脂氧合酶（LOX）同工酶可生成可能增强或减弱神经炎症与神经变性的产物。 通过基因-环境相互作用研究，可识别特定LOX同工酶的作用。利用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的黑质纹状体损伤模型，在两种LOX同工酶缺陷的转基因小鼠品系中，可比较LOX同工酶对多巴胺能完整性和炎症反应的贡献。
脂氧合酶（LOX）同工酶可生成可能增强或减弱神经炎症与神经变性的产物。 通过基因-环境相互作用研究，可识别特定LOX同工酶的作用。利用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的黑质纹状体损伤模型，在两种LOX同工酶缺陷的转基因小鼠品系中，可比较LOX同工酶对多巴胺能完整性和炎症反应的贡献。
脂氧合酶（LOX）活性被认为与阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关，但其在帕金森病（PD）发病机制中的作用尚不明确。基因-环境相互作用模型有助于揭示特定细胞通路在毒性中的影响，而仅使用遗传模型或单纯毒物模型可能无法观察到这些影响。 为了评估不同的LOX同工酶是否选择性地参与PD相关的神经退行性变，可对转基因（i.e. 5-LOX和12/15-LOX缺陷型）小鼠施加一种模拟该疾病中细胞损伤与死亡的毒素。 本文描述了一种神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）的应用，该毒素可诱导黑质纹状体损伤，以阐明不同LOX同工酶在PD相关神经退行性变中的特异性作用。在小鼠和非人灵长类动物中使用MPTP已得到广泛验证，能够有效模拟PD中的黑质纹状体损害。 MPTP诱导的损伤程度通过高效液相色谱法（HPLC）检测多巴胺及其代谢产物，并结合对纹状体组织进行酪氨酸羟化酶（TH）——即多巴胺合成限速酶——的半定量Western印迹分析来评估。为评估可能体现LOX同工酶选择性敏感性的炎症标志物，对包含黑质的脑切片进行胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和Iba-1免疫组织化学染色，并对纹状体匀浆样本进行GFAP的Western印迹分析。 该实验方法可为揭示黑质纹状体变性及帕金森病背后基因-环境相互作用提供新的见解。
基因-环境相互作用模型的使用提供了一种模拟可能影响特发性帕金森病（PD）风险因素的方法，并为揭示单独使用遗传或毒性系统难以阐明的机制性见解提供了机会1,2。本文阐述了这一观点，并描述了1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）小鼠黑质纹状体变性模型3 的应用，以更深入地理解脂氧合酶（LOX）同工酶活性在神经炎症和神经毒性中的选择性作用4。尽管LOX同工酶在多种外周疾病5,6以及中枢神经系统疾病（如脑卒中7和阿尔茨海默病8,9）中的作用已被广泛研究，但该同工酶家族在与PD相关的黑质纹状体功能及变性中的作用尚不明确，亟需进一步研究。MPTP神经毒素可选择性地导致黑质纹状体通路退变，并重现PD患者中出现的纹状体多巴胺耗竭及黑质多巴胺能神经元丢失，这些是运动功能障碍的基础10。尽管该模型无法完全复制PD患者全部的非运动和运动行为表现，也无法形成明确的α-突触核蛋白阳性路易小体病理改变，但它已被证明在揭示导致黑质纹状体损伤的新机制靶点以及早期转化研究中具有重要价值，是目前最成熟、可重复诱导黑质神经元死亡并伴随纹状体多巴胺减少的非侵入性模型11-15。MPTP小鼠模型已被广泛应用，其处理方案涵盖急性、亚急性和慢性等多种范式16-18，使得剂量标准化成为可能，从而诱导轻度至重度的黑质纹状体损伤19,20 <....
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注意：所有动物实验操作和动物护理方法均须经机构的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。本文所述研究是根据SRI International的IACUC所制定的指南进行的。
1. LOX 缺陷型小鼠的获取与保种
2. MPTP 的注意事项、储存、配制、去污与处置
注意：人类静脉接触MPTP已被证实可导致帕金森综合征10；MPTP具有高度脂溶性，可迅速通过血脑屏障26。应采取预防措施，确保其安全操作、去毒及处置。MPTP的代谢过程涉及多个步骤，包括通过单胺氧化酶B（MAO-B）将其转化为1-甲基-4-苯基-2,3-二氢吡啶27。在发生意外人体中毒的情况下，可使用MAO-B抑制剂进行干预。
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这种毒素暴露范式可在MPTP注射动物与生理盐水注射动物之间产生显著且可检测的纹状体多巴胺减少20%。需要注意的是，不同批次的MPTP可能导致略高或略低的损伤程度；因此，当使用新的神经毒素批次时，建议在转基因动物实验前先在野生型小鼠中进行预实验，以获得更精确的结果。采用轻度至中度的损伤模型有助于观察转基因的影响；而重度损伤可能产生“平台效应”，即损伤过于强烈而无法被缓解，或损伤过于严重从而掩盖有害基因改变的作用。在5-LOX同工酶缺陷小鼠中，MPTP对纹状体多巴胺的影响具有显著差异，但在12/15-LOX同工酶缺陷小鼠中则无显著差异（图1）。此外，通过这些方法，我们还能够发现生理盐水处理的小鼠因5-LOX缺陷而导致的多巴胺水平显著差异（图1）。
通过免疫印迹检测TH和GFAP，分别证实了野生型小鼠纹状体水平的损伤和神经炎症，而在5-LOX同工酶缺陷型小鼠的纹状体中，该效应减弱图3A 和 3B）。该病变在黑质水平亦可辨识。图 2A
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本基因-环境相互作用研究的设计使我们获得了关于5-LOX同工酶在黑质纹状体通路中双重性质的新信息。 通过对缺乏5-LOX同工酶的转基因小鼠及其野生型同窝小鼠在生理盐水或MPTP处理后采用高效液相色谱法（HPLC）测定纹状体单胺类神经递质水平，我们发现，在毒性条件下，5-LOX的缺失具有保护作用（图1）；但在正常条件下，该酶的缺失会降低纹状体多巴胺水平，可能产生不利影响。 因此，我们证明了5-LOX同工酶在正常条件下有助于维持纹状体多巴胺能张力，但在接触毒性物质后可能参与神经损伤过程4。
尽管需要进一步评估以深入了解LOX同工酶在黑质纹状体毒性中的作用机制，但蛋白质印迹分析（图3）以及免疫组织化学研究（图2）显示，在暴露于MPTP的5-LOX同工酶缺陷型小鼠群体中，神经炎症标志物至少在一定程度上有所减弱。 这些采用经典生物化学与组织学技术所得的结果表明，5-LOX代谢产物在增强小胶质细胞和星形胶质细胞活化过程中发挥着关键作用
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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）下属国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助，项目编号 056062。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐 (MPTP-HCL) | Sigma-Aldrich | M0896 | 用于帕金森病建模 |
| 4% 甲醛（多聚甲醛）磷酸盐缓冲液 (PFA) | American MasterTech Scientific | BUP0157 | 用于浸没固定 |
| 高氯酸 ACS 试剂，70% (PCA) | Sigma-Aldrich | 244252 | 用于 HPLC 酸提取 |
| Tris 碱 | Sigma-Aldrich | T1503 | 用于组织匀浆 |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 (EDTA) | Sigma-Aldrich | E1644 | 用于组织匀浆 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 | 用于组织匀浆 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P5726 | 用于组织匀浆 |
| 氢氧化钠 (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | 用于 Lowry 蛋白测定 |
| 蔗糖，分子生物学级，≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389 | 用于冷冻保护 |
| 磷酸盐缓冲液粉末，pH 7.4（用于 0.01 M PBS） | Sigma-Aldrich | P3813 | 用于免疫组化 |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Pierce/Thermo | 23225 | 用于蛋白定量 |
| Novex 12% Tris-甘氨酸迷你胶 1.0 mm，12 孔 | Invitrogen/Life Technologies | EC60052BOX | 用于 SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS 上样缓冲液 (4x) | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | 用于 SDS-PAGE |
| Novex Sharp 预染蛋白标准品 | Invitrogen/Life Technologies | LC5800 | 蛋白分子量标记 |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G7126 | 用于 SDS-PAGE |
| 十二烷基硫酸钠，电泳级，98.5% (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | 用于 SDS-PAGE |
| 无水甲醇，试剂级 | American MasterTech Scientific | SPM1057C | 用于转膜的甲醇 |
| 氯化钠 (NaCl)，ACS 试剂 | Sigma-Aldrich | S9888 | 用于生理盐水和缓冲液 |
| 脱脂奶粉粉末 | Carnation | n/a | 用于免疫印迹 |
| 5% 乙酸中的 Ponceau S 溶液 | Sigma-Aldrich | P7170 | 用于免疫印迹 |
| 抗酪氨酸羟化酶 (TH) 抗体，绵羊多克隆 | Chemicon/Millipore | AB1542 | 用于免疫荧光 |
| 抗酪氨酸羟化酶 (TH) 抗体，兔多克隆 | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | 用于免疫印迹 |
| 抗-β 肌动蛋白抗体，兔 | Sigma-Aldrich | A2066 | 用于免疫印迹 |
| 抗胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 抗体，兔多克隆 | Chemicon/Millipore | AB5804 | 用于免疫荧光 |
| 抗胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 抗体，小鼠单克隆 | Covance Inc. | SMI-22R | 用于免疫印迹 |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 用于免疫印迹 |
| 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG (H+L) | Fisher Scientific | 31462 | 用于免疫荧光 |
| 辣根过氧化物酶标记山羊抗绵羊抗体 | Pierce/Thermo | 31480 | 用于免疫荧光 |
| 辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体 | Pierce/Thermo | 31430 | 用于免疫荧光 |
| SuperSignal West Pico 化学发光底物 | Pierce/Thermo | 34078 | 用于免疫印迹 |
| CL-XPosure 胶片 7 英寸 × 9.5 英寸 | Pierce/Thermo | 34089 | 用于免疫印迹 |
| Restore Western Blot 剥脱缓冲液 | Pierce/Thermo | 21059 | 用于免疫印迹 |
| 柠檬酸一水合物，ACS 试剂，≥99.0% | Sigma-Aldrich | C1909 | 用于免疫组化 |
| 正常驴血清 | Millipore | S30-100ML | 用于免疫组化 |
| 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) | Sigma-Aldrich | P5288 | 用于免疫组化 |
| 牛血清白蛋白 (BSA)，冻干粉 | Sigma-Aldrich | A3294 | 用于免疫组化 |
| 曲拉通 X-100 | Fisher Scientific | BP151-01 | 用于免疫组化 |
| 驴抗兔 IgG，Alexa Fluor 568 标记 | Invitrogen/Life Technologies | A10042 | 用于免疫组化 |
| 驴抗绵羊 IgG (H+L)，FITC 标记 | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | 用于免疫组化 |
| 含 DAPI 的 VECTASHIELD 硬封片剂 | Vector Laboratories | H-1500 | 用于免疫组化 |
| 正常山羊血清 | Millipore | S26-100ML | 用于免疫组化 |
| VECTASTAIN ABC 试剂盒（兔 IgG） | Vector Laboratories | PK-4001 | 用于免疫组化；每 1 ml PBS 中加入溶液 A 和 B 各 10 µl（按说明书操作） |
| DAB 过氧化物酶底物试剂盒，3,3’-二氨基联苯胺 | Vector Laboratories | SK-4100 | 用于免疫组化；每 5 ml 冷 ddH2O，加入 2 滴缓冲液原液、2 滴 DAB 和 1 滴 H2O2（H2O2 在使用前立即加入） |
| 过氧化氢，30% | Sigma-Aldrich | 216763 | 用于免疫组化中的淬灭步骤 |
| 兔抗 Iba1 抗体 | Biocare Medicals | CP290A | 用于免疫组化 |
| 焦油紫溶液，常规浓度 | FD Neurotechnologies | PS102-01 | Iba1 免疫组化的复染剂 |
| 95% 乙醇，试剂级乙醇 | Sigma-Aldrich | R8382 | 用于免疫组化的脱水 |
| 100% 无水乙醇 | Mallinckrodt | 7019-10 | 用于免疫组化的脱水 |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | A6283 | 用于免疫组化的褪色 |
| 二甲苯 | Sigma-Aldrich | 534056 | 用于免疫组化的透明剂 |
| DPX 封片剂 | Sigma-Aldrich | 06522 | 用于 DAB 免疫组化的封片介质 |
| O.C.T. 包埋剂 — 冷冻切片包埋介质 | American MasterTech Scientific | EMOCTCS | 用于冰冻切片的包埋介质 |
| 高锰酸钾 | Sigma-Aldrich | 223468 | 用于 DAB 溶液的去污染 |
| 多巴胺盐酸盐 | Sigma-Aldrich | H8502 | 用于 HPLC |
| 3,4-二羟基苯乙酸 (DOPAC) | Sigma-Aldrich | 850217 | 用于 HPLC |
| 高香草酸 (HVA) | Sigma-Aldrich | H1252 | 用于 HPLC |
| 高氯酸 (PCA) - 70% | Sigma-Aldrich | 244252 | 用于 HPLC |
| 磷酸二氢钠一水合物 | Sigma-Aldrich | 71504 | 用于 HPLC |
| 柠檬酸一水合物 | Sigma-Aldrich | C1909 | 用于 HPLC |
| 1-辛烷磺酸钠 (OSA) | Sigma-Aldrich | O8380 | 用于 HPLC |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | 用于 HPLC |
| 乙腈 | EMD | AX0145-1 | 用于 HPLC |
| HPLC 级去离子水 (ddH2O) | Millipore | 用于 HPLC | |
| 0.22 µm GSTF 膜 | Millipore | 用于过滤 | |
| Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | 带聚酯网底的聚苯乙烯插入件，用于免疫组化 |
| 超声细胞破碎仪 (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5414R | |
| ESA MD-150 反相色谱柱 | ESA | ||
| HPLC 泵 (Ultimate 3000) | Dionex | ISO-3100BM | |
| HPLC 自动进样器 (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | |
| 电化学检测器 | ESA | Coulochem III | |
| 保护柱 | ESA | 5020 | |
| 分析柱 | ESA | 5011A | |
| Chromeleon 软件 | Dionex | ||
| Eclipse E400 | Nikon | E400 | 明场/荧光显微镜 |
| 一次性小鼠笼 | Ancare | N10HT | |
| 微滤顶盖 | Ancare | N10MBT | |
| 5-LOX 缺陷型小鼠 | The Jackson Laboratory | 004155 | |
| 12/15-LOX 缺陷型小鼠 | The Jackson Laboratory | 002778 |
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