LTβR 与不成熟的淋巴结基质细胞结合可诱导其分化为完全成熟的淋巴结基质细胞。利用这一 体内 系统，我们先前已证明，来源于缺乏 LTβR 的小鼠的脂肪垫无法支持淋巴结的生长。因此，该技术可用于检测来源于不同基因...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢伯明翰大学生物医学服务部门工作人员对我们的动物种群的悉心照料。本工作由欧盟第七框架计划（FP7）综合项目INFLACARE资助，资助编号为JC。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇SigmaM3148
50 mm Sterilin 培养皿Appleton WoodsSC265
90 mm Sterilin 培养皿Appleton WoodsSC260
粘附载玻片Surgipath00202
抗小鼠 CD31 eFluor 450eBioscience48-0311
抗小鼠 CD4 Alexa 647eBioscience51-0041
抗小鼠 CD45 PerCP-Cy5.5eBioscience45-0451
抗小鼠 IgM 罗丹明红Stratech715-296-020-JIR
抗小鼠 Podoplanin PE/Cy7Biolegend127411
抗小鼠 Podoplanin 纯化抗体eBioscience14-5381
胶原酶 DRoche11088858001
DMEM 培养基SigmaD5671
DNase ISigmaDN25-1G
Dumont #5 镊子 Inox BiologieFST11252-20用于胚胎和新生动物解剖的超细镊子
EDTA 溶液 0.5 MSigmaE7889
ERTR-7Biogenesis
胎牛血清SigmaF9665
硬化精细直头虹膜剪刀 11 cmFST14090-11用于解剖的小型剪刀
HEPES 溶液SigmaH0887
Isopore 膜滤器 0.8 μm ATTPMilliporeATTPO 1300
L-谷氨酰胺溶液SigmaG7513
MEM 非必需氨基酸溶液 (100x)SigmaM7145
O.C.T. 包埋剂Tissue-Tek4583
青霉素-链霉素SigmaP4458
带盖塑料盒Watkins and DoncasterE6052用于 体外 器官培养的三明治盒。在盖子上钻两个孔，以便在 CO2 培养箱中进行气体交换。
RPMI 1640 培养基SigmaR0883
Vulkan Underwrap 海绵Patterson Medical004383
体视显微镜LeicaLEICA MZ95带变焦功能的解剖显微镜
恒温混匀仪Eppendorf5436
含 DAPI 的 Vectashield 封片剂Vector LaboratoriesH-1200

参考文献

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  16. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J. Vis. Exp. (9), e404(2007).
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