方法文章

基因-环境相互作用模型揭示帕金森病易感机制

7.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/50960

⸱

2014年1月7日

 ,  ,  , 
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

本文内容

摘要

脂氧合酶（LOX）同工酶可生成可能增强或减弱神经炎症与神经变性的产物。 通过基因-环境相互作用研究，可识别特定LOX同工酶的作用。利用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的黑质纹状体损伤模型，在两种LOX同工酶缺陷的转基因小鼠品系中，可比较LOX同工酶对多巴胺能完整性和炎症反应的贡献。

摘要

脂氧合酶（LOX）活性被认为与阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关，但其在帕金森病（PD）发病机制中的作用尚不明确。基因-环境相互作用模型有助于揭示特定细胞通路在毒性中的影响，而仅使用遗传模型或单纯毒物模型可能无法观察到这些影响。 为了评估不同的LOX同工酶是否选择性地参与PD相关的神经退行性变，可对转基因（i.e. 5-LOX和12/15-LOX缺陷型）小鼠施加一种模拟该疾病中细胞损伤与死亡的毒素。 本文描述了一种神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）的应用，该毒素可诱导黑质纹状体损伤，以阐明不同LOX同工酶在PD相关神经退行性变中的特异性作用。在小鼠和非人灵长类动物中使用MPTP已得到广泛验证，能够有效模拟PD中的黑质纹状体损害。 MPTP诱导的损伤程度通过高效液相色谱法（HPLC）检测多巴胺及其代谢产物，并结合对纹状体组织进行酪氨酸羟化酶（TH）——即多巴胺合成限速酶——的半定量Western印迹分析来评估。为评估可能体现LOX同工酶选择性敏感性的炎症标志物，对包含黑质的脑切片进行胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和Iba-1免疫组织化学染色，并对纹状体匀浆样本进行GFAP的Western印迹分析。 该实验方法可为揭示黑质纹状体变性及帕金森病背后基因-环境相互作用提供新的见解。

引言

基因-环境相互作用模型的使用提供了一种模拟可能影响特发性帕金森病（PD）风险因素的方法，并为揭示单独使用遗传或毒性系统难以阐明的机制性见解提供了机会1,2。本文阐述了这一观点，并描述了1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）小鼠黑质纹状体变性模型3 的应用，以更深入地理解脂氧合酶（LOX）同工酶活性在神经炎症和神经毒性中的选择性作用4。尽管LOX同工酶在多种外周疾病5,6以及中枢神经系统疾病（如脑卒中7和阿尔茨海默病8,9）中的作用已被广泛研究，但该同工酶家族在与PD相关的黑质纹状体功能及变性中的作用尚不明确，亟需进一步研究。MPTP神经毒素可选择性地导致黑质纹状体通路退变，并重现PD患者中出现的纹状体多巴胺耗竭及黑质多巴胺能神经元丢失，这些是运动功能障碍的基础10。尽管该模型无法完全复制PD患者全部的非运动和运动行为表现，也无法形成明确的α-突触核蛋白阳性路易小体病理改变，但它已被证明在揭示导致黑质纹状体损伤的新机制靶点以及早期转化研究中具有重要价值，是目前最成熟、可重复诱导黑质神经元死亡并伴随纹状体多巴胺减少的非侵入性模型11-15。MPTP小鼠模型已被广泛应用，其处理方案涵盖急性、亚急性和慢性等多种范式16-18，使得剂量标准化成为可能，从而诱导轻度至重度的黑质纹状体损伤19,20 ，并根据不同的处理方案激活不同的毒性机制18,21,22。因此，该模型允许针对特定的“损伤窗口”进行干预，根据所使用的治疗药物或转基因模型的不同，可导致黑质纹状体损伤的增强或减轻23-25。

对于转化研究和发现生物学研究而言，用于评估损伤的方法及其所提供的证据同样至关重要。 在MPTP小鼠模型中，评估损毁的既定指标包括通过高效液相色谱法（HPLC）检测纹状体多巴胺能张力的标志物（如多巴胺及其代谢产物），以及通过蛋白质印迹法（Western blot）分析多巴胺合成的限速酶——酪氨酸羟化酶（TH）的表达水平，并结合蛋白质印迹法和免疫组织化学方法检测胶质细胞活化等变性事件的指标4。 尽管这些属于经典的神经化学、生物化学和组织学实验方法，但它们能够对黑质-纹状体多巴胺能通路损伤程度提供关键且可重复的检测结果，有助于揭示毒性作用机制，并已被证明是研究帕金森病（PD）中神经变性过程的有力工具。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：所有动物实验操作和动物护理方法均须经机构的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。本文所述研究是根据SRI International的IACUC所制定的指南进行的。

1. LOX 缺陷型小鼠的获取与保种

  1. 购买5-LOX缺陷型或12/15-LOX缺陷型小鼠，以及相应品系和性别匹配的对照小鼠，年龄为7–8周，在到达后给予数天时间适应设施环境。
  2. 将小鼠以群体饲养方式置于12小时光照-12小时黑暗循环环境中，并提供食物和饮用水 随意摄取.

2. MPTP 的注意事项、储存、配制、去污与处置

注意：人类静脉接触MPTP已被证实可导致帕金森综合征10；MPTP具有高度脂溶性，可迅速通过血脑屏障26。应采取预防措施，确保其安全操作、去毒及处置。MPTP的代谢过程涉及多个步骤，包括通过单胺氧化酶B（MAO-B）将其转化为1-甲基-4-苯基-2,3-二氢吡啶27。在发生意外人体中毒的情况下，可使用MAO-B抑制剂进行干预。

  1. 在使用MPTP之前，确保相关人员已根据机构健康与安全委员会的规定接受适当的安全和操作培训。各机构可根据文献中全面阐述的建议制定并实施自身关于MPTP使用的标准操作程序17,22。
  2. 准备前应穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括以下物品：一次性实验服或全身防护服、双层腈手套、外科口罩、头罩、护目镜和一次性鞋套。在配制MPTP、实施注射方案以及注射后72小时内接触动物和/或垫料时，均应正确穿戴个人防护装备。
  3. 在配制前进行计算。应遵循机构规定的给药体积指南；通常对25–30 g小鼠给予100–150 µl。
    1. 为配制生理盐水中含3 mg/ml MPTP的溶液，需应用校正因子（1.211 MPTP-HCl : 1.0 MPTP游离碱）；因此生理盐水载体中MPTP-HCl的浓度为3.633 mg/ml。
    2. 在接触神经毒素前，准备好MPTP配制所需的所有设备、耗材和试剂，以及可能的泄漏去污用品。
  4. 从适当的储存位置取出MPTP-HCl原液小瓶。
    注意：MPTP应保存在室温下，原液小瓶应密闭置于次级容器中，并存放于贴有“MPTP”标签的上锁柜内。
    1. 用浸有10%次氯酸钠溶液的垫子或纸巾覆盖天平周围区域，以降低粉末洒落的风险。将纸巾和10%次氯酸钠溶液置于附近以备不时之需。
    2. 在通风橱内的分析天平上，将50 mg MPTP-HCl称量至带有次级容器的玻璃小瓶中，次级容器内应含有浸透10%次氯酸钠溶液的组织纸。用“MPTP”标签标明玻璃小瓶，并注明浓度和日期。
    3. 关闭原液小瓶，并用10%次氯酸钠溶液擦拭其外表面。
  5. 缓慢向小瓶中加入13.763 ml无菌生理盐水，完全封闭后混匀。（溶液为3.633 mg/ml MPTP-HCl。）
    1. 在通风橱内，使用0.22 µm滤器将MPTP溶液过滤除菌，滤入置于次级容器中的已标记注射小瓶内，次级容器中应含有浸透10%次氯酸钠溶液的组织纸。如有洒落，立即用浸有次氯酸钠的纸巾清理。
    2. 小心将锐器和小瓶丢弃至贴有适当标签的生物危害容器中。将MPTP溶液小瓶保留在含浸透次氯酸钠组织纸的次级容器中，以便转运至动物实验操作室。
      注意：不得对MPTP溶液进行高压灭菌，因其蒸气具有吸入性危害。
  6. 将MPTP原液小瓶放回其次级容器，并归还至储存位置。使用10%次氯酸钠溶液对药匙、分析天平和通风橱表面去污处理10分钟。

3. MPTP 给药

  1. 准备一次性笼具，配备标准微隔离穿孔盖，内含标有“MPTP”的聚酯过滤垫层（不带金属丝食物格栅）、一次性笼垫、预湿食物颗粒以及水凝胶作为水源。称量所有动物体重，并记录为达到15 mg/kg注射剂量所需的3 mg/ml MPTP生理盐水溶液的体积。
    注意：MPTP代谢物在注射后3天内可在排泄物中检测到28,29；然而，小鼠主要排泄MPTP-N-氧化物，这是一种由于亲水性而无法穿过细胞膜的无毒代谢产物30。
    1. 穿戴上述全部个人防护装备（PPE），将小鼠置于一次性吸水垫上方，使用一次性26号结核病注射器每日一次经腹腔（i.p.）注射生理盐水对照液或MPTP溶液（15 mg/kg剂量），连续注射4天。
    2. 使用后切勿重新盖上针帽；应将注射器直接丢弃至专用且明确标识的MPTP生物危害锐器容器中。操作区域附近应备有10%次氯酸钠溶液和擦拭纸巾，以便及时清理任何意外滴漏。
  2. 将注射MPTP的小鼠置于一次性笼具中饲养，每笼最多5只，放置于开放式笼架上。禁止使用通风笼架。
    1. 在饲养小鼠的笼架及房间门口放置MPTP使用警示标识，直至末次注射后72小时。
      注意：确保饲养室温度维持在22.2 - 24.4oC之间，因为小鼠在MPTP中毒后可能出现持续长达12小时的短暂性低体温31。
    2. 每次使用后均需用次氯酸钠溶液对工作台面进行去污处理（参见步骤2.8），剩余MPTP溶液应加入等体积的10%次氯酸钠溶液进行灭活，并作为生物危害液体废物丢弃。
    3. 所有使用过的个人防护装备应丢弃至专用废弃物容器中；必要时，丢弃前可喷洒10%次氯酸钠溶液进行表面消毒。
  3. 在注射期间及末次注射后72小时内，应定期检查动物状况，并每日更换食物和水源。注意：尽管预计笼具外部周围区域不会发生污染，但为安全起见，该区域仍应按步骤2.8所述使用次氯酸钠溶液进行处理。在此期间操作所有小鼠及设备时均需格外小心。
    1. 末次注射后第三天，将所有使用过的一次性笼具及垫层投入正确标识的生物危害垃圾袋中丢弃。此后可恢复常规个人防护装备的使用及正常饲养条件；同时移除门上和架子上的警示标识。

4. 组织采集

  1. 在最后一次MPTP注射后7天，通过颈椎脱位法处死动物。立即在冰上使用预冷的具有1毫米冠状切槽的脑模具进行脑组织解剖。
  2. 从位于前连合水平的2毫米厚前脑切片中分离出纹状体。
    1. 使用解剖刀去除周围的皮层及皮层下区域。将每侧半球的纹状体组织分别放入1.5 ml离心管中，迅速冷冻，用于神经化学或生化分析。
  3. 在下丘脑前部水平处，将中脑/后脑以冠状面切块，并浸入4%甲醛水溶液中固定组织。

5. 组织处理

  1. 生化处理流程
    1. 使用超声波细胞破碎仪，在 200 µL 裂解缓冲液（25 mM Tris 碱，1 mM EDTA，1:100 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物）中对单侧半球纹状体组织进行匀浆，以 10–12 Hz 频率进行 10 次脉冲处理，随后在 4oC 条件下以 1000xg 离心 10 分钟。
    2. 小心吸除上清液，并将沉淀物重悬于 150 µL 裂解缓冲液中。所得组分用于 SDS-PAGE 和 Western 印迹法进行生化分析。
      注意：由于蛋白酶和磷酸酶抑制剂在水溶液中不稳定，含此类抑制剂的缓冲液应在配制后 1 小时内使用。
  2. 神经化学处理流程
    1. 取每份样品另一侧半球分离出的纹状体组织（储存于 -80°C），用于高效液相色谱（HPLC）分析。将纹状体组织在冰上置于微量离心管中解冻，加入 500 µL 0.3 N 高氯酸（PCA），并使用超声破碎仪进行匀浆。
      注意：配制 100 mL 0.3 N PCA 时，量取 90 mL ddH2O 加入 100 mL 量筒中，加入 2.58 mL 70% 高氯酸，再加水至 100 mL 刻度线。该样品缓冲液可在 4°C 下保存最多一个月。
    2. 在 500 µL 冰冷的 0.3 N PCA 中对纹状体组织进行超声处理，以 10–12 Hz 频率进行 10 次脉冲，随后置于冰上。为确保样品均一性，再次超声处理 10 秒，然后在 4oC 条件下以 16,100xg 离心 12 分钟。
    3. 立即小心倾出上清液至 1.5 mL 微量离心管中，并于 -80°C 保存。将沉淀组分在通风橱中空气干燥。
    4. 将上清液保持在 -80°C，直至用于高效液相色谱电化学检测法测定多巴胺及其代谢产物：3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）。
    5. 干燥后，将沉淀组分重悬于 0.5 N NaOH（500 µL）中，并短暂超声处理。将重悬后的沉淀组分在 4°C 保存，用于后续采用 Lowry 法测定总蛋白含量。
  3. 免疫组织化学处理流程
    1. 将中脑和后脑组织块在 4% 甲醛水溶液中浸泡固定过夜，随后在梯度蔗糖溶液中进行冷冻保护（先在磷酸盐缓冲液（0.01 M PBS；0.138 M NaCl，0.0027 M KCl，ddH2O，pH 7.4）中含 10% 蔗糖的溶液中 4°C 孵育 24 小时，再转入含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中直至组织下沉）。将经冷冻保护的组织块轻轻吸干以去除多余蔗糖溶液，置于干冰上速冻，之后在 -80°C 保存备用。
    2. 在冷冻切片机中对包含中脑和后脑的脑组织块进行切片。
      1. 将组织从 -80°C 取出，在冷冻切片机中 -16°C 平衡 1 小时，然后包埋于组织包埋介质中。
      2. 在 -16°C 条件下，以 40 µm 厚度收集冠状切片至冷冻保护液（含 30% 蔗糖、30% 乙二醇的 0.01 M PBS，pH 7.4）中。按 240 µm 间隔将组织连续切片收集至 6 个 1.5 mL 微量离心管中，并于 -20°C 保存。

6. 免疫印迹

  1. 采用BCA法测定纹状体上清组分（按5.1节所述方法制备）中的蛋白质浓度。
  2. 计算每个样本所需的稀释倍数，以在20 µl体积中每孔加入10 µg蛋白。
  3. 用4X Laemmli缓冲液和匀浆缓冲液稀释上清液中的蛋白质，使终浓度为10 µg蛋白质溶于1X Laemmli缓冲液中。示例计算：
    1. 确定蛋白质的终浓度和所需体积。本实验中需要 10 µg 蛋白质，体积为 20 µl（0.5 mg/ml）。
    2. 确定所需蛋白质溶液的最终体积。虽然上样需要 20 µl，但应额外准备体积（共 30 µl）。
    3. 由于最终体积和浓度已知，且蛋白质上清液组分的浓度已知（通过BCA测定法确定），可使用以下公式计算所需的蛋白质上清液体积：
      V上清液 = (V最终 x C最终)/C 上清液
      因此，当上清液蛋白质浓度为 1.5 mg/ml 时，
      V上清液 = (30 µl × 0.5 mg/ml) / 1.5 mg/ml
      V上清液 = 10 µl
    4. 计算所需4X Laemmli缓冲液体积，以使终体积为30 µl时浓度为1X（30 µl / 4 = 7.5 µl）。注意：样品制备中必须将4X Laemmli缓冲液稀释至1X浓度。
    5. 计算所需匀浆缓冲液的体积，以使总体积达到 30 µl（并获得 0.5 mg/ml 的目标终蛋白浓度）：
    6. 将蛋白上清液涡旋混匀，取10 µl加入12.5 µl裂解缓冲液中。加入7.5 µl 4X Laemmli缓冲液，制成终体积为30 µl、蛋白浓度为0.5 mg/ml的工作溶液。
  4. 使用所述方法制备所有样品，涡旋混匀后煮沸5分钟。
    注意：使用带螺旋盖的微量离心管，以防止在煮沸过程中因压力导致泄漏或管盖开启。
  5. 5分钟后立即置于冰上。每孔上样20 µl工作液（含10 µg蛋白质）。使用12% Tris-甘氨酸凝胶通过SDS-PAGE分离蛋白质样品。
    1. 使用预染蛋白质分子量标准品以确认分子量。电泳缓冲液为 25 mM Tris-碱，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS 和 ddH₂O。2O，pH 8.3。
    2. 通过电泳分离蛋白质：首先以80 V电压运行10分钟，使样品脱离加样孔；随后以125 V电压继续运行约1小时，直至蛋白ladder完全分开。
  6. 使用0.2 µm硝酸纤维素膜，在Tris-甘氨酸转移缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.04% SDS，20% 甲醇和ddH₂O）中进行蛋白质向硝酸纤维素膜的转膜2O，pH 8.3）在4°C下以40 V电泳过夜。
  7. 用1x Tris生理盐水（TS；25 mM Tris，0.9% NaCl，溶于ddH₂O）洗涤硝酸纤维素膜2O，pH 7.4）中室温孵育10分钟。加入Ponceau S染色液孵育5分钟，然后用ddH₂O漂洗。2O 以粗略验证蛋白质上样量是否均等。扫描图像以留存实验记录，随后用 PBS 脱色。
    注意：也可将印迹膜置于含 HCl（0.2%）的 Milli-Q 或 ddH2O 中洗涤约 5 分钟，扫描留档。随后通过孵育步骤（即放入封闭缓冲液中）去除膜上的 Ponceau S 染色。
  8. 在室温下用含5%脱脂奶粉的TS缓冲液封闭1小时，然后在4ºC用兔抗酪氨酸羟化酶抗体（1:1000）孵育24小时，抗-β-肌动蛋白（1:200）；抗GFAP（1:1000）置于5%脱脂奶粉-TS中
  9. 用含0.05% Tween-20的TS缓冲液洗涤印迹膜3次，每次5分钟，再用TS缓冲液洗涤1次，每次5分钟；然后在室温下用HRP标记的二抗（按1:5000比例溶于含5%脱脂奶粉的TS缓冲液中，二抗种类需与一抗宿主物种相匹配）孵育2小时。
  10. 使用等体积的鲁米诺溶液和过氧化物溶液配制化学发光底物，孵育1-3分钟。在暗室中，将印迹膜置于塑料膜袋内进行X光片曝光，随后使用自动显影仪显影。
  11. 使用商用剥离缓冲液在37°C下剥离印迹膜30分钟，用含0.05% Tween-20的TS缓冲液洗涤3次，每次10分钟，再用TS缓冲液洗涤1次，每次10分钟，然后重新孵育内参蛋白或其他目标蛋白的一抗。
  12. 使用 Image J 软件对信号进行定量分析以测定光密度，并相对于内参上样对照进行归一化处理 β–肌动蛋白

7. 神经化学

  1. 用于分析的组织按第5.2节所述方法制备。流动相配方请参见表1。
    注意：所有试剂纯度必须≥99.0%，且为HPLC级。使用洁净、专用的玻璃器皿和搅拌子以确保缓冲液的完整性。流动相缓冲液应在配制后七天内使用。
    1. 称取二氢磷酸盐和柠檬酸，加入1 L ddH₂O2O，并在2 L量筒中混合。通过0.22 µm GSTF滤膜过滤溶液。
      注意：这可以最大程度地利用磷酸和柠檬酸提取污染物，有助于最小化背景电流。
    2. 加入OSA，随后加入乙腈和EDTA溶液。加入HPLC级ddH₂O。2O至约1900 ml，再用磷酸调节pH至3.0。
    3. 加入HPLC级ddH₂O2加水至2 L刻度线，然后倒入2 L烧瓶中。加入专用搅拌子，在真空条件下搅拌以对流动相进行脱气 > 10 分钟
  2. 制备多巴胺、DOPAC 和 HVA 的标准品溶液以绘制标准曲线。标准品储备液用 0.3 N PCA 配制成 1 mg/ml。
    1. 称取 12.4 mg 多巴胺盐酸盐（dopamine-HCl），加入 10.0 ml 0.3 N 高氯酸（PCA），配制成 1 mg/ml 的多巴胺溶液。
    2. 称取 10.0 mg DOPAC，加入 10.0 ml 0.3 N PCA，配制成 1 mg/ml 的 DOPAC 溶液。
    3. 称取 10.0 mg HVA，加入 10.0 ml 0.3 N PCA，配制成 1 mg/ml HVA 溶液。
  3. 从储备液配制工作标准溶液。采用五点标准品绘制浓度曲线。
    1. 为测量纹状体多巴胺含量，配制标准浓度分别为 12.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml 和 200 ng/ml 的标准品。
    2. 对于纹状体 DOPAC，配制标准浓度分别为 2.5 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml 和 40 ng/ml 的标准品。
    3. 对于纹状体HVA，配制标准浓度分别为5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml和80 ng/ml的溶液。
    4. 配制五点标准品：使用0.3 N PCA将1 mg/ml多巴胺储备液稀释至5 µg/ml；使用0.3 N PCA将1 mg/ml DOPAC储备液稀释至1 µg/ml；使用0.3 N PCA将1 mg/ml HVA储备液稀释至2 µg/ml。
    5. 将1 ml浓度为5 µg/ml的多巴胺、1 ml浓度为1 µg/ml的DOPAC和1 ml浓度为2 µg/ml的HVA转移至25 ml容量瓶中，用0.3 N PCA定容至25 ml刻度线。
      注意：容量瓶中的混合标准品包含五点标准品中的最高浓度，即多巴胺 200 ng/ml、DOPAC 40 ng/ml 和 HVA 80 ng/ml。
    6. 将1 ml混合标准品转移至洁净的1.5 ml微量离心管中。进行1:1倍比稀释，连续四次，以制备后续的四点标准品。
      1. 例如，向250 μl混合标准品中加入250 μl样品缓冲液，充分涡旋混匀，得到原浓度50%的混合标准品；重复该步骤直至获得所需稀释倍数。
  4. 准备高效液相色谱系统（泵、自动进样器、反相色相柱（C18，150×3.2 mm，3 µm））。用新鲜流动相冲洗泵，以置换高效液相色谱系统中所有先前的溶液和截留的气泡。将自动进样器冷却至4°C。将色谱柱预热至35°C，以降低系统总压力。
    1. 将电化学检测器的第一个和第二个电极的电压分别设置为 -150 mV 和 220 mV。以流动相在 0.2 ml/min 的流速下平衡系统至少 2 小时，理想情况下过夜平衡。
      注意：平衡期间，应保持细胞处于开启状态，并监测基线读数。当读数稳定时，表明系统已准备就绪。在两小时的平衡阶段内，让流动相流入废液容器，而不是循环使用。此阶段结束后，流动相可在过夜平衡时进行回收再利用。
    2. 平衡完成后，将流动相流速调节至 0.6 ml/min。分别进样 20 µl 的五点标准品溶液。
  5. 将纹状体样本在冰上解冻，每份样本向高效液相色谱（HPLC）系统中注射2次，每次20 µl。在每批纹状体样本分析开始时以及过程中随机插入标准品进行检测。
  6. 使用软件分析多巴胺、DOPAC 和 HVA 标准品及样品色谱峰的峰面积。通过保留时间鉴定待测物，并将峰面积与相应标准品的五点标准曲线进行比较以定量。
  7. 按照第5.2.3节所述制备沉淀组分。对纹状体沉淀进行Lowry蛋白测定。注意：该测定将测量纹状体样品中蛋白质的含量（单位为mg/ml）；该信息用于确定分析物的浓度（单位为ng/mg）。

8. 免疫组织化学

  1. GFAP/TH 双重免疫荧光染色
    1. 从 -20°C 冰箱中取出含有切片中脑的试管，恢复至室温。在含有 PBS 的托盘中，将包含黑质的组织切片从冷冻保护液中取出。
    2. 将组织切片置于底部带有聚酯网的聚苯乙烯插入物中，用于游离漂浮免疫染色。用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
    3. 将切片转移至 96 孔板中，每孔加入 180 µl 封闭液（含 5% 正常驴血清、1% 聚乙烯吡咯烷酮、1% 牛血清白蛋白和 0.3% Triton X-100 的 PBS 溶液）。在室温下孵育 40 分钟。
      注意：所有洗涤和孵育步骤均在摇床上进行轻度振荡。
    4. 将切片转移至含有初级抗体溶液的孔中（每孔 180 µl）。在 4°C 下孵育 24 小时，使用兔抗 GFAP 抗体（1:1000）和羊抗 TH 抗体（1:400）的混合液，该混合液用含 1% BSA 和 0.3% TX-100 的 PBS 稀释。初级抗体来源物种的 IgG 作为阴性免疫染色对照。
    5. 在室温下用二抗混合液（1:200 驴抗兔 568 和 1:200 FITC 标记的驴抗羊抗体，溶于含 0.1% TX-100 的 PBS 中）孵育 2 小时。配制和孵育过程中需用铝箔包裹以避光。
      1. 作为阴性对照，将切片与初级抗体来源物种的 IgG 孵育，其稀释浓度与初级抗体相同。
      2. 在室温下用 PBS 洗涤 2 次、TS 洗涤 1 次，每次 5 分钟。将组织切片用含 Hoechst 染料的封片剂封固于正电荷载玻片上，并加盖盖玻片。
    6. 在室温下用二抗混合液（1:200 驴抗兔 568 和 1:200 FITC 标记的驴抗羊抗体，溶于含 0.1% TX-100 的 PBS 中）孵育 2 小时。配制和孵育过程中需用铝箔包裹以避光。
    7. 在室温下用 PBS 洗涤 2 次、TS 洗涤 1 次，每次 5 分钟。将组织切片用含 Hoechst 染料的封片剂封固于正电荷载玻片上，并加盖盖玻片。
    8. 将载玻片避光并防止氧化，存放于 4°C 的载玻片盒中，直至成像。
    9. 首先分析阴性对照以确定背景荧光水平，然后使用荧光显微镜评估阳性免疫反应性。
  2. Iba1 免疫组织化学染色（显色沉淀法）
    1. 从 -20°C 冰箱中取出含有切片中脑的试管，恢复至室温。在含有 PBS 的托盘中，将包含黑质的组织切片从冷冻保护液中取出。
    2. 将组织切片置于聚苯乙烯插入物中，用于游离漂浮免疫染色。用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，然后直接将切片转移至含有预热至 80°C、pH 9.0 的 10 mM 一水柠檬酸溶液的 12 孔板中，进行抗原修复，孵育 30 分钟。
    3. 在室温下冷却 20 分钟。将切片重新放回插入物中，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
    4. 将切片转移至 96 孔板中，每孔加入 180 µl 封闭液（含 10% 正常山羊血清和 1% BSA 的 PBS 溶液），在室温下孵育 40 分钟。
    5. 将切片转移至含有 180 µl 稀释初级抗体（1:1000，溶于含 1% BSA 的 PBS 中）的孔中，在 4°C 下过夜孵育。
    6. 将切片转移回插入物中，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，然后在室温下用生物素化二抗（1:200，溶于含 1.5% 正常血清的 PBS 中）孵育 1 小时。
    7. 在使用前 30 分钟配制 ABC 溶液。用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，然后将切片转移至 ABC 溶液中，在室温下孵育 1 小时。
    8. 在通风橱中配制 DAB 溶液。用 PBS 洗涤 2 次、每次 5 分钟，再用 TS 洗涤 1 次、5 分钟，然后将切片置于 DAB 溶液中孵育。
      1. 显色 3–4 分钟。阴性对照应保持浅色。
        注意：此步骤应在通风橱中进行，因为 DAB 是已知致癌物。应准备 0.2 M 高锰酸钾的 ddH2O 溶液用于去污，以防意外滴漏。
    9. 用 ddH2O 快速漂洗切片，然后用 TS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。将切片封固于正电荷载玻片上，在通风橱中过夜风干。
    10. 用等体积的 0.2 M 高锰酸钾 ddH2O 溶液对 DAB 废液进行去污处理，涡旋混匀，并在通风橱中过夜孵育后，再转移至通风橱内贴有适当标签的 DAB 废液桶中。
      注意：漂白液不能消除 DAB 的致突变性。
      1. 对需重复使用的物品（如聚苯乙烯插入物）进行去污处理，并用洗涤剂清洗。
    11. 用焦油紫（CV）进行轻度脱水和复染。所有脱水/洗涤步骤均为 3 分钟：70% 乙醇、95% 乙醇、100% 乙醇、95% 乙醇、ddH2O、CV（30 秒）、ddH2O × 2、95% 乙醇 + 冰醋酸（0.1%）× 2、100% 乙醇和二甲苯。
    12. 用二乙烯-甲苯-二甲苯封片剂封片，并在通风橱中干燥。
    13. 使用光学显微镜观察阳性免疫反应性。初级抗体来源物种的 IgG 作为阴性免疫染色对照。

9. 统计学

  1. 采用单因素方差分析（ANOVA）评估各均值间的差异，以比较不同基因型之间的差异；采用双因素方差分析（ANOVA）比较基因型与毒物处理之间的差异。当方差分析检测发现差异时（p≤0.05），采用Tukey HSD事后检验进行进一步分析。
    注意：每个实验（每组 n = 6–9 只小鼠）至少重复两次，以确保结果可重复。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

这种毒素暴露范式可在MPTP注射动物与生理盐水注射动物之间产生显著且可检测的纹状体多巴胺减少20%。需要注意的是，不同批次的MPTP可能导致略高或略低的损伤程度；因此，当使用新的神经毒素批次时，建议在转基因动物实验前先在野生型小鼠中进行预实验，以获得更精确的结果。采用轻度至中度的损伤模型有助于观察转基因的影响；而重度损伤可能产生“平台效应”，即损伤过于强烈而无法被缓解，或损伤过于严重从而掩盖有害基因改变的作用。在5-LOX同工酶缺陷小鼠中，MPTP对纹状体多巴胺的影响具有显著差异，但在12/15-LOX同工酶缺陷小鼠中则无显著差异（图1）。此外，通过这些方法，我们还能够发现生理盐水处理的小鼠因5-LOX缺陷而导致的多巴胺水平显著差异（图1）。

通过免疫印迹检测TH和GFAP，分别证实了野生型小鼠纹状体水平的损伤和神经炎症，而在5-LOX同工酶缺陷型小鼠的纹状体中，该效应减弱图3A 和 3B）。该病变在黑质水平亦可辨识。图 2A

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本基因-环境相互作用研究的设计使我们获得了关于5-LOX同工酶在黑质纹状体通路中双重性质的新信息。 通过对缺乏5-LOX同工酶的转基因小鼠及其野生型同窝小鼠在生理盐水或MPTP处理后采用高效液相色谱法（HPLC）测定纹状体单胺类神经递质水平，我们发现，在毒性条件下，5-LOX的缺失具有保护作用（图1）；但在正常条件下，该酶的缺失会降低纹状体多巴胺水平，可能产生不利影响。 因此，我们证明了5-LOX同工酶在正常条件下有助于维持纹状体多巴胺能张力，但在接触毒性物质后可能参与神经损伤过程4。

尽管需要进一步评估以深入了解LOX同工酶在黑质纹状体毒性中的作用机制，但蛋白质印迹分析（图3）以及免疫组织化学研究（图2）显示，在暴露于MPTP的5-LOX同工酶缺陷型小鼠群体中，神经炎症标志物至少在一定程度上有所减弱。 这些采用经典生物化学与组织学技术所得的结果表明，5-LOX代谢产物在增强小胶质细胞和星形胶质细胞活化过程中发挥着关键作用

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）下属国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助，项目编号 056062。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐 (MPTP-HCL)Sigma-AldrichM0896用于帕金森病建模
4% 甲醛（多聚甲醛）磷酸盐缓冲液 (PFA)American MasterTech ScientificBUP0157用于浸没固定
高氯酸 ACS 试剂，70% (PCA)Sigma-Aldrich244252用于 HPLC 酸提取
Tris 碱Sigma-AldrichT1503用于组织匀浆
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 (EDTA)Sigma-AldrichE1644用于组织匀浆
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP8340用于组织匀浆
磷酸酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP5726用于组织匀浆
氢氧化钠 (NaOH)Sigma-AldrichS5881用于 Lowry 蛋白测定
蔗糖，分子生物学级，≥99.5% (GC) Sigma-AldrichS0389用于冷冻保护
磷酸盐缓冲液粉末，pH 7.4（用于 0.01 M PBS）Sigma-AldrichP3813用于免疫组化
BCA 蛋白检测试剂盒Pierce/Thermo23225用于蛋白定量
Novex 12% Tris-甘氨酸迷你胶 1.0 mm，12 孔Invitrogen/Life TechnologiesEC60052BOX用于 SDS-PAGE
NuPAGE LDS 上样缓冲液 (4x)Invitrogen/Life TechnologiesNP0007用于 SDS-PAGE
Novex Sharp 预染蛋白标准品 Invitrogen/Life TechnologiesLC5800蛋白分子量标记
甘氨酸Sigma-AldrichG7126用于 SDS-PAGE
十二烷基硫酸钠，电泳级，98.5% (SDS)Sigma-AldrichL3771用于 SDS-PAGE
无水甲醇，试剂级 American MasterTech ScientificSPM1057C用于转膜的甲醇
氯化钠 (NaCl)，ACS 试剂Sigma-AldrichS9888用于生理盐水和缓冲液
脱脂奶粉粉末Carnationn/a用于免疫印迹
5% 乙酸中的 Ponceau S 溶液 Sigma-AldrichP7170用于免疫印迹
抗酪氨酸羟化酶 (TH) 抗体，绵羊多克隆Chemicon/MilliporeAB1542用于免疫荧光 
抗酪氨酸羟化酶 (TH) 抗体，兔多克隆Pel-Freez BiologicalsP40101-0用于免疫印迹
抗-β 肌动蛋白抗体，兔Sigma-AldrichA2066用于免疫印迹
抗胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 抗体，兔多克隆Chemicon/MilliporeAB5804用于免疫荧光
抗胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 抗体，小鼠单克隆Covance Inc.SMI-22R用于免疫印迹
Tween-20Sigma-AldrichP1379用于免疫印迹
辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG (H+L) Fisher Scientific31462用于免疫荧光
辣根过氧化物酶标记山羊抗绵羊抗体Pierce/Thermo31480用于免疫荧光
辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体Pierce/Thermo31430用于免疫荧光
SuperSignal West Pico 化学发光底物Pierce/Thermo34078用于免疫印迹
CL-XPosure 胶片 7 英寸 × 9.5 英寸 Pierce/Thermo34089用于免疫印迹
Restore Western Blot 剥脱缓冲液 Pierce/Thermo21059用于免疫印迹
柠檬酸一水合物，ACS 试剂，≥99.0% Sigma-AldrichC1909用于免疫组化
正常驴血清MilliporeS30-100ML用于免疫组化
聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)Sigma-AldrichP5288用于免疫组化
牛血清白蛋白 (BSA)，冻干粉Sigma-AldrichA3294用于免疫组化
曲拉通 X-100Fisher ScientificBP151-01用于免疫组化
驴抗兔 IgG，Alexa Fluor 568 标记 Invitrogen/Life TechnologiesA10042用于免疫组化
驴抗绵羊 IgG (H+L)，FITC 标记 Jackson ImmunoResearch713-095-147用于免疫组化
含 DAPI 的 VECTASHIELD 硬封片剂Vector LaboratoriesH-1500用于免疫组化
正常山羊血清MilliporeS26-100ML用于免疫组化
VECTASTAIN ABC 试剂盒（兔 IgG） Vector LaboratoriesPK-4001用于免疫组化；每 1 ml PBS 中加入溶液 A 和 B 各 10 µl（按说明书操作）
DAB 过氧化物酶底物试剂盒，3,3’-二氨基联苯胺Vector LaboratoriesSK-4100用于免疫组化；每 5 ml 冷 ddH2O，加入 2 滴缓冲液原液、2 滴 DAB 和 1 滴 H2O2（H2O2 在使用前立即加入）
过氧化氢，30%Sigma-Aldrich216763用于免疫组化中的淬灭步骤
兔抗 Iba1 抗体Biocare MedicalsCP290A用于免疫组化
焦油紫溶液，常规浓度 FD NeurotechnologiesPS102-01Iba1 免疫组化的复染剂
95% 乙醇，试剂级乙醇Sigma-AldrichR8382用于免疫组化的脱水
100% 无水乙醇Mallinckrodt7019-10用于免疫组化的脱水
乙酸Sigma-AldrichA6283用于免疫组化的褪色
二甲苯Sigma-Aldrich534056用于免疫组化的透明剂
DPX 封片剂Sigma-Aldrich06522用于 DAB 免疫组化的封片介质
O.C.T. 包埋剂 — 冷冻切片包埋介质 American MasterTech ScientificEMOCTCS用于冰冻切片的包埋介质
高锰酸钾Sigma-Aldrich223468用于 DAB 溶液的去污染
多巴胺盐酸盐Sigma-AldrichH8502用于 HPLC
3,4-二羟基苯乙酸 (DOPAC)Sigma-Aldrich850217用于 HPLC
高香草酸 (HVA)Sigma-AldrichH1252用于 HPLC
高氯酸 (PCA) - 70%Sigma-Aldrich244252用于 HPLC
磷酸二氢钠一水合物Sigma-Aldrich71504用于 HPLC
柠檬酸一水合物Sigma-AldrichC1909用于 HPLC
1-辛烷磺酸钠 (OSA)Sigma-AldrichO8380用于 HPLC
EDTASigma-AldrichE1644用于 HPLC
乙腈EMDAX0145-1用于 HPLC
HPLC 级去离子水 (ddH2O)Millipore用于 HPLC
0.22 µm GSTF 膜Millipore用于过滤
Corning NetwellsSigma-AldrichCLS3477带聚酯网底的聚苯乙烯插入件，用于免疫组化
超声细胞破碎仪 (Soniprep 150)MSEMSE.41371.274
微量离心机Eppendorf5414R
ESA MD-150 反相色谱柱 ESA
HPLC 泵 (Ultimate 3000)DionexISO-3100BM
HPLC 自动进样器 (Ultimate 3000)DionexWPS-3000TSL
电化学检测器ESACoulochem III
保护柱ESA5020
分析柱ESA5011A
Chromeleon 软件Dionex
Eclipse E400NikonE400明场/荧光显微镜
一次性小鼠笼AncareN10HT
微滤顶盖AncareN10MBT
5-LOX 缺陷型小鼠The Jackson Laboratory004155
12/15-LOX 缺陷型小鼠The Jackson Laboratory002778

参考文献

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

MPTP Iba 1

相关文章