一种评估实验大鼠味觉物质强化特性的新方法：操作性经口内自我给药

摘要

本研究评估了一种用于检测可口溶液对实验大鼠强化效应的新方法：口腔内自我给药。为此，在连续比率和递增比率强化程序下，测量了大鼠对不同浓度甜溶液进行口腔内输注的操作式反应（即 按压杠杆）行为。

摘要

本文介绍了一种研究食物成瘾生物行为基础的新方法。该方法结合了味觉反应性的手术组分与药物操作式自我给药的行为学特征。在短暂的全身麻醉下，大鼠被植入一口内（IO）导管，使测试溶液可直接递送至口腔内。随后，动物被置于操作式自我给药装置中，通过按压杠杆以获得经口内导管输注的测试溶液。相较于通过饮水嘴摄取溶液的实验程序，口内自我给药具有多项优势。 或通过操作反应获取递送至 receptacle 中的固体颗粒或溶液。本文中，我们展示了尾侧孤束核（IO）自我给药模型可用于研究高果糖玉米糖浆（HFCS）的自我摄取行为。大鼠首先在递增比率（PR）程序下进行自我给药测试，该程序用于评估动物为获取不同浓度 HFCS 所能付出的最大操作行为量（即 8%、25% 和 50%）。在此测试之后，大鼠在持续性强化程序下自行给予这些浓度的物质即 每次压杆给予一次灌注），连续10天（每天1次，每次持续3小时），随后在PR程序下重新测试。在连续强化程序中，大鼠对较高浓度的溶液摄入次数较少，但最低浓度的高果糖玉米糖浆（8%）维持了更为多变的自我给药行为。此外，PR测试显示，8%浓度的强化价值低于25%和50%浓度。这些结果表明，颅内自我给药可用于研究对甜味溶液摄取行为的获得与维持。操作式反应对浓度差异及强化程序变化的敏感性，使颅内自我给药成为研究甜食自主摄入神经生物学机制的理想方法。

引言

对食物成瘾的神经生物学和行为基础的研究依赖于以下观察结果：与滥用药物类似，过度摄入美味食物在人类^5-6和实验动物^7-8中均可促进行为依赖^1-4，并引起大脑奖赏回路的改变。然而，尽管已有多种用于研究实验大鼠对滥用药物成瘾特性的方案和操作程序，将这些方法应用于评估食物所诱导的"成瘾性"行为时仍面临独特的挑战。本研究的目的是将操作性静脉（IV）药物自我给药的原理应用于通过口腔内（IO）输注递送甜溶液的操作性自我给药研究。所使用的甜味剂为高果糖玉米糖浆（HFCS），因为尽管存在争议，已有证据表明HFCS可能与现代肥胖流行病相关^9-12。

传统上，通过颅内静脉（IO）输注来研究味觉反应实验中呈味物质的适口性¹³。简而言之，将一根IO导管外科植入大鼠的面颊部位，并被动地输注各种溶液¹⁴。其目的是研究动物对这些呈味物质所产生的口面部反应。然而，IO导管也已被长期植入大鼠的腭部，以确定它们是否能够学会按压杠杆以实现将溶液自行注入口腔内的自我输注，因此被称为IO自我注射^15-17。在本研究中，我们描述了一种利用微创手术 并允许进行长期操作式自我给药测试的技术方法。该方法相较于传统的实验方式具有多项显著优势，传统方法包括：从饮水口舔食溶液（a）、对固体颗粒进行操作式反应（b），或对容器中滴加的液体进行操作式反应（c）。

与（a）相比，IO 自我给药涉及一种操作性反应（即 按压杠杆）因此可以调整调节反应需求与静脉输注给药之间关系的时间表。例如，采用递增比率（PR）时间表，使每次连续输注所需反应次数在单次实验过程中呈指数级增加¹⁸，可以评估动物的活动量 "想要" 下一次输注¹⁹这一重要方面 "寻找" 除非使用能够控制液体输送并监测反应的特殊装置，否则无法评估动物从出液口饮水时的行为²⁰此外，骨内自我给药为比较由不同强化刺激所驱动的行为提供了一种手段。也就是说，可以在所谓的操作性条件反射范式中，比较由甜食和其他强化物（如滥用药物）维持的反应行为。 "取代研究。"

与（b）相比，口内自我给药（IO self-administration）可对任何浓度和体积的水溶性食品添加剂进行测试。这对于研究由甜味物质（如高果糖玉米糖浆，HFCS）驱动的行为尤为重要，因为据我们所知，目前尚无 commercially available 的果糖固体颗粒，或不同比例的果糖-葡萄糖混合物颗粒适用于操作性行为实验箱。此外，在摄入量可能同时受到溶液热量值（导致营养特异性饱腹感）以及在特定时间内可摄入溶液量影响的实验中，精确控制和调节浓度/体积比至关重要。即 饱腹感²¹. IO 自我给药还缩短了操作反应与主要强化物递送之间的时间延迟，这一因素在操作性行为的习得与维持中起着重要作用^16,22-23.

最后，与（c）相比，骨内自给药（IO self-administration）能够输送可控量的测试溶液进行被动骨内输注，从而可以测量口面部反应 "喜爱" 客观享乐反应，例如舌头伸缩动作^24-25）以及这些反应在静脉内自我给药过程中是否发生变化。此外，实施被动静脉输注的能力对于研究觅食行为的复吸具有重要意义。也就是说，在静脉药物自我给药研究中，在经历消退期后，给予药物启动（drug primes）即 给予小剂量药物²⁶）可以 "恢复" 响应^27-28因此，能够在不需动物主动参与的情况下进行骨内输注，可用于研究 "食物" 引发复吸，以及食物与滥用药物之间潜在的交叉复吸。

与静脉注射和胃内自我给药相比，口服自我给药甜溶液更为可取。事实上，尽管在人类和实验动物中，静脉输注果糖所产生的生理效应与口服摄入后观察到的结果相似^29-31，但这并不能很好地模拟甜食通常的摄入方式（即 经口摄入）。此外，咀嚼过程中产生的味觉信号能够提供有关食物可口性的重要信息，而当消化过程的这一阶段被跳过时，暴食等适应不良行为的发生会减少^32-33。

方案

1. 动物护理与饲养

所有实验均经圭尔夫大学动物护理委员会批准，并遵循加拿大动物护理委员会的建议进行。本研究共纳入22只成年雄性Sprague-Dawley大鼠（Charles River，魁北克省），实验开始时体重为200-225 g。

1. 单笼饲养大鼠，并将其置于逆转的明暗循环环境中（上午7:00关灯 - 晚上7:00开灯），自由获取食物和水，除非另有说明，或在活跃周期内进行行为学测试时除外。
2. 在手术前一周，通过每天称重使大鼠适应动物房环境及人为操作。

2. 口内插管手术：材料与操作步骤

口内（IO）手术及所用材料详见于Limebeer 等¹⁴

1. 制备骨内输液导管时，将一段聚乙烯塑料管剪切成约130 mm长（内径0.86 mm，外径1.27 mm）。
2. 需固定在口腔内的导管末端应具有一个带法兰的端部（直径约5 mm）。通过电烙铁加热导管末端2-5秒，随后立即将加热的管端在平整表面上压平，以形成该法兰端。剪取一片外科网状膜圆片（直径约6-7 mm，以适配导管法兰端的直径），将其穿入导管并沿管身滑动，直至圆片紧贴骨内输液导管法兰端的背面。
3. 为每根骨内输液导管另准备一片直径为8 mm的外科网状膜圆片，以及三块6 mm × 6 mm的弹性绷带方片（见图1）。
4. 手术前至少24小时，将骨内输液导管、外科网状膜圆片和弹性绷带方片置于抗菌溶液中进行灭菌处理。
5. 手术前，对所有手术器械进行高压蒸汽灭菌，并对术区进行消毒。每次手术之间，使用玻璃珠灭菌器对器械进行灭菌，并佩戴发网、丁腈手套和外科口罩，以维持无菌操作环境。

镇痛与麻醉

6. 手术前约30分钟，皮下注射抗生素Depocillin（0.33 mg/kg）和镇痛药美洛昔康（Meloxicam，5 mg/kg SC）。
7. 使用异氟烷（Isoflurane）诱导全身麻醉（诱导浓度4%，维持浓度3%）。
8. 当大鼠对脚趾夹捏无反应后，在进行任何切口之前，使用棉签将局部麻醉剂涂抹于左侧颊内侧待植入套管的部位，并在活检针切口部位（颈部基部）和颅顶帽部位（头皮）注射利多卡因盐酸盐（lidocaine HCl）等局部麻醉剂。
9. 手术开始前，向双眼涂抹润滑性眼膏。

手术操作

10. 在颈部基部剃除一块 10 mm × 10 mm 的毛发区域。使用无菌纱布按以下顺序擦拭并清洁剃毛区域：抗菌皂、70%异丙醇和碘伏（Betadine）。
11. 在颈部基部插入一根 15 G 不锈钢针头，并将其在皮下沿耳部向左颊方向移动。定位针头尖端，并将其从口腔内第一磨牙后方穿出至口腔腔内。
12. 将骨内输液套管（IO cannula）从口腔腔内突出的针头尖端穿入，然后拔出针头，仅保留骨内输液套管。
13. 在骨内输液套管外露部分依次穿入一个外科网状垫片和三个方形弹性垫片，并将其拉至颈背部暴露的皮肤处以固定套管。
14. 用抗菌口腔冲洗液冲洗骨内输液套管。
15. 手术开始前，改造一个尼龙螺栓（28 mm 长；4 mm 尖端；8 mm 头部），去除其头部，并沿螺纹长度方向切出一条 2 mm 的凹槽（见图 2）。
16. 沿头部中线剃除一条 10 mm × 20 mm 的毛发带状区域。使用无菌纱布按以下顺序擦拭并清洁剃毛区域：抗菌皂、70%异丙醇和碘伏（Betadine）。
17. 使用外科手术刀沿矢状缝做一条 20 mm 长的切口。使用手钻在缝线两侧各钻 4 个孔，并使用手动螺丝刀将四个珠宝商螺丝固定于颅骨上。
18. 将螺栓置于四个珠宝商螺丝的中心位置，使凹槽朝向动物后部。通过使用牙科水泥构建头帽将螺栓固定于大鼠颅骨上（使用足量牙科水泥覆盖珠宝商螺丝表面）。待牙科水泥干燥后，将动物移出手术区域并终止麻醉。

术后监测与护理

19. 术后立即将大鼠单独饲养在铺有垫料的笼子中，并密切观察24小时。
20. 术后24小时给予第二次美洛昔康镇痛注射，并每天一次用抗菌口腔冲洗液冲洗骨内输液套管，持续三天。

在实验开始前，让大鼠术后恢复3-5天。

3. 静脉内自我给药操作步骤

仪器

在自我给药实验中，使用亚克力操作条件箱，每个操作箱均封闭在一个较大的隔音胶合板箱内。每个操作条件箱内设有一个室内灯（28 V）和两个可伸缩杠杆（活动杠杆和非活动杠杆），分别位于箱体两侧，距箱底8 cm。活动杠杆连接至隔音箱外的输注泵，其上方3 cm处设有一个白光灯（28 W），作为与颅内输注递送配对的刺激光源。非活动杠杆用于控制基线水平的非强化操作行为；按压该杠杆不会产生任何后果，但所有按压次数均会被记录。

食物

1. 在大鼠的饲养笼中提供标准大鼠饲料（3.1 kcal/g）。
2. 使用反渗透水将高果糖玉米糖浆（55% 配方）稀释为三种不同浓度（8% = 0.026 kcal/80 μl 输注；25% = 0.08 kcal/80 μl 输注；50% = 0.17 kcal/80 μl 输注）。选择这些浓度是因为每种浓度所产生的黏度均适合通过实验装置（i.e. 注射器和管路的直径）实现快速（2.5 秒）骨内输注。

食物剥夺

为了促进大鼠获得骨内自我给药行为，同时保证其正常生长发育，大鼠需经历周期性的食物剥夺与正常喂养交替阶段。 随意摄取 可自由获取标准大鼠饲料。

3. 每天19:00称量大鼠体重，并从笼子的食槽中移除饲料。
4. 次日12:00（约18小时后）再次称量大鼠体重，并于13:00开始进行IO自我给药。
5. 于16:00将大鼠放回其饲养笼，随后连续3小时自由摄取饲料（ad libitum）。记录这三小时内大鼠的体重及饲料总消耗量，之后按前述方法恢复食物剥夺处理。

一般性输入/输出自我管理程序

在渐进比率（PR）和连续强化程序下评估大鼠对IO输注高果糖玉米糖浆（HFCS）的操作性反应。大鼠进行IO自我给药实验，直至摄入量稳定，稳定标准定义为：1）在至少连续两个实验阶段中，有效杠杆与无效杠杆的反应次数存在显著差异；2）连续两个实验阶段中每阶段获得的输注次数变异幅度小于20%。每个实验阶段在黑暗周期开始6小时后启动，持续3小时。获得阶段包括连续10次在连续强化程序下的IO自我给药实验，大鼠在获得阶段开始前24小时接受第一次PR测试（PR测试I），并在最后一次获得阶段实验后24小时接受第二次PR测试（PR测试II）。在PR测试中，断点（BP）定义为在有效杠杆上停止反应至少1小时之前最后一次获得的输注¹⁸。

6. 根据实验开始前连续三天的体重对大鼠进行均衡分组，并将大鼠分配至三个不同浓度的高果糖玉米糖浆（HFCS）自我给药组：8%、25% 或 50%。
7. 在下午12:00称量大鼠体重，并将其连同原有笼具从饲养室转移至测试室。为清除可能在IO套管中积聚的食物或垫料，使用配备16 G针头的12 ml注射器，向套管内吹气；针头末端连接一段50 mm长的聚乙烯管（内径1.14 mm，外径1.57 mm）。
8. 在操作箱内，通过由改装的20 G针头（去除塑料接头和斜面针尖）制成的连接杆，将颅内给药套管与Tygon管（内径0.02 mm，外径1.53 mm）相连。将管路的下部（即 靠近动物）固定在螺栓的凹槽内。导管的上部连接至一个旋转连接器，并由弹簧保护。将弹簧的底端连接至安装在大鼠头部的螺栓螺纹上。
9. 让大鼠在操作箱中适应5分钟，然后开始IO自我给药实验。IO自我给药实验开始时，启动室内灯，两个可伸缩杠杆进入箱内，同时活动杠杆上方的光刺激持续照射30秒。
10. 对于PR测试I，采用Richardson和Roberts18描述的PR方案（反应比率递增 = (5e^{（注射次数 × 0.2）}) - 5).
11. 在第1至第10次训练阶段中，采用连续强化程序，即每次按压主动杠杆均会触发一次测试溶液的输注，输注量为80 μl，持续2.5秒。
12. 为确保有充足的摄取时间，在27.5秒的超时期内收回活动压杆并激活刺激灯（即 大鼠每30秒可获得一次骨内给药（IO输注）。在每次骨内自我给药实验过程中，不对可获得的给药次数设置上限。
13. 如果大鼠在连续20分钟内未对活动杠杆作出反应，则对大鼠进行一次触发操作（打开操作箱，辅助大鼠按压活动杠杆一次）。在获取训练的前3天内，每20分钟触发一次，每节训练最多触发5次。
14. 使用步骤3.10中所述参数进行第二次PR测试。
15. 在IO自我给药实验结束后，将大鼠从操作箱中移出，使用3.7节所述相同材料，以2.0 ml水冲洗IO套管，随后将大鼠放回饲养室的原笼中。
16. 孵育3小时后 随意摄取 自由摄取大鼠饲料，在下午7:00称量大鼠体重，移除食槽中的食物，并恢复禁食处理。

采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）对自我给药数据进行分析。使用Student-Newman-Keuls法（α=0.05）进行多重比较，以探究任何显著的交互作用或主效应。

结果

获得IO自我给药

图3展示了大鼠在连续10个会话中自我给药8%、25%或50%高果糖玉米糖浆（HFCS）期间对主动杠杆和非主动杠杆的操作式反应。大鼠在前三个会话内即学会IO自我给药HFCS，并在后续的获得阶段维持稳定的主动杠杆反应（如上所述）。主动杠杆反应中还表现出浓度依赖性差异：与25% HFCS组相比，自我给药50% HFCS的大鼠反应显著降低。所测试的最低浓度（8%）维持中等水平的操作式反应，其特征是摄入量的个体间变异性较高。

渐进比率测试

PR 测试中的主动压杆反应和 BP 分别如图 4和图 5所示。在测试 I 中，所有浓度的 HFCS 均仅引起适度的反应。然而，在测试 II 中，组间差异显现，较高浓度导致更多的反应和更高的 BP。

讨论

本研究展示了一种评估甜味溶液强化特性的新方法，该方法结合了传统上用于研究由滥用药物驱动行为的方法（静脉内操作性自我给药）和评估呈味物质可口性的方法（通过口腔内输注进行味觉反应测试）。为此，在短暂的异氟烷诱导麻醉下，对大鼠植入口腔内导管（IO导管），从而将待测溶液直接递送至其口腔内。手术后恢复期间，将动物置于操作性自我给药实验箱中进行测试，使其可通过按压杠杆以获得待测溶液的口腔内输注。

通过我们建立的颅内给药自我摄取实验方法，我们发现：1）大鼠能够习得并维持对不同浓度高果糖玉米糖浆（HFCS）的颅内自我摄取行为；2）大鼠会根据HFCS的不同浓度调整其自我摄取行为；3）在渐进比率（PR）强化程序下，较高浓度的HFCS会引发更高的反应率。

这些结果明确表明，大鼠的经口操作性自我给药行为受到高果糖玉米糖浆（HFCS）摄入后效应的调控。事实上，在连续强化程序下，当HFCS浓度较高时，大鼠接受的灌注次数更少（比较图3中的25%和50%）。此外，低浓度HFCS（8%）在连续强化程序下仍能维持不同程度的自我给...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
美洛昔康	Boehringer Ingelheim Canada Ltd.		来自安大略兽医学院药房
普鲁卡因青霉素 G	Pen Aqueous, Wyeth Animal Health		来自安大略兽医学院药房
2% 盐酸利多卡因			来自安大略兽医学院药房
0.5% 马比佛因			来自安大略兽医学院药房
润滑眼膏			可在任意药店购买
2% 黏稠利多卡因口服液（局部麻醉剂）	Pharmascience Inc.	CDMV # 14705	100 ml 瓶装
异氟烷 USP	Pharmaceutical Partners of Canada	CDMV # 108737	250 ml 瓶装
Bacti-Stat	Merck Sante Animale	CDMV # 6449	3.785 L 瓶装
异丙醇（70%）	Perdu Pharma	Fisher # MPX18404	4 L 瓶装
聚维酮碘 10%	McKesson Canada	CDMV # 104826	500 ml 瓶装
Super Germiphene	Ceva Animal Health	CDMV # 103629	454 ml 瓶装
氯己定（Novadent）	Zoetis	CDMV # 8908	236 ml 瓶装
高果糖玉米糖浆	Natures Flavours	HFCS-55	1 加仑瓶装
材料
PE90 管	Becton Dickinson and Company	VWR # CA-63019-080A	100 英尺/卷
PE160 管	Becton Dickinson and Company	VWR # CA-63018-747	100 英尺/卷
聚丙烯网片	Small Parts Inc.	CMP-0297-D
电烙铁			可在任意五金店购买
#64 弹性橡皮筋	Staples 办公用品	商品编号 # 13556	可在任意办公用品商店购买
15 G 薄壁 3.5 英寸针头		VWR # CABD1108	12 根/包
电动剃毛器（1/2 英寸宽刀头）			可在任意宠物用品商店购买
Precision Glide 针头 20 G（1½ 英寸）	Becton Dickinson and Company	Fisher # 14-826D
Precision Glide 针头 16 G（1½ 英寸）	Becton Dickinson and Company	Fisher # 14-826-5D
操作条件反射舱	Med Associates Inc.	ENV-008-CTC
隔音舱	Med Associates Inc.	ENV-018M
MED PC IV 软件	Med Associates Inc.	SOF-735
注射泵	Razel Scientific Instruments
一次性塑料旋转连接装置	Med Associates Inc.	PHM-115I
Tygone 微孔管	Saint Gobain Performance Plastics	Fisher # 1417015B	500 英尺/卷