一种用于外泌体定量与粒径测量的创新方法

摘要

本文介绍了一种从全血中分离外泌体，并利用半自动仪器通过纳米颗粒追踪技术进行进一步分析的方法。该技术为液体悬浮液中颗粒的可视化与分析提供了极为灵敏的方法。

摘要

尽管外泌体的生物学重要性最近受到了越来越多的科学与临床关注，但其复杂的通路、生物利用度以及在健康与疾病中的多种功能仍有许多未知之处。目前的研究主要集中在外泌体的存在及其行为体外 以及 体内在不同人类疾病背景下，特别是在肿瘤学、妇科学和心脏病学领域的应用。

目前，外泌体分离尚无公认的金标准，其定量分析方法也未达成共识。由于外泌体纯化方法众多，且定量与定性分析的手段也各不相同，因此很难确定一种理想的组合方法。

本文演示了纳米颗粒追踪分析（NTA），这是一种半自动化的表征方法，用于分析通过超速离心法从人血浆中分离得到的外泌体。实验结果表明，该分离方法以及对外泌体平均数量和粒径的测定可提供可重复且有效的数据，其他方法（如扫描电子显微镜，SEM）已对此进行了验证。

引言

循环外泌体的确切功能在很长一段时间内尚不明确。即使在当下，外泌体的完整病理机制仍未被完全阐明。由于外泌体携带与其来源亲代细胞相关的抗原、蛋白质以及RNA（mRNA和miRNA），因此其作为细胞间信号传递介质的功能主要受到关注。

文献中已报道了多种用于分离和定量检测外泌体的方法^1,2。然而，目前尚未就“金标准”达成共识。与此同时，外泌体研究领域的大多数科学家均认为，亟需建立一种统一的分离方法，以提高不同报告和研究之间的可比性。

荧光激活细胞分选（FACS）是外泌体分析中最常用且最普遍的工具³。FACS 的优势在于，通过荧光标记，可一步比较不同来源的细胞。FACS 的主要缺点是该方法的灵敏度不足以识别小于 0.5 µm 的颗粒⁴，而外泌体的直径通常在 30–120 nm 之间⁵，更难以对其尺寸进行测量。

扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）是用于分析外泌体粒径和形态的其他工具。然而，SEM 和 TEM 均存在样品制备耗时的缺点，两种方法均涉及大量人工操作步骤，且各自存在一定的产生假象的风险。这两种方法均不适用于高通量样品分析以及对单个样品中数千个颗粒的表征。此外，在临床日常检测中需要对样品进行同时或至少在极短时间内快速分析，而实现这种定量分析较为困难⁶。新一代技术现已能够无需前期复杂的制备步骤即可对外泌体进行分析（例如，环境扫描电镜）。然而，这些现代技术在分析含有外泌体的大体积悬浮液以确定其平均数量和粒径分布方面仍存在较大局限性。

另一种用于外泌体可视化和分析的高灵敏度方法是纳米颗粒追踪分析（NTA）。该方法利用了两个不同的物理学原理。首先，当颗粒被激光束照射时，通过其散射的光进行检测。第二个现象称为布朗运动，即不同颗粒在液体悬浮液中的扩散速率与其尺寸成反比。在此情况下，颗粒的运动还取决于液体的温度和黏度。然而，该运动速率与颗粒大小直接相关，并被NTA所利用。通过基于软件的分析，记录来自单个颗粒的散射光的数字图像。散射光斑及其运动速度的图谱提供了可用于确定总颗粒数和粒径分布的数据。该技术在分析平均直径小于100 nm的颗粒时尤为强大。

粒径和浓度的测量采用ZetaView布朗运动与电泳运动视频分析显微镜进行。这是一种用于液体样品的半自动化台式纳米颗粒分析仪器（下文简称颗粒追踪仪器）。该仪器包括颗粒追踪分析仪以及一台用于数据分析的配套笔记本电脑。无论是异质性生物样品，还是较为均一的无机颗粒悬浮液，均适用于本方法。通过配备摄像机的激光散射显微镜检测颗粒并观察其运动行为。显微镜轴线呈水平方向，聚焦于充满含有外泌体悬浮液的样品通道，而激光束则垂直入射。被激光照射的颗粒产生散射光，经显微镜以90°角由数字摄像机记录（图1）。散射光的强度使得直径大于60 nm的颗粒得以被观察。在此设置下，颗粒的亮度并非判断其粒径的唯一依据。当未施加电场时，颗粒运动仅遵循布朗运动，可据此计算颗粒粒径。然而，该仪器亦可在样品通道两端施加电场。在此电场作用下，悬浮外泌体的电势、极性及离子电荷水平将共同决定其运动方向。由此获得的速度与运动方向数据可生成电泳迁移率直方图。

尽管找到一种分析分离外泌体的最佳方法是一个问题，另一个问题则在于如何从不同介质（如血液、腹水、尿液、乳汁、羊水或细胞培养基）中有效分离外泌体。迄今为止已报道了多种方法，包括基于超速离心法¹、工业分离试剂（如Exoquick）⁷、用于抗原分离的磁珠技术⁸或超滤步骤⁹的方法。

在本实验方案中，我们演示了通过超速离心法分离外泌体的完整流程，并展示了如何利用颗粒追踪仪器分析所得的含外泌体悬液。同时提供了针对人血浆或细胞培养基来源外泌体分析的特殊注意事项。

方案

注意：本研究中所展示的实验已获得杜塞尔多夫大学机构伦理委员会的批准。

1. 外泌体的制备

1. 通过静脉穿刺采集全血至3支柠檬酸盐试管中（共9 ml）。将血液倒入15 ml Falcon离心管中。
2. 在4 °C条件下以1,500 × g离心20分钟，使细胞与血浆初步分离。将上清液转移至新的15 ml Falcon离心管中。
3. 在4 °C条件下以2,800 × g离心20分钟，彻底去除血浆中的细胞成分，获得无细胞血浆（CFP）。将CFP分装至超速离心管中，每管1 ml。
4. 在4 °C条件下以100,000 × g离心90分钟，以去除外泌体。弃去900 µl上清液。将沉淀物用管中剩余的100 µl液体重悬，再加入900 µl PBS。
5. 再次在4 °C条件下以100,000 × g离心30分钟。弃去900 µl上清液，将沉淀物用剩余的100 µl液体重悬。
6. 取5至20 µl重悬液加入40 ml蒸馏水中。通过450 nm滤膜过滤，以分离外泌体与较大颗粒。将所得终末悬液用于颗粒浓度测定。

2. 粒子示踪仪的启动程序

1. 通过双击软件图标启动程序。在协议进行过程中，点击各个软件选项卡（“Cell Check”、“Measurement”、“Analysis”）以在它们之间切换。
2. 按照屏幕上的提示自动执行启动程序。在“Cell Check”选项卡中，勾选细胞质量检查和自动对齐的复选框。
   注意：如有必要，可通过点击“Cell Check”选项卡上的按钮（A）或（B）分别重复上述任一步骤。
3. 打开NTA仪器的进样口和出样口，使用注射器将10 ml蒸馏水通过进样口注入细胞通道。当最后一部分水即将注入完毕时，关闭出样口。在出样口下方放置一个烧杯以收集废液。确保测量池中无气泡，并避免将气泡注入系统。立即关闭进样口。
4. 点击“OK”执行细胞质量检查。几秒钟后，软件将显示细胞质量检查结果。
5. 如果软件的实时视图屏幕中仍可见颗粒，或质量检查结果仅为“良好”或“较差”，则重复步骤2.3，直至从测量池中完全清除残留颗粒。每次测量后也应重复步骤2.3，以防止颗粒累积。若重复蒸馏水冲洗和细胞检查仍无法获得“良好”结果，则进入步骤2.9。
6. 制备一种含有均一200 nm聚苯乙烯微粒的对照悬浮液，用于校准激光与显微镜的焦点。根据仪器制造商提供的浓缩悬浮液，取一滴加入500 ml蒸馏水中，使实时视图中每屏幕显示600 ± 100个颗粒，达到所需浓度。
7. 按照步骤2.3所述方法，将校准悬浮液注入NTA仪器。点击“OK”启动自动对齐程序，系统将自动运行并找到两个焦点的最佳位置。
8. 当出现提示信息表明系统已准备就绪可进行实验时，点击“OK”开始测量。
9. 实验间隙，可定期手动清洗细胞通道：用30%乙醇溶液冲洗细胞。每当软件自动报错时，必须清洗通道。

3. 样品测量

1. 每次样品测量前，用蒸馏水冲洗通道（如步骤 2.3 所述）。
2. 将外泌体悬液（按第 1 节制备）注入通道，操作如步骤 2.3 所述。
3. 根据需要在软件中调整以下主要参数：
   1. 灵敏度。为确定最佳灵敏度范围，点击“粒子数 vs. 灵敏度”按钮，以显示不同灵敏度水平下每屏检测到的粒子数曲线。选择位于曲线最大斜率之前的灵敏度水平。较高的灵敏度可使更多小粒子可见，但也会增加背景噪声相关问题。
   2. 最小亮度。进行外泌体测量时，建议将起始亮度设为 20，以利用此功能作为过滤手段。调高该参数可屏蔽强光散射粒子，调低则可放大弱散射伪影。实验过程中可根据需要调整亮度。
      注意：光散射过强的粒子可能发生重叠，导致被错误地排除在分析之外。
   3. 最小和最大尺寸。通过调节最小和最大尺寸设置数字滤波器，以消除像素噪声及来自过大粒子的非期望散射。外泌体测量建议使用 10 至 500 像素的范围。
   4. 快门。将相机开启时间调整为 1/300 秒。
4. 实时读取参数：
   1. 随时点击“实时图像”按钮，可在数字视图和模拟视图模式之间切换。
   2. 实验过程中，持续监测散射强度条，其以颜色编码方式显示样品的饱和状态。若散射条呈红色，则不得对外泌体进行分析。此时应进一步稀释样品以避免该现象。若实验条件不允许改变样品悬液，则可在软件设置中降低灵敏度或提高亮度，以改善测量结果。
      注意：当分析粒子浓度极高的样品时，散射信号可能导致多个粒子融合，被计为单个粒子。
   3. 记录显示屏中视野内检测到的粒子数量。
5. 点击“测量”标签。
6. 在“运行选项”数组中选择设置。
   1. 每次采集前，选择“检查运动”以重复进行粒子漂移测试。在整个分析开始前至少执行一次该测试。若漂移速度超过 20 µm/sec，需等待直至样品流动停止后再继续测量。
   2. 选择实验次数（5 次）及实验间的时间间隔（0）。
   3. 必要时执行“样品检查”。该测试为启动程序中自动对准的一部分，之后可根据需要重复进行。
7. 最后点击“运行视频采集”按钮。在新窗口中，定义循环次数（15 次）和测量位置数量（11 个）。
   注意：激光头和显微镜可移动，以便在 11 个不同位置分析粒子数量。根据实验需求，决定实验是在单一位置还是多个位置进行。
   1. 通过设置视频分辨率（低）确认粒子被追踪并计为单个粒子所需的最短时间。较低的分辨率会导致更短的追踪时间。
   2. 选择文件名并点击“确定”以开始测量。

4. 结果解读

1. 在“结果”选项卡中查看测量后显示的以下结果和参数：(1) 追踪到的颗粒总数，(2) 每个位置的平均颗粒数，以及 (3) 颗粒浓度。
   1. 查看结果平均值表格，其中包含颗粒尺寸（直径、表面积和体积）与颗粒数量百分比之间的数值比，以及平均值和标准偏差的数值。
   2. 如果图形分析中存在多个峰，请使用峰分析表格。该表格显示了小于第一个或相应第二个峰的颗粒分布情况。
2. 查看测量后生成的图表，以观察颗粒按尺寸的分布情况。使用显示模式中的图标及图表上方的图标来更改设置。

结果

本演示所用样本的测量条件设置为最佳状态，灵敏度达到85%，位于灵敏度曲线最大斜率之前（图2）。亮度及最小/最大值均按照方案推荐进行选择。测得颗粒浓度为5.3 × 10⁶ 个/mL，颗粒平均粒径为0.149 µm，多数颗粒粒径为0.137 µm。

测量后获得的数值可保存为报告，文件格式可选择 .pdf 或用于导出至数据库的 .txt 格式。图形可根据需要按照方案（第 4 节）中的描述进行调整。视频序列也会被保存，可用于后续离线重新分析。然而，在此类离线分析中，无法追溯更改相机的预采集设置。

为了找到测量的最佳参数设置，本文以100 nm聚苯乙烯粒径标准物质为例，描述仪器参数的优化过程。文中详细讨论了灵敏度和最小/最大尺寸这两个参数对视频图像和粒径分布的影响。所有其他参数均汇总于表1中。

灵敏度（范围为50至94）对模拟图像和数字图像影响的直观展示见图3。基于表1中的设置（最小尺寸 = 5，最大尺寸 = 200），图像导出的定量信息如图4所示。图4A展示了检测到的粒子数量与灵敏度之间的典型关系。在50至90范围内，检测到的粒子数量随灵敏度增加而上升；当灵敏度>90时，粒子数量急剧上升。在66至86之间发现了一个最佳的灵敏度范围（A）。不同灵敏度设置下获得的粒径分布如图4B所示。粒径分布数据为三次独立测量的平均值。当灵敏度过低时（灵敏度 = 62，红色曲线），仅分析到少量粒子，导致统计结果较差。随着灵敏度提高，被分析的粒子数量增加，并在70（黄色曲线）至86（棕褐色曲线）之间达到最佳状态。进一步提高灵敏度会导致粒径分布质量下降，粒子数量减少，且粒径分布向更小尺寸偏移（灵敏度 = 94，蓝色曲线）。图4C显示了基于数量的x50直径（即50%的粒子直径小于此值）随灵敏度变化的趋势。在米色区间内，粒径的相对标准偏差（RSD）小于8%，对应于A图中的最佳区间。红色区域表示RSD>8%，这是由于统计结果较差（灵敏度过低）或分布变宽并向更小尺寸偏移（灵敏度过高）所致。

最小尺寸和最大尺寸的设置是对数字图像应用的滤波器，用于去除斑点尺寸小于最小尺寸或大于最大尺寸的颗粒。由于具有散射光的能力，颗粒会在数字图像上形成具有一定大小的斑点。斑点的大小以像素（px）数量来衡量。当颗粒对光的散射能力很强时（例如， 颗粒 > 200 nm 或聚集体）时，光斑尺寸相当大， 例如， > 500 像素。斑点尺寸非常小（例如， < 10 像素）用于小颗粒（例如， < 20 nm），具体取决于颗粒材料。斑点尺寸（像素）与颗粒尺寸（纳米）不可互换，因为二者并不相同，且这两个变量之间不存在直接关系。通过优化最小和最大尺寸参数，用户可过滤掉不需要的物体，例如团聚体（最大尺寸）或小物体如背景噪声（最小尺寸）。最小/最大尺寸对100 nm标准颗粒尺寸分布的影响如图所示。 图 4D （灵敏度 = 82）。当将区间设置为较小的光斑尺寸时（例如， min = 1，max = 52；橙色曲线），分析的粒子数量减少，且基于x50的直径略微向较小尺寸偏移。设置较大的斑点（min = 40，max = 1,000；红色曲线）会导致粒子尺寸分布变宽，并向较大尺寸偏移。为了使总粒子数相等，橙色和红色分布的区间边界均调整为包含80个粒子。采用最佳设置（min = 5，max = 200；黄褐色曲线）的分布包含360个粒子。

采用超速离心法分离外泌体，并利用所述系统通过纳米颗粒追踪分析（NTA）进行检测，成功完成了一系列实验。所得数据高度一致，证实了该方法具有较高的可重复性。其他分离方法也应表现出类似的结果。然而，稀释步骤被确定为尤为关键的环节，其对计算所得颗粒总数的影响需重新评估。

图 1. NTA 装置的示意图。显微镜/视频轴与激光束相互正交，并在细胞通道横截面处相交。粒子散射的光在软件的“实时视图”窗口中显示。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 粒子数量与灵敏度曲线。 粒子数量与灵敏度曲线展示了在自动灵敏度扫描过程中某一时刻某一位置的粒子分布情况。该图形可视化方法用于确定初始测量的最佳参数设置。灵敏度值应选择在曲线最大斜率出现之前。需要注意的是，本实验测试中伪影并未被消除，可能会影响图形结果。请点击此处查看此图的放大版本。

图3. 灵敏度对模拟图像和数字图像的影响。 在模拟（上排）和数字（下排）视图中，分别展示了灵敏度在50至94之间时实时画面中颗粒的可视化情况。当灵敏度太低时，仅能检测到少数颗粒（左图）；在最佳灵敏度下，颗粒呈现为彼此清晰分离的单个点状（中图）；而在相对较高的灵敏度下，颗粒相互融合，导致图像质量下降（右图）。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4. 灵敏度设置中的最小值与最大尺寸设定对100 nm聚苯乙烯标准颗粒样品检测结果的影响。（A）灵敏度与检测到的颗粒数量关系图；最佳区间为66至86，在曲线最大斜率出现之前。（B）在不同灵敏度设置（62至94）下获得的颗粒尺寸分布；灵敏度过低（62）或过高（94）时，无法准确反映100 nm聚苯乙烯标准样品的颗粒尺寸分布。（C）基于数量的x50直径随灵敏度的变化；在浅黄色区间内，x50的误差小于8%，最佳区间为66至86。（D）最小尺寸（Min）和最大尺寸（Max）设置对颗粒尺寸分布的影响；最优参数（min = 5，max = 200）可准确捕获标准样品的尺寸分布。请点击此处查看该图的放大版本。

采集前参数
灵敏度	可变
快门	40
帧率	30 fps
分辨率	高
循环次数	10
多次采集	3
位置	1
采集后参数
最小亮度	30
最大尺寸	可变
最小尺寸	可变

表1. 粒子示踪仪设置的采集前与采集后参数汇总。

讨论

我们展示了一种从血液中分离外泌体的详细方案，并介绍纳米颗粒追踪分析作为一种新颖且创新的方法，用于测量生物液体中外泌体的大小和浓度。在本实验中，人外周血被用作外泌体的来源。然而，其他来源如尿液、痰液、细胞培养上清液等也可适用。 等等， 也可用作测试材料。

根据人体外泌体浓度的生物学变异性，不同个体的检测样本中外泌体浓度可能存在显著差异。然而，生物检测样本中颗粒的浓度可能会影响检测结果。因此，需要一种可靠且标准化的样本稀释方法。在本方法中，外泌体来源的血浆由9 ml外周全血制备而来。通过差速离心法从1 ml血浆中分离出外泌体沉淀，并将其重悬于5 ml蒸馏水中，以制备用于实验的悬浮外泌体工作样本。该预设条件可提供适宜的颗粒浓度，即在纳米颗粒追踪分析（NTA）中获得适当的散射光强度。i.e., 除体积和稀释倍数外，所用溶液的组成也至关重要。我们采用蒸馏水进行外泌体的最终重悬。当然，根据实验设计的具体要求，也可使用其他介质进行最终稀释。但在对离子溶液进行zeta电位测量时，特别是检测具有缓冲能力的样本时，在无湍流条件下进行谨慎稀释是有益的。为了直接比较多个样本，我们建议对所有样本保持相同的稀释水平。除灵敏度和视频分辨率外，所有参数均可在后续使用ZetaView分析软件进行调整。

尽管作者认为本文介绍的系统目前是最合适的仪器，但它并非唯一可用的纳米颗粒追踪分析（NTA）系统。已有许多先前的研究采用了其他系统，这些系统应用了相同的NTA原理，但在仪器设计上有所不同，因而具有一些差异化的特征¹⁰。我们认为，在选择外泌体评估的方法流程时，样品处理和结果可重复性方面的实际因素至关重要。我们还认为，理想的检测系统应消除可能干扰测量结果的依赖于操作者的人为因素。本文所提出的小囊泡分析方法在很大程度上满足了操作简便这一标准。此外，该方法的另一个优势在于，样品的半自动化分析过程快速，可在短时间内生成结果。外泌体的在线可视化有助于分析人员立即了解外泌体的特性，例如，总体浓度。

此处介绍的测量技术可通过一种非常简单而优雅的改进方法，即使用抗体标记的外泌体，并在检测器前放置滤光片来捕获散射的激光束。通过这种方法，可根据外泌体表面抗原及其他在技术上可实现选择性荧光染色的生物学相关特征，区分不同的外泌体亚群。

当前版本的颗粒追踪仪器的一个缺点是，在极高灵敏度下，可能会出现诸如背景噪声之类的伪影，这些伪影源于细胞通道壁。未来不久可能会推出针对当前系统的工程技术改进方案。通过该方法，可减少激光散射光在通道壁上的反射，从而提高所测信号和获得数据的准确性，并降低检测限。

尽管目前使用的外泌体分离方案已较为成熟，且所采用的颗粒追踪仪器具有极高的分辨率，可检测低至30 nm的粒径分布，但仍无法确保所检测到的颗粒完全为真正的外泌体。外泌体悬液中可能混杂其他颗粒，如死亡细胞碎片或较大的蛋白质复合物，从而导致假阳性信号。一种可靠排除此类“污染”的方法是电子显微镜（EM）检测，包括透射电镜（TEM）或扫描电镜（SEM）。遗憾的是，迄今为止尚未发现通用且特异性的外泌体标志物，尽管已有若干被提出表面标志物受到越来越多关注，包括四跨膜蛋白（Tspan）、CD81、C63、CD9 等等。 ¹¹.

无论外泌体生物学研究未来如何进展，特别是关于外泌体特异性标志物的研究，本文所介绍的方案都将为外泌体的分离与检测提供一种强有力的方法。浓度和粒径可通过软件辅助以简便的方式快速测定。添加特异性荧光标记物或荧光素偶联抗体有望进一步拓展本研究中纳米颗粒跟踪分析（NTA）方法的潜在应用范围。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
柠檬酸盐管	BD	364305	BD Vacutainer
蒸馏水	Braun	3880087	Aqua ad iniectabilia
Falcon 管	Greiner Bio One	188271	PP 管，无菌，15 ml
超速离心管	Beckman	357448	微量离心管，聚碳酸酯材质，1.5 ml
Polybead	Polysciences, Inc.	07304	2.6% 固含量—乳胶 校准溶液
注射器（滤器用）	Braun	4617053V	5 ml
注射器（ZetaView 用）	Braun	4606051V	5 ml
针头	BD	305180	BD 钝头充注针头
滤器	Sartorius Stedim	16555	注射器滤器，亲水性，450 µm
超速离心机	Beckman	L8-M	转子：70Ti，序列号 E21078
ZetaView	Particle Metrix	PMX 100, Type 101
离心机	Eppendorf	5804R	转子：A-4-44