淋巴结脂肪垫对嵌合体的淋巴结基质细胞起源研究的一代

摘要

描述了用于研究淋巴结基质细胞起源的淋巴结/脂肪垫嵌合体的产生。该方法涉及从新生小鼠和胚胎脂肪垫中分离淋巴结，产生嵌合淋巴结脂肪垫，以及将它们转移到宿主小鼠的肾包膜下。

摘要

基质是淋巴结结构和功能的关键组成部分。然而，人们对它的起源、确切的细胞组成和控制其形成的机制知之甚少。淋巴结总是被包裹在脂肪组织中，我们最近证明了这种关系对淋巴结基质形成的重要性。脂肪细胞前体细胞在其发育过程中迁移到淋巴结中，并且在与淋巴毒素 b 受体结合时关闭脂肪生成并分化为淋巴基质细胞（Bénézech 等人。^基于脂肪组织的淋巴基质电位，我们提出了一种使用淋巴结/脂肪垫嵌合体的方法，该方法允许对淋巴结基质细胞前体进行谱系追踪。我们展示了如何分离新生儿淋巴结和 EYFP⁺ 胚胎脂肪组织并制作 LN/EYFP⁺ 脂肪垫嵌合体。在宿主小鼠的肾包膜下转移后，淋巴结掺入局部脂肪组织前体细胞并完成其形成。所得淋巴结中 EYFP⁺ 脂肪垫细胞的后代分析可以通过酶消化淋巴结的流式细胞术分析或淋巴结冷冻切片的免疫荧光分析来进行。通过使用来自不同敲除小鼠模型的脂肪垫，该方法将提供一种分析不同淋巴结基质细胞群来源的有效方法。

引言

淋巴结 （LN） 是免疫系统的关键器官，位于身体沿淋巴管系统网络的战略部位。它们能够过滤抗原和病原体，并为抗原呈递到淋巴细胞和诱导适应性免疫反应提供位点。基质形成 LN 的基本结构并协调适应性免疫反应的不同造血参与者的运动，是这些器官功能的核心。不同的基质细胞群为免疫系统造血成分的运动、定位、存活、增殖和成熟提供重要和特异性的线索^1-3。成体 LN 基质细胞分为三类：血液内皮细胞、淋巴内皮细胞和成纤维细胞。这三个类别包括异质人群。成纤维细胞群包含成纤维细胞网状细胞 （FRC）、滤泡树突状细胞 （FDC）、边缘网状细胞 （MRC），而形成包膜的成纤维细胞、髓质和其他尚未鉴定的细胞^1-5。控制不同 LN 基质细胞群成熟的起源和机制尚不清楚，并且缺乏允许特定 LN 基质细胞群命运图谱的特异性标记使他们的研究变得特别困难。然而，充分了解 LN 基质细胞的个体发育对于理解适应性免疫反应、导致耐受性的机制是必要的，并且是人工 LN 开发的基础。

到目前为止，LN 基质细胞起源和发育的研究主要限于直接评估野生型小鼠和不同敲除小鼠品系^6-9 中胚胎和新生儿中 LN 发育的直接评估。这些方法受到一些小鼠品系的胚胎和围产期致死性的限制，这些菌株携带对 LN 发育很重要的基因缺失。此外，一些对淋巴组织发育至关重要的基因也参与广泛的生物过程，如 RANK^10-11 或 NF-κB2¹²。为了解决这些问题，在宿主小鼠的肾包膜下进行了胚胎 LN 的分离和移植^12-13。例如，该技术允许在野生型环境中转移转基因胚胎 LNs，以评估器官发育以及宿主细胞的募集和组织。然而，在成年宿主的肾包膜下移植的胚胎 LN 的生长受损，从而限制了该技术的使用。

LN 和脂肪沉积在解剖学上密切相关，它们在胚胎发生过程中同时发育。我们最近证明，LN/脂肪组织关联在 LN 提供基质细胞祖细胞中起着至关重要的作用。特别是，通过 LTβR 的信号转导通过阻断脂肪生成并促进向 LN 基质细胞表型的成熟来控制脂肪细胞前体细胞的命运¹⁴。在这里，我们描述了一种基于生成 LN 脂肪垫嵌合体的方法，该方法允许在发育中的 LN 中追踪脂肪组织衍生的细胞。该方法将有助于确定脂肪组织对不同 LN 基质细胞群的贡献，并结合使用来自转基因小鼠品系的组织，可以更好地了解控制不同 LN 基质细胞亚群分化的机制。

方案

小鼠是根据英国内政部和当地伦理委员会的规定，在伯明翰大学生物医学服务单位的 SPF 条件下饲养和维持的。本协议中描述的所有程序均包含在当地道德委员会和内政部批准的项目许可证中。

1. 新生儿 LN 的分离

1. 通过颈椎脱位处死新生小鼠。
2. 将头部切开，用剪刀从胸部区域的顶部打开身体到腹部区域的底部，然后小心地从腹腔中取出所有内脏（心脏、肺、肝、肠、肾、膀胱）。
3. 将身体转移到含有 RF10 培养基的 90 mm 培养皿中（RPMI1640培养基补充有 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺）。从这一步开始，组织将保存在无菌条件下，并在组织培养罩中处理。
4. 将身体转移到含有 RF10 的新 90 mm 培养皿中。
5. 在解剖显微镜下，小心地从腹股沟区域的皮肤上分离腹膜。腹股沟 LN 位于脂肪垫中三条血管的交界处。
6. 小心地卸下 LN。确保去除所有脂肪组织。将 LN 转移到含有 RF10 培养基的 50 mm 培养皿中。在继续该过程的同时，将纸巾放在冰上。

2. E18.5 脂肪垫的分离

1. 为了在妊娠第 18.5 天 （E18.5） 产生小鼠胚胎，通过在每个笼子中放置一只雌性和一只雄性小鼠过夜来设置定时怀孕。早上将小鼠分开并检查阴道栓（妊娠第 E0.5 天）。
   1. 在怀孕第 18.5 天通过宫颈脱位对堵塞的雌性实施安乐死。
   2. 取出胚胎并将它们放入含有 RF10 的 90 mm 培养皿中。
2. 从此步骤开始，应在组织培养罩中使用无菌技术处理组织。在解剖显微镜下，切开头部，用剪刀从胸部区域到腹部底部打开胚胎，小心地从体腔中取出所有内脏（心脏、肺、肝脏、肠、肾脏、膀胱）。
3. 清洁身体上所有剩余的内脏组织，并在 PBS 中清洗，以消除所有可能使解剖更加困难的血迹。
4. 将干净的身体转移到含有 RF10 的新鲜 90 mm 培养皿中。
小心地从
5. 腹股沟区域的皮肤上分离腹膜。腹股沟 LN 位于脂肪垫中三条血管的交界处。
6. 小心地取出 LN 并将其丢弃。完全去除 LN 以确保用于嵌合体的脂肪垫不被任何淋巴基质细胞污染非常重要。
7. 取出腹股沟脂肪垫并将其转移到含有 RF10 培养基的 50 毫米培养皿中。在继续该过程的同时，将纸巾放在冰上。

3. LN-fat Pad Chimera 的生成

1. 准备体外器官培养系统¹⁵.
   1. 海绵和过滤器的制备：这可以提前完成，海绵和过滤器无菌储存在培养罩中的培养皿中。
      1. 将 Vulkan Underwrap 切成 1-1.5 厘米² 块
      2. 将海绵在蒸馏水中煮沸 2 小时。
      3. 让海绵在细胞培养罩中干燥几个小时。
      4. 将过滤器煮沸 20 分钟。
      5. 让过滤器在细胞培养罩中干燥几个小时。
   2. 制备补充有 10% 胎牛血清、10 mM HEPES、1x MEM 非必需氨基酸溶液、50 mM 2-巯基乙醇、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺的 DMEM 培养基。
   3. 在 50 mm 培养皿中加入 2 ml 培养基。
   在
   4. 培养皿的底部放置一块海绵。将海绵的两侧浸入介质中，弄湿海绵的两侧。
   5. 在海绵顶部放置一个过滤器。过滤器位于液-气界面处。
2. 在解剖显微镜下，小心地将一个新生儿 LN 与一个胚胎脂肪垫重新关联。
3. 将 LN-fat pad 嵌合体放在过滤器顶部。
4. 将培养皿转移到一个矩形塑料盒中，盖子上有几个孔，底部装有水以确保湿度。
5. 用胶带将盖子密封到盒子上。将盖子上的两个孔打开。
6. 将盒子转移到 37 °C 和 5% CO₂ 的细胞培养箱中。让盒子平衡 2 小时，然后用胶带密封盖子上的孔。
7. 将组织孵育至少 2 天，以使 LN 附着在脂肪垫上并可在肾包膜下转移。

4. LN 脂肪垫嵌合体在宿主小鼠肾胶囊下的转移

1. 从过滤器中收集 LN 脂肪垫嵌合体，并将它们转移到宿主小鼠的肾胶囊下。肾包膜转移法已经描述过 ¹⁶.

5. 已转移 LN 的隔离

1. 在肾胶囊下放置 3-4 周后，LN 脂肪垫嵌合体就可以收获了。使用批准的指南对宿主小鼠实施安乐死。
2. 从宿主小鼠中取出肾脏。
3. 在解剖显微镜下，分离 LN 脂肪垫嵌合体并解剖出 LN。

6. 用于流式细胞术分析的转移 LN 的酶消化

1. 用小剪刀在 LN 上切开一个切口，让酶渗透到器官并促进消化。
2. 将一个 LN 放入含有 600 μl 消化缓冲液（RPMI 1% FCS、2.5 mg/ml 胶原酶 D、100 μg/ml DNase I）的 1.5 ml Eppendorf 中。
3. 在 37 °C 下在搅拌热块上孵育 30 分钟。每 10 分钟上下移液以帮助组织解离。
4. 向试管中加入 6 μl EDTA 0.5 M，并上下移液以完成组织的解离。
5. 以 490 x g 离心 5 分钟。
将
6. 细胞沉淀重悬于含有一抗组合的染色溶液（PBS、0.1% BSA、5% 大鼠血清和 5% 小鼠血清）中。
7. 在冰上孵育 30 分钟。
8. 在 PBS 中洗涤两次
9. 如果需要，与二抗孵育 20 分钟。
10. 在 PBS 中洗涤 2 次。
11. 在流式细胞仪上分析。

7. 免疫荧光分析转移的 LN

1. 在冷冻和冷冻切片过程中固定以保存 EYFP：将 LN 置于 PBS、4% PFA 和 10% 蔗糖的溶液中，放置 3-4 小时。
2. 将一小滴冷的 O.C.T. 化合物滴在一小块铝箔上。避免气泡。小心地将不含任何液体的 LN 放在液滴中间。
3. 将铝箔放在干冰上冷冻器官。
4. 使用低温恒温器将 8-10 μm 切片切割到额外的粘合剂载玻片上。让玻片干燥 2 小时，然后在 -20 °C 下储存。
5. 染色程序可能因使用的一抗而异，并且可以根据以下方案进行优化。用含有一抗组合的染色溶液（PBS，1% BSA）对切片进行染色。
6. 在加湿室中室温孵育 1 小时。
7. 在 PBS 中洗涤两次，每次 5 分钟
8. 与二抗孵育 1 小时。
9. 在 PBS 中洗涤两次，每次 5 分钟。
10. 将玻片安装在含有 DAPI 的封固剂中。
11. 使用荧光或共聚焦显微镜捕获图像。

结果

移植后 3 周，从肾脏中恢复 LN/脂肪垫嵌合体。嵌合体现在与自身脂肪垫中的正常 LN 非常相似，并且在脂肪组织的中心可以看到 LN（图 1）。如果无法识别 LN，则可能是在肾脏移植过程中丢失的。在评估在 LN 发育中可能重要的基因的作用时，回收的 LN 可能仍然非常小且更难找到。当来自 LTβR^-/-小鼠的脂肪组织与新生 LNs 重新关联时，就会出现这种情况¹⁴。

仔细分离 LN 可以进一步分析 EYFP⁺ 脂肪衍生细胞的后代。LN 的冷冻切片和免疫荧光分析显示，EYFP⁺ 脂肪衍生细胞迁移到 LN 中，在那里它们有助于 Gp38⁺ERTR-7⁺ LN 基质细胞网络（图 2A）。流式细胞术分析证实，LN 基质细胞的重要部分来源于局部 EYFP⁺脂肪组织祖细胞，占 CD45-Gp38⁺CD31^-成纤维细胞部分的 30% ...

讨论

在本文中，我们提出了一种测定和量化脂肪组织祖细胞对发育中的 LN 的贡献的方法，以及两种允许分析其后代的技术。胚胎脂肪垫和新生儿 LN 的解剖非常微妙，需要在生成实际的 LN 脂肪垫嵌合体之前通过大量练习获得的手动技能。为了控制解剖的质量，可以对脂肪垫和LN进行流式细胞术分析。 胚胎脂肪垫制备应不含淋巴结，且不应含有任何CD45⁺CD4⁺IL-7Ra⁺淋巴组织诱导细胞。新生儿LN制剂应完全不含脂肪组织，并含有高比例的CD45-CD31-ICAM-1高VCAM-1高淋巴组织组织细胞^6,13-14。应遵循组织培养和手术的标准无菌技术，以降低污染风险。

LTβR 与未成熟 LN 基质细胞的结合诱导它们分化为完全成熟的 LN 基质细胞。使用这种 体内 系统，我们之前证明，源自缺乏LTβR的小鼠的脂肪垫无法维持LN的生长。 因此，该技术可以与源自不同敲除小鼠模型的脂肪垫一起使用，以评估不同LN基质...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Sigma	M3148
50 mm 灭菌培养皿	Appleton Woods	SC265
90 mm 灭菌培养皿	Appleton Woods	SC260
载玻片	Surgipath	00202
抗小鼠 CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
抗小鼠 CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
抗小鼠 CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
抗小鼠 IgM 罗丹明 Red	Stratech	715-296-020-JIR
抗小鼠鬼臼素 PE/Cy7	Biolegend	127411
抗小鼠鬼臼素纯化	eBioscience	14-5381
胶原酶 D	罗氏
DMEM 培养基	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont #5 镊子 Inox Biologie	FST	11252-20	用于胚胎和新生儿解剖的超细镊子
EDTA 溶液 0.5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogenesis
胎牛血清	Sigma	F9665
硬化细虹膜剪刀直 11 厘米	FST	14090-11	用于解剖
HEPES 溶液	Sigma	H0887
等孔膜过滤器 0.8 μm ATTP	Millipore	ATTPO 1300
L-谷氨酰胺溶液	Sigma	G7513
MEM 非必需氨基酸溶液 （100x）	Sigma	M7145
OCT 化合物	组织-Tek	4583
青霉素-链霉素	Sigma	P4458
带盖塑料盒	Watkins 和 Doncaster	E6052	用于 体外器官培养的夹心盒。在盖子上钻两个孔，以便在 CO2 培养箱中进行气体交换。
RPMI 1640 培养基	Sigma	R0883
海绵 Vulkan Underwrap	Patterson 医用	004383
立体显微镜	Leica	LEICA MZ95	变焦解剖显微镜
Eppendorf	5436
Vectashield 封固剂与 DAPI	Vector Laboratories	H-1200