植物腺体是特化的结构，负责生物合成和分泌多种参与生物环境相互作用的化合物。为了便于研究其分子和生化特性，已建立一种机械显微分离技术，用于分离单个具有代谢活性的腺体，此处以食虫植物Nepenthes为例。
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摘要
摘要
许多植物具有特化的结构，参与合成和分泌特定的小分子量化合物和蛋白质。这些结构几乎总是定位于植物表面，例如蜜腺或腺毛。所分泌的化合物常在与生物环境的相互作用中发挥作用，例如作为传粉者的吸引剂或抵御植食性动物的驱避剂。
在食虫植物中可以发现一些在多个方面都具有独特性的腺体。在被称为猪笼草属（Nepenthes）的捕虫笼植物中，其陷阱内部具有双功能腺体：一方面可分泌消化液，包括消化猎物所需的所有酶类；另一方面则吸收猎物分解后释放的营养物质。因此，这类腺体是一种理想的特化组织，非常适合用于研究植物中蛋白质分泌和营养吸收相关的分子、生化及生理机制。此外，许多具有腺体结构的植物通常会合成次生代谢产物，这些化合物的生物合成过程也可直接在腺体中进行研究。
为了研究这些特殊结构，需要高效、快速地分离出具有代谢活性且无其他组织污染的样本。因此，开发并应用了一种机械微分离技术用于相关研究 猪笼草 消化液。本文介绍了一种已成功用于制备单个双功能腺体的方案 猪笼草属 基于机械化微采样平台的陷阱。腺体可经分离后，在制备RNA后直接用于PCR技术进行基因表达分析。
引言
植物能够产生多种多样的化合物，这些化合物具有广泛的工业和药用价值，其分子大小从低分子量分子到聚合物不等。这些化合物通常由高度特化的结构合成并分泌，其中许多结构位于植物表面，例如腺毛或蜜腺，另一些则位于植物内部，例如分泌细胞（idioblasts）、乳胶管或树脂道。然而，尽管这些特化的分泌结构普遍表现出活跃代谢的多种特征，目前对其生物学特性的了解仍然相对有限。特别是食虫植物（如Nepenthes）的腺体，可被视为植物细胞生物学研究的理想模型系统1。
食虫植物自1875年查尔斯·达尔文（Charles Darwin）出版《食虫植物》以来，一直是多项研究的对象2然而，直到最近几年，才开始在分子水平上开展相关研究，目前我们的认知仍然有限。例如，猪笼草属植物捕虫笼消化液中的蛋白质组成 猪笼草 尚不完全清楚。直到最近才鉴定出几种水解蛋白以及相应的少数基因3。在陷阱诱捕器中 猪笼草属 (图1), 多细胞腺体位于捕虫瓶内底部，这些腺体既能向捕虫瓶液体中产生并分泌消化酶，又能从捕虫瓶液体中吸收溶解的营养物质4因此，这些双功能腺体代表了一种独特的微组织，在食肉植物的捕食过程中具有核心位置和功能 猪笼草属 值得深入研究。
图1. Nepenthes alata 的捕虫笼。 捕虫笼的下部含有消化液以及内壁上的消化腺。
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在植物科学中，许多实验方法依赖于“大量材料”，因为研究对象并非特定组织，而是整个器官。因此，对其均质化和分析所得的结果只能反映各个组织和细胞的稀释后比例情况5。为解决这一问题，已开发并成功应用了显微制备技术，例如所谓的激光捕获显微切割（LCM），用于获取特定的植物组织并分析其各自的内容物6。然而，当目标为不稳定和/或快速降解的细胞组分（如RNA）时，LCM常受到限制。在这种情况下，前期组织固定步骤耗时较长，且常伴随生物分子的降解，成为不利因素。此外，由于许多植物组织含水量高以及细胞壁强度大，LCM通常难以直接从新鲜组织中成功制备样品7。任何旨在研究分泌腺中从基因、mRNA、蛋白质到次生代谢产物及其生物合成相关组分的方法，都需要针对此类样品制备的替代技术。因此，必须采用特定的技术来分离单个细胞，甚至在制备后仍保持完整的多细胞腺体。
此处介绍一种方法，采用配备直接显微可视功能的机械化微采样平台，可快速高效地从捕虫瓶中分离单个腺体。 猪笼草 物种。这些多细胞腺体具有双重功能， 即 它们参与分泌和吸收过程，处于固着状态，且未暴露的细胞层会浸润形成内皮层。整个腺体可在不带邻近组织的情况下被分离，并以明确的方式置入PCR管中。该技术用于研究腺体组织中的特定基因及其基因表达。
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方案
1. 植物材料准备
- 所有猪笼草属（Nepenthes）物种均种植于德国耶拿的马克斯·普朗克化学生态研究所温室或耶拿植物园内。
- 为制备分泌组织，采集一个捕虫笼，切去包含笼盖、唇和滑溜区在内的上三分之一部分。捕虫笼可直接新鲜使用，或经液氮速冻后于 -80 °C 保存。
2. 捕虫器组织的显微解剖
- 微量取样平台由一台体视显微镜和一个显微操作器组成，该显微操作器直接连接在显微镜主体上，并通过三维摇杆进行操作。此处使用了 aureka 的早期原型，如图所示（图 2A）。
- 为从 Nepenthes 捕虫笼中解剖分泌腺，请使用显微镊子并将其连接至显微操作器上（图 2A 和 2B）。
- 用于 RNA 提取时，所有仪器（刀片、镊子、显微操作器、显微镊子、载玻片）均需用 RNaseZAP 处理。
- 准备收集管：在 PCR 管中加入 9 μl 无核酸酶水和 1 μl RNase 抑制剂，用于 RNA 提取。若需直接从组织样本进行 PCR，则仅加入无核酸酶水（10 μl）。
- 取新鲜或冷冻的捕虫笼，使用刀片和镊子切下一小块含有分泌腺的组织（面积为 1–2 cm2）。用水清洗组织；若将进行 RNA 提取，则使用含 0.1% 二乙基焦磷酰胺（DEPC）的水洗涤。
- 用双面胶带将植物材料固定在载玻片上（分泌腺面应朝上，图 2C 和 2D），再用胶带将载玻片固定在通用载物台上，该载物台应配备可移动平台。
- 若用于核酸提取，样品制备过程应在冰上进行。准备一个扁平的泡沫塑料盒，将含有样品的通用载物台放入其中，并在盒内填满冰块，随后将盒子置于显微镜下。
- 制备过程中，分泌腺的位置至关重要。分泌腺部分被保护性罩状结构覆盖（图 3），仅能从一侧用镊子接触。此外，还需通过倾斜通用载物台的平台，将样品相对于镊子的角度调整至约 135°，具体角度依 Nepenthes 物种而异。
- 显微解剖过程在视觉监控下完成。为分离腺体，应使用非紫外滤光镜，以减少 DNA 和 RNA 的降解。
- 通过控制面板移动显微操作器和镊子至目标腺体。到达腺体后，将镊子的两个臂分别置于腺体两侧。通过闭合镊子将腺体从周围组织中移出（图 4A）。
- 将附着在镊子上的腺体移离载玻片，移至收集管上方，使镊子尖端轻轻接触管内溶液（图 4B）。打开镊子释放腺体时需仔细观察，因为腺体容易粘附在工具尖端。组织样本可在 -80 °C 下长期保存，直至进行 PCR 或 RNA 提取。
3. 直接从样本中进行PCR扩增 猪笼草 组织
- 为验证该制备方法的效率，可直接对腺体组织进行PCR扩增，无需DNA提取步骤。
- 使用基因特异性引物进行PCR扩增；此处引物针对编码甜蛋白样蛋白（TLP）的序列（上游引物：5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3'，下游引物：5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3'）。
- 在含有10 μl无核酸酶水的PCR管中收集1-5个腺体。对于50 μl反应体系，加入5 μl 10x缓冲液 Taq 缓冲液，1 μl 10 mM 脱氧核苷三磷酸（dNTPs），3 μl 25 mM MgCl2，0.4 μl（1.25 U） Taq DNA聚合酶，每种引物1 μl（100 pmol），无核酸酶水28.6 μl。
- 在PCR仪中进行PCR反应，程序如下：94 °C 预变性3 min；35个循环的变性（94 °C 30 sec）、退火（59 °C 30 sec）和延伸（72 °C 1 min）；最后72 °C 延伸10 min。
- 通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的扩增。因此 使用1.5%（w/v）琼脂糖溶于1×TAE（40 mM Tris碱，20 mM冰乙酸，1 mM EDTA，pH 8）缓冲液中，将溶液在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。向100 ml琼脂糖溶液中加入1 μl溴化乙锭（10 μg/μl），用于后续可视化检测。在电泳槽中用1×TAE缓冲液以300 V、115 mA电泳约20分钟。TLP扩增产物的正确大小应为690 bp。
4. 小组织样本的RNA提取与逆转录
- 所有步骤均需在冰上进行。RNA 提取采用两种方法：一种是使用微型试剂盒提取总 RNA，另一种是使用磁珠进行 mRNA 分离。
- 通过显微操作收集至少 30 个分泌腺，置于含有 1 μl RNase 抑制剂和 9 μl 无核酸酶水的 PCR 管中。随后在热循环仪中于 75 °C 裂解组织 10 分钟。
- 总 RNA 提取。
- 制备完成后，向样品中加入 90 μl 裂解液，于 75 °C 孵育 10 分钟。之后将反应混合物加载至柱子（试剂盒提供）上，并按照制造商说明书进行洗涤步骤。
- 分别用 10 μl 洗脱液洗脱 RNA 两次，并继续进行 DNase I 处理。
- 向 20 μl 提取的 RNA 中加入 2 μl 10x DNase I 缓冲液和 1 μl DNase I（随 RNA 提取试剂盒提供），于 37 °C 孵育 1 小时。加入 2 μl DNase 失活试剂终止反应，并在室温下孵育 2 分钟。经最大转速离心 1.5 分钟后，可将 RNA 转移至新的无 RNase 的离心管中。使用分光光度计测定每个样品的 RNA 浓度。样品应保存于 -80 °C。
- 使用磁珠提取 mRNA。
- 用裂解/结合缓冲液（试剂盒提供）将样品体积调至 100 μl，并于 75 °C 孵育 10 分钟。加入 20 μl 带有 Oligo (dT)25 突出端的磁珠，在室温下混匀反应 5 分钟。mRNA 通过其 poly(A) 尾与磁珠上的 Oligo (dT)25 突出端结合。
- 按照制造商说明书对结合了 mRNA 的磁珠进行洗涤步骤。可通过磁铁去除溶液。将磁珠重悬于 20 μl 10 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5）中。
- 用 2U（1 μl）DNase（含 2 μl 10x DNase 缓冲液和 17 μl 无核酸酶水）于 37 °C 处理 1 小时，以去除基因组 DNA 污染。之后用磁铁去除酶溶液，并将磁珠重悬于 20 μl 10 mM Tris-HCl 缓冲液中。由于 RNA 仍结合在磁珠上，无法测定其浓度。样品应保存于 -80 °C。
- 使用 cDNA 合成试剂盒进行逆转录。反应按照制造商说明书操作。
- 对于总 RNA 的逆转录，向 1 μg RNA 中加入 1 μl（100 pmol）Oligo (dT)20 引物或 1 μl（0.4 μg）随机六聚体引物、1 μl RNase 抑制剂和 1 μl 10 mM dNTP 混合物，并用无核酸酶水定容至 14 μl。于 65 °C 孵育 5 分钟，随后将样品置于冰上。加入 1 μl 0.1 M DTT、1 μl 逆转录酶和 4 μl 5x 逆转录缓冲液。反应在 50 °C 孵育 55 分钟，随后在 70 °C 灭活 10 分钟。逆转录完成后，样品可保存于 -20 °C。
- 对于结合在磁珠上的 mRNA，用第一反应混合液（1 μl RNase 抑制剂、1 μl 10 mM dNTP 混合物和 12 μl 无核酸酶水）替换 Tris-HCl 缓冲液，并于 65 °C 孵育 5 分钟。由于磁珠带有 Oligo (dT)25 突出端，无需向样品中添加 Oligo (dT)20 引物或随机六聚体引物。之后按照上述步骤（4.5.1）进行操作。
- 使用分光光度计测定 cDNA 浓度。样品保存于 -20 °C。
5. 实时荧光定量 PCR
- 进行实时PCR分析时，使用Micro试剂盒提取的总RNA以及SYBR Green QPCR Master Mix。为确保各样本转录本量相等，在逆转录后将每个样本的cDNA浓度调整至相同数值。
- 除样本外，还需设置对照反应。使用无模板对照以检测试剂中的污染并验证引物质量。为确认无基因组DNA残留，运行无逆转录（non-RT）对照。这两个对照反应在实时PCR中均应为阴性（无荧光信号）。
- 为确保不同样本间转录水平一致，至少使用一个参考基因。本实验中设计了编码肌动蛋白（actin）的引物对（正向：5'-CTCTTAACCCCAAAGCAAACAGG-3'，反向：5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3'）和18S rRNA的引物对（正向：5'-CTTGATTCTATGGGTGGTGGTG-3'，反向：5'-GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3'）。目标基因为TLP（正向：5'-GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3'，反向：5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3'）。各扩增片段大小约为100 bp。
- 对于25 μl的反应体系，加入12.5 μl 2× SYBR Green QPCR Master Mix、cDNA（≥20 ng）、每种引物各400 nM，以及30 nM的被动参比染料ROX（随试剂盒提供）。用无核酸酶水将反应体积调整至25 μl。
- 在QPCR热循环仪中按以下程序运行反应：95 °C预变性10 min以激活聚合酶；随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性30 sec、61 °C退火60 sec、72 °C延伸1 min；最后进行溶解曲线分析（95 °C 60 sec、55 °C 30 sec、95 °C 30 sec）。溶解曲线用于判断是否存在引物二聚体，后者可通过额外的峰信号检出。
- 采用Liu和Saint8提出的方法测定每个PCR反应的扩增效率（E）。效率可通过扩增曲线线性部分计算得出。此处将某一循环数（CPA）的相对扩增子数量（Rn, A）与另一循环数（CPB）的扩增子量（Rn, B）相关联。
- 使用相对表达软件工具（Relative Expression Software Tool, REST 2009，http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html）或类似软件分析实时PCR结果。利用该程序计算处理样本中目标基因相对于对照样本的表达比值。
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结果
为了从 Nepenthes 捕虫笼组织中分离单个腺体，开发并应用了一种机械化的显微解剖技术。显微操作平台需配备与显微操作器相连的显微镊子，并通过控制面板进行操作。在显微镜下可见的单个腺体可用镊子夹取并机械移除（图4A）。
将腺体组织直接转移至PCR管中以进行后续分析（图4B）。由于去除腺体后暴露出其下方的植物维管系统，因此可观察到腺体去除的成功情况（图4A）。
为了进一步验证该制备方法的质量与效率，并确保其是一种有效的方法，进行了PCR分析。选择了一个候选基因——来自Nepenthes gracilis的甜蛋白样蛋白（thaumatin-like protein, TLP）（NCBI登录号 DQ352144），并成功进行了扩增（图4C）。然而，不仅能够检测单个基因，还可直接有效地分离总RNA和mRNA，并用于cDNA的合成。再次利用TLP基因，通过PCR扩增...
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讨论
长期以来，对植物分泌结构尤其是腺毛的研究主要集中在解剖学层面，且多为描述性工作。此类研究文献数量众多，已在若干综述中得到系统总结。9-11尽管早期已有一些出色的研究，但我们对植物分泌结构的生化与分子层面的认识仍然有限 例如 在薄荷腺毛中表明，单萜类化合物在腺毛中生物合成，并分泌至角质层下空间12因此，有必要开发工具和分离技术，以独立研究这些特化的器官。直接获取这些腺体将有助于深入探究和理解植物分泌系统中的生理和分子过程。此外，还可研究在分泌物生物合成与转运中起关键作用的基因功能，以及此类高度特化器官的发育调控机制。
需要强调的是，许多分泌腺的产生和分泌能力使其成为植物代谢工程的主要靶点，在人类健康或持久作物保护等多个领域具有潜在应用价值13,14。此外，这些不同结构的分泌物在植物与其非生物和生物环境（特别是与昆虫）的相互作用中发挥着重要作用。分泌的化合物可作为传粉昆虫的引诱剂，例如腺毛产生的挥发性单萜类物质芳樟醇，以及花蜜腺分泌的糖类15。抗昆虫害虫是另一个重要方面，已有大量相...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
感谢耶拿弗里德里希·席勒大学植物园马克斯·普朗克化学生态研究所温室团队种植植物，感谢威廉·博兰德和马克斯·普朗克学会提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RNAqueous-Micro 试剂盒 | Life Technologies GmbH, Germany | AM1931 | 总 RNA 提取，50 个样品 |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro 试剂盒 | Life Technologies GmbH, Germany | 61011 | 5 ml Dynabeads Oligo (dT)25 |
| DynaMag-2 磁力架 | Life Technologies GmbH, Germany | 12321D | |
| SuperScript CellsDirect cDNA 合成系统 | Life Technologies GmbH, Germany | 18080-200 | 25 次反应 |
| RNaseOUT | Life Technologies GmbH, Germany | 10777-019 | RNase 抑制剂，5,000 单位 |
| 随机六聚体引物（0.4 μg/μl） | QIAGEN GmbH, Germany | 79236 | 100 μl |
| 10 mM dNTP 混合液，分子生物学级 | Fermentas GmbH, Germany | R0192 | 1 ml |
| Taq DNA 聚合酶（重组） | Fermentas GmbH, Germany | EP0402 | 附带 10x Taq 缓冲液（含 KCl 或 (NH4)2SO4) 和 25 mM MgCl2 |
| TURBO DNase | Life Technologies GmbH, Germany | AM2238 | 1,000 单位 |
| 琼脂糖 | Carl Roth GmbH Co. Germany | T846.3 | |
| GeneRuler 低分子量 DNA Marker，即用型 | Fermentas GmbH, Germany | SM1193 | 50 μg |
| Brilliant II SYBR Green QPCR 主混合液 | Agilent Technologies, Inc., USA | 600828 | 单个试剂盒 |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | R2020 | |
| 剃刀刀片 | Carl Roth GmbH Co., Germany | CK08.1 | |
| 镊子 | Carl Roth GmbH Co., Germany | 2801.1 / 2855.1 | |
| GE NanoVue 分光光度计 | GE Healthcare Europe GmbH, Germany | 28-9569-62 | |
| Mastercycler gradient | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5331 000.010 | |
| Mx3000P 实时荧光定量 PCR 系统 | Stratagene, USA | 401403 | |
| Agagel 标准水平琼脂糖凝胶电泳槽 | Biometra | 已停产 | |
| 显微操作仪 | aura optik gmbh | aureka | 配备显微镊 |
| 体视显微镜 | Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | SteREO Lumar.V12 | 配备 AxioCam 相机 |
| Lumar 滤光片组 01 | Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Germany | 485001-0000-000 | 紫外滤光片 |
| Lumar 滤光片组 09 | Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Germany | 485009-0000-000 | 非紫外滤光片 |
参考文献
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