表达细菌生物发光基因盒（lux）的哺乳动物细胞能够自主发光。化学物质处理后所产生的生物发光动态变化已被证明可反映处理对细胞生长和代谢的影响，因此这类细胞可作为一种低成本、连续、实时的毒性筛选工具，并可轻松适用于高通量自动化检测。
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摘要
摘要
基于哺乳动物细胞的 体外 检测方法已广泛用作毒理学研究中动物实验的替代方案，但由于萤光素酶依赖型筛选方法具有破坏性，需进行平行样品制备，导致高昂的经济和时间成本，限制了其应用。本视频介绍了一种利用自主生物发光的哺乳动物细胞进行检测的新方法，该方法无需添加外源性荧光素底物，因而无须破坏细胞，具有成本低、操作简便的优点，可用于监测目标化合物的细胞毒性效应。这些哺乳动物细胞稳定表达完整的细菌生物发光（luxCDABEfrp)基因盒能够自主产生光学信号，其峰值位于490 nm，无需添加昂贵且可能产生干扰的荧光素底物，无需外部能源激发，也无需在传统光学成像过程中对样本造成破坏。这种对外部刺激的独立性使得生物发光反应的维持完全依赖于细胞自身，意味着所检测到的信号仅在细胞活跃代谢期间出现。这一特性使得 lux表达荧光素酶的细胞系是作为生物哨兵检测细胞毒性效应的理想候选，因为生物发光产量的变化可反映对细胞生长和代谢产生的不利影响。类似地，由于该系统的自主特性且无需破坏样品，可在毒物暴露期间对同一样品进行实时重复成像，并可利用现有成像设备以自动化方式对多个样品同时进行检测。
引言
在美国，供人类使用的药品及其他产品在获得食品药品监督管理局（FDA）批准供消费者使用之前，必须经过广泛的评估。进行此类测试的费用由开发者承担。1，这大大增加了新化合物研发的成本，进而导致消费者支付的价格上升。传统上，此类筛选大量依赖动物作为人体的替代模型，但这种方式造成了巨大的经济负担，仅ADME/Tox（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）筛选每年的花费就估计高达28亿美元。2 且越来越多的证据表明，动物模型无法可靠地预测人类的毒理学反应3因此， 体外 基于人类细胞培养的检测方法在过去二十年中日益普及，因其相对较低的成本、较高的通量，以及对人类生物利用度和毒理学更佳的代表性4目前基于细胞培养的毒性筛选方法采用多种终点指标，例如检测ATP水平、测定内源性胞质酶活性、评估细胞膜完整性或追踪线粒体活性水平，以评价细胞活力。5,6然而，无论选择何种终点指标，这些方法均需在测量前破坏样本，因而只能获得单个时间点的数据。因此，在进行基础毒理学动力学研究时，需要制备并平行处理大量样本，这进一步增加了新化合物研发所需的成本和人力。相比之下，使用分泌型荧光素酶的检测方法，例如 Gaussia 荧光素酶7, Vargula 荧光素酶8，以及 Metridia luciferase9 已开发出无需细胞裂....
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方案
1. 细胞准备
- 从液氮冻存管中复苏一管生物发光的 HEK293 细胞，并将其培养于含 10% 胎牛血清、0.01 mM 非必需氨基酸、1× 抗生素-抗真菌剂和 0.01 mM 丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，置于 T75 组织培养瓶内，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。
注意：培养基及添加成分会因细胞系不同而有所差异，应根据具体细胞系选择合适的培养条件。 - 每 2–3 天更换一次培养基，直至细胞融合度达到约 80%。
注意：所需细胞数量取决于实验设计。如有需要，可通过传代培养获得更多细胞。 - 收获细胞用于检测。
- 移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻晃动清洗细胞，随后弃去废液 PBS。
- 加入胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 2 分钟，或直至细胞从培养瓶表面脱落。
- 将脱落的细胞收集至 PBS 中，并转移至洁净的离心管中。
注意：若使用非贴壁细胞系，可通过离心分离细胞，并用 PBS 洗涤一次。
- 使用血细胞计数板或其他细胞计数系统测定总细胞数。
- 将细胞悬液以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，用新鲜预热的培养基重悬细胞。
- 将等量细胞接种至不透光多孔板的各个孔中。本示例中，将 5 × 10
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结果
本研究连续监测了自发光HEK293细胞在抗生素暴露条件下24小时内的动态变化（图1）。该抗生素属于博来霉素家族，可通过结合并切割DNA导致细胞死亡13；其毒性效应表现为与未处理细胞相比，生物发光信号下降，这一变化可通过伪彩图像直接观察（图2）。由于这些细胞具有自发光特性，可在不同处理条件下对样品进行重复的平行筛选，从而在任意时间点比较不同浓度的效应，便于进行剂量-反应分析。例如，在处理15小时、18小时和20小时后，将细胞产生的生物发光信号随化学物质浓度的变化绘制成图（图3），结果显示，随着抗生素剂量的增加，生物发光的产生呈剂量依赖性降低。
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讨论
该方法展示了利用自主生物发光的哺乳动物细胞作为 体外 一种可对活细胞在其整个生命周期内进行连续实时监测的细胞毒性筛选实验。该实验方案具有良好的灵活性，可根据具体实验需求进行相应调整。例如，本文所述实验适用于追踪急性毒性效应，但也可通过延长成像时间间隔并进行多次成像，调整用于评估作用较慢或长期的毒性效应。即 每24小时进行一次检测，并在读数间隔期间将细胞维持于标准培养条件下。此外，可根据所使用的生物发光细胞系调整积分时间。可通过预实验在不同积分时间下成像，以确定最佳读数时间窗口。本示例中采用10分钟积分时间，旨在突出展示各处理条件下生物发光产量的动态范围，但具体应用中可根据需要选择更短的读取时间。同样，虽然本示例以24孔板进行演示，但也可根据高通量需求替换为96孔或384孔板。尽管此处展示的代表性结果为单块板上的技术重复三次，但需注意，在测试目标化合物时，应于不同板上进行独立实验，以确保处理组间统计学意义的可靠性。此外，由于该检测方法可适配多种具有不同检测灵敏度的仪器，建议针对每台仪器单独确定可接受的信噪比和信号-背景比。
先前已确定，在.......
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披露
D.M. Close、S.A. Ripp 和 G.S. Sayler 是 490 BioTech, Inc. 的创始人和所有者。
致谢
本研究工作得到了美国国家科学基金会化学、生物工程、环境与运输系统部（CBET）的资助，资助编号为 CBET-0853780 和 CBET-1159344，以及美国国立卫生研究院国家环境健康科学研究所（NIEHS）的资助，资助编号为 1R43ES022567-01，同时获得国家癌症研究所癌症成像计划的资助，资助编号为 CA127745-01。本研究所使用的 IVIS Lumina 仪器由美国陆军国防大学研究仪器项目提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| IVIS Lumina | PerkinElmer | 其他 IVIS 型号和基于 PMT 的酶标仪也可使用 | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | 该软件已有更新版本 | |
| 75 cm2 细胞培养处理烧瓶 | Corning | 430641 | |
| 6 孔组织培养处理板 | Costar | 07-200-83 | |
| 黑色 24 孔板 | Greiner Bio-One | 662174 | 高通量应用可使用 96 孔或 384 孔板 |
| 磷酸盐缓冲液 | Hyclone | SH30910 | |
| 无酚红改良杜尔贝科必需氨基酸培养基（DMEM） | Hyclone | SH30284 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH3091003 | |
| 非必需氨基酸，100 倍浓度 | Life Technologies | 11140050 | |
| 抗生素-抗真菌剂，100 倍浓度 | Life Technologies | 15240062 | |
| 丙酮酸钠，100 mM | Life Technologies | 11360070 | |
| 杀稻瘟菌素（Zeocin），100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| 胰蛋白酶，0.05% | Life Technologies | 25300062 |
参考文献
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al.
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