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基因-环境相互作用模型揭示帕金森病易感机制

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DOI:

10.3791/50960

2014年1月7日

本文内容

摘要

脂氧合酶(LOX)同工酶可生成可能增强或减弱神经炎症与神经变性的产物。 通过基因-环境相互作用研究,可识别特定LOX同工酶的作用。利用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的黑质纹状体损伤模型,在两种LOX同工酶缺陷的转基因小鼠品系中,可比较LOX同工酶对多巴胺能完整性和炎症反应的贡献。

摘要

脂氧合酶(LOX)活性被认为与阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关,但其在帕金森病(PD)发病机制中的作用尚不明确。基因-环境相互作用模型有助于揭示特定细胞通路在毒性中的影响,而仅使用遗传模型或单纯毒物模型可能无法观察到这些影响。 为了评估不同的LOX同工酶是否选择性地参与PD相关的神经退行性变,可对转基因(i.e. 5-LOX和12/15-LOX缺陷型)小鼠施加一种模拟该疾病中细胞损伤与死亡的毒素。 本文描述了一种神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的应用,该毒素可诱导黑质纹状体损伤,以阐明不同LOX同工酶在PD相关神经退行性变中的特异性作用。在小鼠和非人灵长类动物中使用MPTP已得到广泛验证,能够有效模拟PD中的黑质纹状体损害。 MPTP诱导的损伤程度通过高效液相色谱法(HPLC)检测多巴胺及其代谢产物,并结合对纹状体组织进行酪氨酸羟化酶(TH)——即多巴胺合成限速酶——的半定量Western印迹分析来评估。为评估可能体现LOX同工酶选择性敏感性的炎症标志物,对包含黑质的脑切片进行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Iba-1免疫组织化学染色,并对纹状体匀浆样本进行GFAP的Western印迹分析。 该实验方法可为揭示黑质纹状体变性及帕金森病背后基因-环境相互作用提供新的见解。

引言

基因-环境相互作用模型的使用提供了一种模拟可能影响特发性帕金森病(PD)风险因素的方法,并为揭示单独使用遗传或毒性系统难以阐明的机制性见解提供了机会1,2。本文阐述了这一观点,并描述了1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)小鼠黑质纹状体变性模型的应用,以更深入地理解脂氧合酶(LOX)同工酶活性在神经炎症和神经毒性中的选择性作用4。尽管LOX同工酶在多种外周疾病5,6以及中枢神经系统疾病(如脑卒中7和阿尔茨海默病8,9)中的作用已被广泛研究,但该同工酶家族在与PD相关的黑质纹状体功能及变性中的作用尚不明确,亟需进一步研究。MPTP神经毒素可选择性地导致黑质纹状体通路退变,并重现PD患者中出现的纹状体多巴胺耗竭及黑质多巴胺能神经元丢失,这些是运动功能障碍的基础10。尽管该模型无法完全复制PD患者全部的非运动和运动行为表现,也无法形成明确的α-突触核蛋白阳性路易小体病理改变,但它已被证明在揭示导致黑质纹状体损伤的新机制靶点以及早期转化研究中具有重要价值,是目前最成熟、可重复诱导黑质神经元死亡并伴随纹状体多巴胺减少的非侵入性模型11-15。MPTP小鼠模型已被广泛应用,其处理方案涵盖急性、亚急性和慢性等多种范式16-18,使得剂量标准化成为可能,从而诱导轻度至重度的黑质纹状体损伤19,20 <....

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方案

注意:所有动物实验操作和动物护理方法均须经机构的机构动物护理与使用委员会(IACUC)批准。本文所述研究是根据SRI International的IACUC所制定的指南进行的。

1. LOX 缺陷型小鼠的获取与保种

  1. 购买5-LOX缺陷型或12/15-LOX缺陷型小鼠,以及相应品系和性别匹配的对照小鼠,年龄为7–8周,在到达后给予数天时间适应设施环境。
  2. 将小鼠以群体饲养方式置于12小时光照-12小时黑暗循环环境中,并提供食物和饮用水 随意摄取.

2. MPTP 的注意事项、储存、配制、去污与处置

注意:人类静脉接触MPTP已被证实可导致帕金森综合征10;MPTP具有高度脂溶性,可迅速通过血脑屏障26。应采取预防措施,确保其安全操作、去毒及处置。MPTP的代谢过程涉及多个步骤,包括通过单胺氧化酶B(MAO-B)将其转化为1-甲基-4-苯基-2,3-二氢吡啶27。在发生意外人体中毒的情况下,可使用MAO-B抑制剂进行干预。

  1. 在使用MPTP之前,确保相关人员已根据机构健康与安全委员会的规定接受适当的安全....

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结果

这种毒素暴露范式可在MPTP注射动物与生理盐水注射动物之间产生显著且可检测的纹状体多巴胺减少20%。需要注意的是,不同批次的MPTP可能导致略高或略低的损伤程度;因此,当使用新的神经毒素批次时,建议在转基因动物实验前先在野生型小鼠中进行预实验,以获得更精确的结果。采用轻度至中度的损伤模型有助于观察转基因的影响;而重度损伤可能产生“平台效应”,即损伤过于强烈而无法被缓解,或损伤过于严重从而掩盖有害基因改变的作用。在5-LOX同工酶缺陷小鼠中,MPTP对纹状体多巴胺的影响具有显著差异,但在12/15-LOX同工酶缺陷小鼠中则无显著差异(图1)。此外,通过这些方法,我们还能够发现生理盐水处理的小鼠因5-LOX缺陷而导致的多巴胺水平显著差异(图1)。

通过免疫印迹检测TH和GFAP,分别证实了野生型小鼠纹状体水平的损伤和神经炎症,而在5-LOX同工酶缺陷型小鼠的纹状体中,该效应减弱图3A 3B)。该病变在黑质水平亦可辨识。图 2A

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讨论

本基因-环境相互作用研究的设计使我们获得了关于5-LOX同工酶在黑质纹状体通路中双重性质的新信息。 通过对缺乏5-LOX同工酶的转基因小鼠及其野生型同窝小鼠在生理盐水或MPTP处理后采用高效液相色谱法(HPLC)测定纹状体单胺类神经递质水平,我们发现,在毒性条件下,5-LOX的缺失具有保护作用(图1);但在正常条件下,该酶的缺失会降低纹状体多巴胺水平,可能产生不利影响。 因此,我们证明了5-LOX同工酶在正常条件下有助于维持纹状体多巴胺能张力,但在接触毒性物质后可能参与神经损伤过程4

尽管需要进一步评估以深入了解LOX同工酶在黑质纹状体毒性中的作用机制,但蛋白质印迹分析(图3)以及免疫组织化学研究(图2)显示,在暴露于MPTP的5-LOX同工酶缺陷型小鼠群体中,神经炎症标志物至少在一定程度上有所减弱。 这些采用经典生物化学与组织学技术所得的结果表明,5-LOX代谢产物在增强小胶质细胞和星形胶质细胞活化过程中发挥着关键作用

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致谢

本工作由美国国立卫生研究院(NIH)下属国家普通医学科学研究所(NIGMS)资助,项目编号 056062。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐 (MPTP-HCL)Sigma-AldrichM0896用于帕金森病建模
4% 甲醛(多聚甲醛)磷酸盐缓冲液 (PFA)American MasterTech ScientificBUP0157用于浸没固定
高氯酸 ACS 试剂,70% (PCA)Sigma-Aldrich244252用于 HPLC 酸提取
Tris 碱Sigma-AldrichT1503用于组织匀浆
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 (EDTA)Sigma-AldrichE1644用于组织匀浆
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP8340用于组织匀浆
磷酸酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP5726用于组织匀浆
氢氧化钠 (NaOH)Sigma-AldrichS5881用于 Lowry 蛋白测定
蔗糖,分子生物学级,≥99.5% (GC) Sigma-AldrichS0389用于冷冻保护
磷酸盐缓冲液粉末,pH 7.4(用于 0.01 M PBS)Sigma-AldrichP3813用于免疫组化
BCA 蛋白检测试剂盒Pierce/Thermo23225用于蛋白定量
Novex 12% Tris-甘氨酸迷你胶 1.0 mm,12 孔Invitrogen/Life TechnologiesEC60052BOX用于 SDS-PAGE
NuPAGE LDS 上样缓冲液 (4x)Invitrogen/Life TechnologiesNP0007用于 SDS-PAGE
Novex Sharp 预染蛋白标准品 Invitrogen/Life TechnologiesLC5800蛋白分子量标记
甘氨酸Sigma-AldrichG7126用于 SDS-PAGE
十二烷基硫酸钠,电泳级,98.5% (SDS)Sigma-AldrichL3771用于 SDS-PAGE
无水甲醇,试剂级 American MasterTech ScientificSPM1057C用于转膜的甲醇
氯化钠 (NaCl),ACS 试剂Sigma-AldrichS9888用于生理盐水和缓冲液
脱脂奶粉粉末Carnationn/a用于免疫印迹
5% 乙酸中的 Ponceau S 溶液 Sigma-AldrichP7170用于免疫印迹
抗酪氨酸羟化酶 (TH) 抗体,绵羊多克隆Chemicon/MilliporeAB1542用于免疫荧光 
抗酪氨酸羟化酶 (TH) 抗体,兔多克隆Pel-Freez BiologicalsP40101-0用于免疫印迹
抗-β 肌动蛋白抗体,兔Sigma-AldrichA2066用于免疫印迹
抗胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 抗体,兔多克隆Chemicon/MilliporeAB5804用于免疫荧光
抗胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 抗体,小鼠单克隆Covance Inc.SMI-22R用于免疫印迹
Tween-20Sigma-AldrichP1379用于免疫印迹
辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG (H+L) Fisher Scientific31462用于免疫荧光
辣根过氧化物酶标记山羊抗绵羊抗体Pierce/Thermo31480用于免疫荧光
辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体Pierce/Thermo31430用于免疫荧光
SuperSignal West Pico 化学发光底物Pierce/Thermo34078用于免疫印迹
CL-XPosure 胶片 7 英寸 × 9.5 英寸 Pierce/Thermo34089用于免疫印迹
Restore Western Blot 剥脱缓冲液 Pierce/Thermo21059用于免疫印迹
柠檬酸一水合物,ACS 试剂,≥99.0% Sigma-AldrichC1909用于免疫组化
正常驴血清MilliporeS30-100ML用于免疫组化
聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)Sigma-AldrichP5288用于免疫组化
牛血清白蛋白 (BSA),冻干粉Sigma-AldrichA3294用于免疫组化
曲拉通 X-100Fisher ScientificBP151-01用于免疫组化
驴抗兔 IgG,Alexa Fluor 568 标记 Invitrogen/Life TechnologiesA10042用于免疫组化
驴抗绵羊 IgG (H+L),FITC 标记 Jackson ImmunoResearch713-095-147用于免疫组化
含 DAPI 的 VECTASHIELD 硬封片剂Vector LaboratoriesH-1500用于免疫组化
正常山羊血清MilliporeS26-100ML用于免疫组化
VECTASTAIN ABC 试剂盒(兔 IgG) Vector LaboratoriesPK-4001用于免疫组化;每 1 ml PBS 中加入溶液 A 和 B 各 10 µl(按说明书操作)
DAB 过氧化物酶底物试剂盒,3,3’-二氨基联苯胺Vector LaboratoriesSK-4100用于免疫组化;每 5 ml 冷 ddH2O,加入 2 滴缓冲液原液、2 滴 DAB 和 1 滴 H2O2(H2O2 在使用前立即加入)
过氧化氢,30%Sigma-Aldrich216763用于免疫组化中的淬灭步骤
兔抗 Iba1 抗体Biocare MedicalsCP290A用于免疫组化
焦油紫溶液,常规浓度 FD NeurotechnologiesPS102-01Iba1 免疫组化的复染剂
95% 乙醇,试剂级乙醇Sigma-AldrichR8382用于免疫组化的脱水
100% 无水乙醇Mallinckrodt7019-10用于免疫组化的脱水
乙酸Sigma-AldrichA6283用于免疫组化的褪色
二甲苯Sigma-Aldrich534056用于免疫组化的透明剂
DPX 封片剂Sigma-Aldrich06522用于 DAB 免疫组化的封片介质
O.C.T. 包埋剂 — 冷冻切片包埋介质 American MasterTech ScientificEMOCTCS用于冰冻切片的包埋介质
高锰酸钾Sigma-Aldrich223468用于 DAB 溶液的去污染
多巴胺盐酸盐Sigma-AldrichH8502用于 HPLC
3,4-二羟基苯乙酸 (DOPAC)Sigma-Aldrich850217用于 HPLC
高香草酸 (HVA)Sigma-AldrichH1252用于 HPLC
高氯酸 (PCA) - 70%Sigma-Aldrich244252用于 HPLC
磷酸二氢钠一水合物Sigma-Aldrich71504用于 HPLC
柠檬酸一水合物Sigma-AldrichC1909用于 HPLC
1-辛烷磺酸钠 (OSA)Sigma-AldrichO8380用于 HPLC
EDTASigma-AldrichE1644用于 HPLC
乙腈EMDAX0145-1用于 HPLC
HPLC 级去离子水 (ddH2O)Millipore用于 HPLC
0.22 µm GSTF 膜Millipore用于过滤
Corning NetwellsSigma-AldrichCLS3477带聚酯网底的聚苯乙烯插入件,用于免疫组化
超声细胞破碎仪 (Soniprep 150)MSEMSE.41371.274
微量离心机Eppendorf5414R
ESA MD-150 反相色谱柱 ESA
HPLC 泵 (Ultimate 3000)DionexISO-3100BM
HPLC 自动进样器 (Ultimate 3000)DionexWPS-3000TSL
电化学检测器ESACoulochem III
保护柱ESA5020
分析柱ESA5011A
Chromeleon 软件Dionex
Eclipse E400NikonE400明场/荧光显微镜
一次性小鼠笼AncareN10HT
微滤顶盖AncareN10MBT
5-LOX 缺陷型小鼠The Jackson Laboratory004155
12/15-LOX 缺陷型小鼠The Jackson Laboratory002778

参考文献

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment intera....

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MPTP Iba 1

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