三维流动腔装置是一种新型装置 体外 一种用于在生理剪切应力条件下逐步定量评估循环细胞外渗级联过程的技术。因此，该装置满足了细胞迁移基础研究、临床前研究及临床研究中的关键需求。
本文内容
摘要
摘要
循环细胞从血流中渗出在多种生理和病理生理过程中起着核心作用，包括干细胞归巢和肿瘤转移。三维流动腔装置（以下简称3D装置）是一种新型的 体外 一种可重现生理剪切应力并量化细胞外渗级联反应每一步的技术。该三维装置包含一个上层腔室，待研究的细胞在此腔室内承受剪切应力并循环流动；以及一个下层静置孔腔室，用于容纳目标趋化因子。两个腔室之间由多孔插件隔开，插件表面包被有一层内皮细胞（EC）单层。在EC层下方还可选择性地放置第二个插件，用于承载目标微环境细胞。气体交换单元可确保最佳的CO₂2 保持张力，并在实验过程中提供一个可添加或取出细胞或化合物的通道。测试细胞在上层腔室中循环，由蠕动泵控制达到所需的剪切应力（流速）。实验结束后，收集循环细胞和迁移细胞以进行后续分析。该三维装置可用于研究细胞在剪切应力下沿内皮细胞（EC）的滚动与黏附、对趋化因子梯度的跨内皮迁移、对剪切应力的耐受性、细胞簇形成以及细胞存活情况。此外，可选的第二个插件可用于研究内皮细胞与微环境细胞之间相互作用的影响。该三维装置的转化应用包括测试靶向细胞迁移的候选药物以及预测 在体 细胞静脉注射后的行为。因此，这种新型3D装置是一种多功能且经济的工具，可用于研究介导细胞外渗的分子机制。
引言
细胞外渗是指循环中的细胞离开血液的过程，是机体多种生理反应的关键组成部分。该过程在组织再生中也具有重要意义，例如，当从组织动员至血管内的治疗性细胞（或经静脉注射）通过血管系统迁移，并从循环系统中离开，到达损伤或退变部位时。细胞外渗也是多种疾病发病机制中的关键环节，包括炎症、免疫排斥、自身免疫以及肿瘤转移等。
渗出是一个复杂的多步骤过程，涉及循环细胞在生理流动条件下与内皮细胞（EC）的相互作用。该过程包括（a）细胞滚动、（b）在EC管腔表面的牢固黏附，以及（c）跨过EC的迁移。重要的是，渗出级联反应的每一步均由特定细胞类型和物种特异性的分子亚群所调控。然而，由于在技术上难以模拟血液中的真实环境，目前对特定细胞亚群渗出过程的详细分子机制仍不甚清楚。本文所述的新型三维装置旨在克服这些技术难题，使实验得以开展，从而增进我们对细胞迁移生物学的理解。
介导细胞迁移的分子是重要的治疗靶点。深入了解调控特定细胞类型迁移的分子事件，将有助于发现促进或抑制血管外渗的新治疗靶点。例如，若能通过干预手段增强治疗性干细胞（无论来源于成体、新生儿甚至胎儿组织）向损伤或退变部位的迁移，将在组织再生中发挥重要作用。目前，人们对此类研究的兴趣正日益增长。 体外 治疗性干细胞的生成，包括来自多能性来源的细胞，以及在 离体 经扩增、基因改造及多种酶预处理的成体干细胞 1因此，在将干细胞用于治疗之前，迫切需要开发新技术来评估其质量。除其他参数外，这些细胞必须能够高效地从循环系统中迁移出去，因为多灶性疾病的治疗可能需要通过静脉途径给予干细胞。 2事实上，干细胞生物学目前面临的挑战之一是克服干细胞向组织损伤部位归巢的效率极低的问题 3-6，凸显了弥补干细胞迁移认知空白的迫切性。相反，通过靶向特定归巢分子来阻断细胞迁移的策略，可能有助于治疗炎症性疾病、自身免疫性疾病以及转移性癌症。因此，阐明循环细胞与内皮细胞（EC）在细胞迁移和外渗过程中相互作用的分子机制，不仅对基础科学研究具有重要意义，也与转化医学和药物研发密切相关。
目前有多种方法可用于研究细胞迁移的不同方面。然而，这些方法存在一些缺陷，而这些缺陷可通过新型3D装置得以克服。
动物模型：
动物模型，例如免疫缺陷小鼠和基因改造小鼠，已被广泛用作研究人源细胞在体（in vivo）迁移的有用工具。然而，这些模型存在一个显著缺陷：人源细胞与小鼠内皮细胞（EC）表面的黏附分子相互作用较弱，部分原因是多种细胞表面分子在不同物种间存在序列特异性差异。因此，使用啮齿类动物研究人源细胞迁移难以真实反映人类器官特异性血管床中的实际事件。此外，体内（in vivo）模型不适合用于药物候选物的高通量筛选。传统用于研究细胞归巢的体内（in vivo）模型无法区分外渗级联反应中的不同步骤，从而难以识别和靶向新的归巢分子。为满足这一需求，活体显微技术应运而生并提供了重要信息；然而，该技术极为耗时且劳动强度大7,8。
静态迁移实验：
Transwell 或 Boyden 小室实验用于检测细胞穿过多孔膜的迁移能力，广泛应用于细胞迁移研究。该实验的优势在于不仅可用于研究细胞运动性及细胞与细胞外基质（ECM）的相互作用，还可用于研究趋化因子介导的细胞穿过生长于多孔膜上的内皮细胞（EC）单层的迁移过程。然而，静态条件下内皮细胞的表型和功能与生理流动条件下的情况存在显著差异。 9,10因此，Transwell 实验中发生的趋化事件并不能真实模拟迁移细胞在剪切应力下与内皮细胞（EC）之间的相互作用。此外，归巢级联反应中的“滚动”步骤为整个过程增加了额外的选择性维度，但在静态的 Transwell 实验中该步骤无法发生。因此，尽管该技术能够定量评估趋化因子介导的细胞跨内皮单层迁移，但其局限性在于无法提供模拟血流的剪切应力 体内.
剪切应力下的检测：
已知壁面剪切应力在调控内皮细胞（EC）功能中发挥重要作用9,10。剪切力可迅速激活EC中的信号转导级联反应、转录因子及差异性基因表达11,12。基于这些发现，研究人员开发了新一代的黏附实验方法——平行层流 chamber 和毛细管系统，用于在剪切应力条件下研究细胞在EC上的滚动与黏附行为7,13。这些实验方法的局限性在于，它们仅能测量细胞的滚动和黏附，却无法区分那些将继续发生跨内皮迁移的黏附细胞与那些在EC单层上“停滞”、不会进一步迁移的黏附细胞。此外，这些方法也无法检测细胞向趋化因子梯度迁移的过程。
已有数份研究报告描述了在流动条件下，黏附细胞能够在生长于玻璃载片上的内皮细胞单层下方爬行的能力14。该爬行技术的局限性包括：仅能分析有限数量的细胞；缺乏定量性；仅分析细胞在基质和细胞表面的爬行，而无法检测细胞向趋化梯度迁移的情况；且无法分离已发生跨内皮迁移的细胞。因此，尽管该检测方法具有可对内皮细胞单层施加剪切应力的优势，却无法定量分析细胞向趋化因子梯度的迁移过程。
本文所述的新型3D技术通过结合剪切力（上层区室）与静态趋化因子梯度（下层区室），克服了上述诸多局限性，并可对血管外渗级联反应的每一步进行定量评估（图1）。该装置还可用于研究内皮细胞（EC）与微环境之间的相互作用如何影响EC支持循环细胞外渗的能力。以下方案详细描述了使用3D流动腔装置的逐步操作方法。
方案
1. 通过胶原蛋白包被制备用于细胞生长的上层和下层插件
- 计算实验所需的插入式培养小室数量。将每个插入式培养小室放入独立的无菌培养皿（35 × 10 mm）中，并通过辐照（11 Gy）进行灭菌。
- 制备用于膜表面包被的胶原蛋白溶液：浓度为 50 μg/ml，每插入式培养小室使用 154 μl（插入式培养小室表面积为 1.54 cm2）。
- 在插入式培养小室膜表面以环形方式滴加数滴胶原蛋白溶液（每滴约 20 μl，移液器吸头勿接触膜表面），然后小心地将剩余溶液加入，使膜表面形成一个较大的液滴。确保胶原蛋白溶液保持半球形，不从膜表面流走。
- 盖上培养皿盖子，于室温下在水平表面上孵育 1 小时。
- 吸除胶原蛋白溶液，并用 160 μl PBS 覆盖膜表面进行一次洗涤。
- 吸除 PBS 并重新盖上盖子。若当天使用，将培养皿置于室温干燥处；否则将培养皿置于 4 °C 保存，并在 7 天内使用插入式培养小室。
2. 在上层小室中培养内皮细胞
- 在所需培养基中制备内皮细胞（EC）悬液。确保细胞活力 >98%，并立即使用。
注意：对于人脐静脉内皮细胞（HUVEC），每个插入物使用 160 μl 中含 4 × 105 个细胞。
- 取第1步中已制备好胶原包被插件的培养皿；不要将插件从培养皿中取出。在胶原包被膜表面以环形方式滴加数个小液滴细胞悬液（每滴约20 μl），注意移液枪头不要接触膜表面，然后小心地将剩余细胞悬液集中加成一个大液滴。确保细胞悬液保持半球形，不从膜表面流走。
- 盖上皿盖，轻柔地将培养皿放入含5% CO2的细胞培养箱中，在37 °C条件下静置培养30分钟，使细胞充分贴附于膜表面。
- 向每个培养皿中轻柔加入5 ml培养基，确保插件仍位于培养皿底部并完全被培养基浸没。盖上皿盖后，小心将培养皿放回培养箱，于37 °C过夜培养细胞。
- 采用相同方法制备第二个（可选）下层插件，其中接种代表局部微环境的细胞，该插件将置于含有内皮细胞层（EC层）的插件下方。
注意：如果实验中包含下层小室，则需先将上层和下层小室相互连接，然后再将小室放入3D装置中（图4B）。
3. 组装三维流动腔装置
- 将上板和下板拧紧组装，使用管路将板件连接至气体交换单元，将组装好的装置放入洁净的塑料袋中，并通过辐照（11 Gy）对塑料袋及内容物进行灭菌。
- 从细胞培养箱中取出一个托盘架，放入无菌细胞培养操作台内，喷洒70%乙醇，擦拭干净，然后用一张大的无菌纸巾覆盖托盘。
- 将辐照灭菌后的塑料袋放入操作台内，从袋中取出装置并放置在无菌的培养箱托盘上。使用配套的管路将装置连接至蠕动泵，并将泵的流速设定为最佳速度0.2 ml/min。
注意：将泵与电源插座连接时，需将电源线从培养箱背面的孔中穿出。在电源线周围使用橡胶塞，以确保孔密封不漏气。
- 将 5 - 7 ml 所需的培养基加入无菌的 15 ml 离心管中（用于“入口”）。
4. 启动3D流动腔装置
- 通过将金属针头从管路中拔出，断开进液管路与出液端的连接（使用无菌小纱布保持管路末端的无菌状态）。将连接在管路上的金属针头作为“进液口”，断开的管路末端作为“出液口”。将金属针头进液口插入含有培养基的15 ml离心管中，将出液口插入另一个空的15 ml离心管中。
- 启动蠕动泵，使液体流动方向为逆时针，并将流速设定为0.2 ml/min。利用负压使培养基从15 ml进液管流入管路中，当培养基流至即将进入装置前的管路末端时，立即停止泵（图2，停止点 #1）。
- 拧开装置的上、下两块板。小心取下上板，并向下方的孔中加入1,500 – 1,550 μl培养基（仅培养基或含实验用趋化因子的培养基）。确保孔内液体量充足，形成一个凸面液滴，液面高出下板约1 – 2 mm。
- 使用无菌镊子将已准备好的插件从培养皿转移至下板的孔中，注意避免插件下方夹带气泡。若下板表面出现液体，应吸除干净，以确保板面干燥。将上板重新放回下板上，并用螺丝重新固定两板。
- 立即启动蠕动泵，使培养基流经三维装置。将装置的出液端略微抬高，并保持该倾斜位置，以防止板间空隙中产生气泡。
- 让培养基充满腔室及连接腔室与气体交换单元的管路。在培养基即将到达气体交换单元前立即停止泵（图2；停止点 #2）。向气体交换单元中加入3 ml培养基，启动泵，使气泡通过气体交换单元排出。将气体交换单元抬高，使培养基充满从该单元引出的管路，当培养基流至距出液管末端2 – 3 cm处时停止泵（图2，停止点 #3）。
- 使用无菌小纱布将进液端的金属针头与出液端重新连接。重新编程泵，使培养基以相反方向（顺时针）流向气体交换单元，并确保气泡在到达气体交换单元后被完全排出。检查系统内是否残留气泡。
- 重新编程泵，使培养基再次以逆时针方向流动。向气体交换单元中加入100 μl待测细胞悬液。关闭气体交换单元的盖子，将装有运行系统的托盘放回培养箱中，在37 °C下让待测细胞在三维装置中循环运行至预定时间。
注意：用70%乙醇清洁泵的电源线，并将其放入培养箱内。
5. 终止实验并采集样品进行检测
- 从培养箱中取出装有工作系统的托盘，放入生物安全柜中。停止泵运行，断开进液口和出液口，并将管端放入空的无菌15 ml离心管中。
- 启动泵，从系统中收集细胞悬液；根据需要将细胞悬液置于冰上，直至使用。
- 通过卸下螺钉并取下上层板来拆卸培养室。从下层板上取出插件，并将其转移至培养皿中。
注意： 可对插入物进行染色以观察和计数细胞 原位 （0.05% 结晶紫水溶液）2或用胰蛋白酶消化以收集内皮细胞进行后续检测。
- 将下层孔中的培养基和细胞移至离心管中，于 210 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，按需洗涤并重悬细胞，随后根据具体的实验目的对细胞进行后续处理（下文将进一步讨论）。
结果
小鼠骨髓来源的内皮细胞系 STR-12 在带有 5 μm 孔径的插入式培养小室上培养。在显微镜下监测内皮细胞的生长速率，当内皮细胞达到 100% 汇合时，将插入式小室转移至 3D 装置下室的孔中。在放置插入式小室前，下室孔中加入仅含培养基的溶液（阴性对照）或添加基质细胞衍生因子-1（SDF-1；5 ng/ml 和 50 ng/ml）的培养基。随后，组装 3D 装置，并按照方案所述将腔室充满培养基。需在装置上室循环的待测细胞为 freshly harvested 小鼠骨髓细胞（每腔室 3.5 x 106 个细胞）。通过设定蠕动泵流速为 0.2 ml/min，施加 0.8 dyn/cm2 的确定剪切应力。整个工作系统随后置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中，使细胞循环并与内皮细胞单层共孵育 4 小时。孵育结束后，收集循环细胞，拆卸腔室，并按方案所述取出插入式小室。从下室孔中收集迁移穿过的细胞，洗涤后重悬于新鲜培养基中，转移至添加造血生长因子的甲基纤维素培养体系中进行集落形成细胞（CFC）检测（图 3）。结果如预期所示，与含 5 ng/ml SDF-1 或仅含培养基的孔相比，迁移穿过内皮细胞单层进入含 50 ng/ml SDF-1 孔中的 CFC 数量显著更多。
正如我们之前所述，目前没有一种 体外 可用于研究细胞迁移的技术能够检测局部微环境对内皮细胞（EC）支持迁移细胞外渗能力的影响。为了说明如何利用三维装置实现这一目标，我们观察了循环造血细胞穿过内皮细胞层和骨髓基质细胞层的外渗过程。为此，在下层培养板中，将含有基质细胞层的第二个（下层）插入装置紧邻含有内皮细胞单层的上层插入装置放置。图4）。随后按照上述方法进行实验，从孔中收集迁移后的细胞并计数。结果表明，在内皮细胞单层下方增加一层间质细胞可显著促进造血细胞向SDF-1的迁移。图4这一发现与局部微环境有助于循环细胞向组织募集的观点一致。
图1. 三维流动腔室装置。A：该密闭式三维装置由两个腔室组成，中间由可更换的多孔膜（PM）分隔。内皮细胞（EC）在膜上生长，形成上、下腔室之间的屏障。通过恒速灌注蠕动泵向三维装置的上腔灌注培养基，施加特定的剪切应力。循环细胞可表现为非相互作用（NIC）、与内皮细胞短暂相互作用（“滚动”；RC）或黏附于内皮细胞（AC）。部分黏附细胞可跨过内皮细胞层迁移至装置的下部静态腔室（TM）。B：三维装置的俯视图（上图）。水平截面图（下图）显示了上层膜（红色）、下层膜（绿色）以及孔底部（蓝色）的位置。C：等距视图展示了装置的各个组成部分：四个螺丝、丙烯酸顶部模块、上腔密封件、上层和下层膜、底部O形圈以及三孔丙烯酸底部模块。D：三维流动腔室与蠕动泵及气体交换单元连接的实物照片。该系统在无菌操作台内组装完成后，转移至细胞培养孵育箱中。
图 2. 3D装置系统的示意图。 该图展示了组装该系统所需的三个流量控制阀。培养基通过蠕动泵产生的负压从进液口被吸入。关闭阀门#1以阻断培养基流动，从而可将插入式培养小室放入装置中。关闭培养室后，再次启动泵，使培养室迅速充满培养基，以防止生长在插入式小室上的细胞干燥。打开阀门#2可使培养基进入气体交换单元。打开阀门#3可在连接进液口和出液口时停止液体流动。通过泵上的开关，可将液体流向设置为顺时针或逆时针方向，从而利用气体交换单元去除系统中的气泡。
图3. 三维装置在生理剪切应力条件下支持由SDF-1介导的造血祖细胞跨膜迁移。A：组装三个装置（每个装置的下室包含3个孔），并行运行。向各装置下室的孔中加入仅含培养基或含5或50 ng/ml SDF-1的培养基。小鼠骨髓细胞在装置中循环4小时。随后拆解每个装置，从下室收集向SDF-1迁移的细胞（黄色），计数后接种于添加了造血生长因子（GF）的甲基纤维素培养基中进行培养。14天后，在显微镜下计数形成的细胞集落。B：每种条件下三个孔的结果以均值±标准差表示，展示从下室回收的祖细胞（集落形成细胞，CFC）数量。* p < 0.05。
图 4. 微环境对造血细胞与内皮细胞相互作用的影响。A：示意图显示了在上层带有内皮细胞（EC）的多孔膜下方，放置第二层含培养的基质成纤维细胞（SF）的多孔膜。其他缩写含义同图 1A所述。B：将含培养的SF的附加膜（下层插入物）置于上层膜下方。C：三个装置（每个包含3个孔）并行运行。向底层隔室孔中加入仅含培养基或含50 ng/ml SDF-1的培养基。阴性对照组孔中则省略SC、SDF-1或两者均省略。骨髓细胞在37 °C下循环4小时。随后，拆卸每个装置，从底层隔室孔中收集迁移穿过的细胞并进行计数。每种条件下迁移细胞的数量以三个孔的均值±标准差表示。* p < 0.05。
讨论
该3D装置可作为干细胞生物学、血管生物学、血液学、肿瘤学、自身免疫及炎症等多个研究领域的有用技术。对于研究造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞及其他干细胞的科研人员而言，该3D装置尤其适用于探究调控干细胞外渗级联反应各步骤的分子机制。研究细胞迁移的科研人员亦可利用该装置分析T淋巴细胞与B淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞及其他迁移性细胞之间不同的迁移机制。在血管生物学领域，该装置可用于评估局部微环境对内皮细胞（EC）支持细胞募集能力的影响，并模拟血脑屏障。 体外对于研究疾病发病机制的研究人员而言，该设备可用于研究细胞毒性T细胞在I型糖尿病中向胰腺的迁移、哮喘患者体内嗜酸性粒细胞向肺部的迁移、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞在多种疾病中向炎症部位的迁移、细胞向伤口愈合部位的募集、细胞毒性T细胞与新生血管的相互作用，以及细胞毒性T细胞向肿瘤组织的募集。
该新型3D装置也将成为转化医学及临床前药物研发与筛选的有力工具。例如，该装置可用于优化用于静脉给药的治疗性细胞悬液的制备，以及检测治疗性细胞向受损组织的募集情况 与 正常组织，并研究特定器官或组织的内皮及微环境在此过程中的作用。在药物开发中，该装置可用于测试靶向肿瘤细胞并阻断外渗级联各步骤的候选药物，评估迁移细胞作为药物递送载体靶向肿瘤部位的能力，测试调控人器官特异性内皮功能或局部组织特异性微环境的药物，以及测试调控归巢级联不同步骤的药物组合。最后，当转化为高通量系统时，该装置可用于筛选靶向介导细胞迁移分子的小分子、多肽和抗体。
技术细节与提示
滚动和黏附是细胞外渗级联反应中的关键步骤，对细胞迁移效率具有重要影响 体内 值得注意的是，这些步骤对静态检测没有贡献 体外然而，静态跨内皮迁移实验在测试剪切应力对细胞存活和功能影响的实验中可作为阴性对照，包括内皮细胞支持低亲和力相互作用（滚动）和牢固黏附的能力。
在3D装置中进行实验时，培养基的选择至关重要。不同培养基含有不同的生长因子，可能影响循环细胞的存活，尤其是在长时间孵育过程中。此外，商业培养基中钙离子（Ca2+）和镁离子（Mg2+）的浓度差异较大，而这些离子可能在生理流动条件下影响细胞的黏附相互作用。以下将讨论使用3D装置设计实验时应考虑的其他技术细节。
内皮细胞单层的筛选
内皮细胞（EC）的细胞表面特征受多种参数影响，包括物种来源、组织来源以及细胞培养条件，这些因素在实验设计中均应予以考虑。一些常用的内皮细胞包括肺源性微血管内皮细胞（LDMVEC）、骨髓源性内皮细胞（BMDEC）、脑源性内皮细胞（BDEC）以及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。内皮细胞的特性也因其来源不同而有所差异。例如，BMDEC 组成型表达选择素和 VCAM-1，这些分子介导细胞的滚动与黏附；而 BDEC、LDMVEC 和 HUVEC 在正常条件下不表达这些分子。因此，包被有 BDEC、LDMVEC 或 HUVEC 的小室插入膜可预先用 TNF α（10 ng/ml，4 小时）或其他因子处理，以模拟炎症状态并诱导归巢分子的表达。
检测与局部微环境的串扰
人们对理解局部微环境如何调控内皮细胞（EC）功能并参与循环细胞外渗过程的兴趣日益增加。我们的结果表明，在内皮细胞单层下方插入一层间质细胞可显著增加循环细胞的外渗。该发现表明，内皮细胞与间质之间的相互作用增强了内皮细胞支持循环细胞外渗的能力。此外，来自不同微环境的细胞插入后（例如 间充质干细胞、肺成纤维细胞、肿瘤细胞、星形胶质细胞）可能有助于模拟特定的血管床。特别是，脑源性内皮细胞与星形胶质细胞的组合可能是模拟血脑屏障的有效方法。类似地，来自患者的细胞，或经过基因操作的正常细胞 体外 有助于模拟特定疾病的微环境。
在我们的研究中，使用了基质细胞生长至50%汇合度的下层小室。尽管小室上微环境细胞的最佳密度取决于研究目的，但该密度可轻松进行调整和控制。
选择剪切应力速率
此处采用 0.8 dyn/cm2 的剪切应力，因为 Von Andrian et al. 已证明，该剪切应力值相当于正常生理条件下造血祖细胞离开血液循环并进入组织时骨髓微血管中的剪切应力15。相比之下，较大的血管中剪切应力水平较高，而细胞的血管外渗作用受限。因此，高剪切应力可作为研究不同类型细胞外渗实验的额外对照条件。
细胞在剪切应力下的存活情况取决于多种因素，包括细胞类型和ex vivo细胞处理方式（Goncharova et al.，未发表观察结果），因此应在实验过程中仔细评估。可通过编程蠕动泵逐步增加剪切应力，从0.8 dyn/cm2升至6 dyn/cm2，以评估细胞对不同水平剪切应力的敏感性（即剪切应力耐受性）。在这些测试过程中，可定期从气体交换室中收集细胞，利用台盼蓝排斥法、annexin V与PI染色以及凋亡标志物表达等检测方法监测细胞死亡情况。
如果实验旨在测试剪切应力抵抗力 离体 建议在实验中加入额外的阳性对照，例如血液来源的细胞，特别是对于经基因改造的细胞或源自实质组织的细胞。
插入孔径大小和细胞外基质包被的选择
可提供多种孔径（3、5 和 8 μm）的插入式培养小室。孔径的选择取决于循环测试细胞的大小和特性，这一点与静态 Transwell 实验相同。建议使用大孔径（8 μm）的插入式培养小室来检测上皮来源的肿瘤细胞等较大细胞的跨内皮迁移。白细胞或造血干细胞通常使用 5 μm 孔径的插入式培养小室进行检测，而 3 μm 孔径的插入式培养小室最适合用于检测较小细胞的跨内皮迁移。然而，测试细胞的大小并非唯一重要的因素，我们建议使用多种孔径的插入式培养小室进行测试。
在我们的初步研究中，我们测试了多种细胞外基质（ECM）在插入物上支持内皮细胞（EC）生长的能力，以及其耐受剪切应力的能力 >4 小时。测试的细胞外基质包括 Matrigel、多聚-D-赖氨酸、纤连蛋白、层粘连蛋白、I 型胶原、Hydrogel、Meta-keratin I、II、III、IV 和 Extracel。内皮细胞生长的最佳结果来自 Extracel、纤连蛋白和胶原。然而，在我们的实验条件下，Extracel 在 0.8 μg/cm² 时2 显著减少了测试细胞跨膜迁移。因此，我们现在使用纤连蛋白（5 μg/cm²）2）或胶原蛋白（5 μg/cm2用于插入物的包被。然而，最佳ECM的选择可能受内皮细胞（EC）类型和待测细胞跨膜迁移特性的共同影响。应首先进行预实验，以检测在选定ECM上生长的EC单层的完整性。例如，将预先包被并带有EC单层的插入物置于盛有培养基的培养皿中，将培养皿放在摇床上以产生剪切应力（低速设置），并在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 孵育12小时。可通过结晶紫染色评估内皮细胞在受到剪切应力后的完整性。
最佳检测细胞浓度的选择
检测细胞离开循环系统的能力取决于每种细胞类型特有的多种特性。为了获得具有统计学意义的结果，必须优化循环细胞的密度，以确保有足够数量的细胞迁移至阳性对照孔中。因此，我们建议在初始实验中使用一系列不同细胞密度（例如 103/ml 至 107/ml）进行测试，以明确加入系统的细胞数量与发生跨膜迁移的细胞数量之间的关系。
此外，从不同来源获取的同一种细胞类型，其最佳循环浓度可能存在差异。例如，CD34+ 细胞是一类异质性细胞群体，包含造血干细胞和定向谱系祖细胞。这些细胞可来源于骨髓、动员后的外周血以及脐带血。来源于这三种不同来源的 CD34+ 细胞具有不同的归巢和植入能力16-18，因此在开展大规模研究前，应针对这些细胞在三维装置中的检测条件进行优化。
最佳细胞循环时间的选择
每种细胞类型的最适循环时间应通过实验经验确定。循环所需的最短时间可从静态迁移实验的结果中推断，但当细胞受到剪切应力作用时，该时间可能需要延长。建议进行预实验，测试4至96小时之间的循环时间。
气体交换单元
气体交换单元的主要目的是维持流经三维装置的培养基中CO2的最适浓度，类似于标准组织培养孵育箱中的设置。气体交换单元还可用于在实验过程中添加待测细胞和化合物，以及采集探针和样品。
测试细胞数量的评估
在实验过程中，可通过气体交换单元在不同时间点采集循环中的细胞。实验结束时，可从出口处收集循环回路中剩余的细胞。当实验结束后拆卸三维装置时，可从下层小室中收获已迁移的细胞，并收集用于进一步分析。如果输入的细胞未标记，可用台盼蓝对已迁移的细胞进行染色，并通过显微镜计数活细胞和死细胞。或者，在将细胞加载到三维装置之前，可用多种可用于活细胞成像的“细胞示踪”染料之一对输入细胞进行标记；在此情况下，应裂解收获的已迁移细胞，以定量荧光强度。
最佳样本量的选择
为了进行统计分析，需选择一个样本量，使得在使用双侧t检验、显著性水平为0.05的条件下，能够以约80%的检验效能检测出两组间平均百分变化的假设差异。根据我们对骨髓细胞的研究经验，在3D装置实验中，每个实验条件使用三个孔。然而，最佳样本量会因实验目的不同而有所差异，应通过实验经验确定。可采用多元回归统计检验、双侧t检验和方差分析来验证结果的统计学显著性。
趋化因子的选择
对于所有跨内皮迁移实验，趋化因子的选择取决于待测细胞的特性和研究目的。SDF-1 是造血细胞中已被广泛证实的趋化因子。根据我们的经验，50 ng/ml 的 SDF-1 浓度最适于刺激骨髓来源的造血祖细胞发生外渗。我们还使用 C3a 和 bFGF 作为间充质干细胞的趋化因子19。然而，我们建议在开展大规模研究前，对每种趋化因子进行梯度浓度测试，并对趋化因子组合进行交叉滴定，以确定最佳浓度范围。对于某些细胞类型，联合使用多种趋化因子可能更有利。如果特定待测细胞的趋化因子未知或无法获得，可使用经刺激的淋巴细胞、成纤维细胞及其他细胞的条件培养基作为趋化因子来源。
读出参数的选择
该3D装置的多功能性将拓展可开展的跨膜迁移实验类型，而实验的成功取决于对检测参数的周密考虑与合理设计。通常，应与细胞计数同时检测从上层（循环）腔室和下层（静态）腔室收集的细胞活力。某些细胞对微血管中常见的生理剪切应力耐受性较低。在此情况下，上层腔室中的死细胞数量会增加。可通过免疫细胞化学方法检测被试细胞特异性表达的标志物，以评估黏附并滞留（或被捕获）在内皮细胞（EC）层上的细胞数量。可使用针对CD31和vWF的特异性抗体来检测EC，并区分被试细胞与EC。此外，每次实验结束时均应监测EC单层的完整性。
分析所收集细胞的类型将取决于研究者的实验目标，但可能包括通过微阵列和qPCR分析基因表达变化，通过FACS分析表面分子表达，通过FACS和Western印迹分析信号通路的激活，以及通过ELISA检测因子分泌。对所收集的细胞可进行大量功能检测。 体外，这一点在我们自己的研究中已得到证实，即通过培养迁移后的骨髓细胞来计数造血祖细胞（图3）。收集的样品还可用于多种检测 体内 检测方法
一个有助于预测受试细胞行为的重要参数 体内 某些细胞在不同剪切应力条件下倾向于形成聚集体。例如，在三维装置中发生聚集体形成的治疗性细胞，在静脉给药后可能更容易形成团块，导致急性血管阻塞 体内 (Goncharova 等，未发表的观察结果）。在3D装置实验期间或结束后，通过取样检测细胞，可在显微镜下监测聚集体的形成。
披露
Cascade LifeSciences Inc. 拥有美国专利号 7,927,867 B2“用于评估的装置”的独家权利 体外 在流动条件下的细胞迁移及其应用方法。SKK 是 3D 流动室装置技术的发明人，同时也是 Cascade LifeSciences Inc. 的科学联合创始人和股东。
致谢
感谢 C.B.S. 科学公司（www.cbsscientific.com）的 Chuck Scott 和 Victor McKnight 在三维培养室、气体交换单元及插入件的工程设计与制造方面提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院资助（资助编号 R21DK067084 和 R43CA141782，授予 SKK）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂/材料 | |||
| PVC管（内径1.42，壁厚0.8） | Watson-Marlow Limitid | 981.0142.000 | |
| 3D培养室 | C.B.S.Scientific | FC-1000 | |
| 气体交换单元 | C.B.S.Scientific | FCR-1000 | |
| 插入式培养插件 | C.B.S.Scientific | FCI-1005U | |
| 牛I型胶原蛋白 | BD Biosciences | 354231 | |
| 0.1M盐酸 | VWR | BDH3200-1 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| HUVEC | Lonza | CC- 2517 | |
| EGM Bullet Kit（cc - 3121 & cc - 4133） | Lonza | CC - 3124 | |
| 胰蛋白酶中和液 | Lonza | CC-5002 | |
| 胰蛋白酶 | Lonza | CC-5012 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| SDF-1 | R7D System | 460-SD | |
| Extracel试用2.5试剂盒 | Glycosam Byosystems | GS211 | |
| 人源天然纤连蛋白 | BD Biosciences | 356008 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Millipore | A-003-E | |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| 人脑微血管内皮细胞 | ScienCell | 1000 | |
| 脑细胞专用内皮细胞培养基（ECM） | ScienCell | 1001 | |
| 台盼蓝 | StemCells Tecnologies | 7050 | |
| TNF-α，10 μg | Invitrogen | PHC3015 | |
| VCAM-1，小鼠抗人，CD106-FITC | Southern Bioteck | 9519-02 | |
| 碘化丙啶染色液 | BD Pharmingen | # 556463 | |
| 冻存人脐带血CD34+细胞 | StemCell | CB007F | |
| 冻存人脐带血CD34+细胞 | Zenbio | SER - CD34-F | |
| MethoCult GF M3434 | StemCells Tecnologies | GFM3434 | |
| 小鼠甲基纤维素完全培养基 | R&D | HSC007 | |
| 抗血管性血友病因子抗体 | abcam | C# ab11713 | |
| 培养皿（35 × 10 mm） | VWR | CA25373-041 | |
| 15 ml离心管 | VWR Fisher | 21008 - 918 | |
| 组织培养瓶，75 cm2 | VWR | BD353136 | |
| 结晶紫 | Sigma | C-3886-25G | |
| 弯头解剖镊 | VWR | 82027-384 | |
| 1,000 μl移液器吸头 | VWR | 83007-380 | |
| 1 - 200 μl移液器吸头 | VWR | 37001-530 | |
| 设备 | |||
| 蠕动泵 | Watson-Marlow Limitid | 403U/VM3 |
参考文献
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