从食虫植物组织中分离具有活性的多细胞腺体 猪笼草

摘要

植物腺体是特化的结构，负责生物合成和分泌多种参与生物环境相互作用的化合物。为了便于研究其分子和生化特性，已建立一种机械显微分离技术，用于分离单个具有代谢活性的腺体，此处以食虫植物Nepenthes为例。

摘要

许多植物具有特化的结构，参与合成和分泌特定的小分子量化合物和蛋白质。这些结构几乎总是定位于植物表面，例如蜜腺或腺毛。所分泌的化合物常在与生物环境的相互作用中发挥作用，例如作为传粉者的吸引剂或抵御植食性动物的驱避剂。

在食虫植物中可以发现一些在多个方面都具有独特性的腺体。在被称为猪笼草属（Nepenthes）的捕虫笼植物中，其陷阱内部具有双功能腺体：一方面可分泌消化液，包括消化猎物所需的所有酶类；另一方面则吸收猎物分解后释放的营养物质。因此，这类腺体是一种理想的特化组织，非常适合用于研究植物中蛋白质分泌和营养吸收相关的分子、生化及生理机制。此外，许多具有腺体结构的植物通常会合成次生代谢产物，这些化合物的生物合成过程也可直接在腺体中进行研究。

为了研究这些特殊结构，需要高效、快速地分离出具有代谢活性且无其他组织污染的样本。因此，开发并应用了一种机械微分离技术用于相关研究 猪笼草 消化液。本文介绍了一种已成功用于制备单个双功能腺体的方案 猪笼草属 基于机械化微采样平台的陷阱。腺体可经分离后，在制备RNA后直接用于PCR技术进行基因表达分析。

引言

植物能够产生多种多样的化合物，这些化合物具有广泛的工业和药用价值，其分子大小从低分子量分子到聚合物不等。这些化合物通常由高度特化的结构合成并分泌，其中许多结构位于植物表面，例如腺毛或蜜腺，另一些则位于植物内部，例如分泌细胞（idioblasts）、乳胶管或树脂道。然而，尽管这些特化的分泌结构普遍表现出活跃代谢的多种特征，目前对其生物学特性的了解仍然相对有限。特别是食虫植物（如Nepenthes）的腺体，可被视为植物细胞生物学研究的理想模型系统¹。

食虫植物自1875年查尔斯·达尔文（Charles Darwin）出版《食虫植物》以来，一直是多项研究的对象²然而，直到最近几年，才开始在分子水平上开展相关研究，目前我们的认知仍然有限。例如，猪笼草属植物捕虫笼消化液中的蛋白质组成 猪笼草 尚不完全清楚。直到最近才鉴定出几种水解蛋白以及相应的少数基因³。在陷阱诱捕器中 猪笼草属 (图1), 多细胞腺体位于捕虫瓶内底部，这些腺体既能向捕虫瓶液体中产生并分泌消化酶，又能从捕虫瓶液体中吸收溶解的营养物质⁴因此，这些双功能腺体代表了一种独特的微组织，在食肉植物的捕食过程中具有核心位置和功能 猪笼草属 值得深入研究。

方案

1. 植物材料准备

1. 所有猪笼草属（Nepenthes）物种均种植于德国耶拿的马克斯·普朗克化学生态研究所温室或耶拿植物园内。
2. 为制备分泌组织，采集一个捕虫笼，切去包含笼盖、唇和滑溜区在内的上三分之一部分。捕虫笼可直接新鲜使用，或经液氮速冻后于 -80 °C 保存。

2. 捕虫器组织的显微解剖

1. 微量取样平台由一台体视显微镜和一个显微操作器组成，该显微操作器直接连接在显微镜主体上，并通过三维摇杆进行操作。此处使用了 aureka 的早期原型，如图所示（图 2A）。
2. 为从 Nepenthes 捕虫笼中解剖分泌腺，请使用显微镊子并将其连接至显微操作器上（图 2A 和 2B）。
3. 用于 RNA 提取时，所有仪器（刀片、镊子、显微操作器、显微镊子、载玻片）均需用 RNaseZAP 处理。
4. 准备收集管：在 PCR 管中加入 9 μl 无核酸酶水和 1 μl RNase 抑制剂，用于 RNA 提取。若需直接从组织样本进行 PCR，则仅加入无核酸酶水（10 μl）。
   1. 取新鲜或冷冻的捕虫笼，使用刀片和镊子切下一小块含有分泌腺的组织（面积为 1–2 cm²）。用水清洗组织；若将进....

结果

为了从 Nepenthes 捕虫笼组织中分离单个腺体，开发并应用了一种机械化的显微解剖技术。显微操作平台需配备与显微操作器相连的显微镊子，并通过控制面板进行操作。在显微镜下可见的单个腺体可用镊子夹取并机械移除（图4A）。

将腺体组织直接转移至PCR管中以进行后续分析（图4B）。由于去除腺体后暴露出其下方的植物维管系统，因此可观察到腺体去除的成功情况（图4A）。

为了进一步验证该制备方法的质量与效率，并确保其是一种有效的方法，进行了PCR分析。选择了一个候选基因——来自Nepenthes gracilis的甜蛋白样蛋白（thaumatin-like protein, TLP）（NCBI登录号 DQ352144），并成功进行了扩增（图4C）。然而，不仅能够检测单个基因，还可直接有效地分离总RNA和mRNA，并用于cDNA的合成。再次利用TLP基因，通过PCR扩增.......

讨论

长期以来，对植物分泌结构尤其是腺毛的研究主要集中在解剖学层面，且多为描述性工作。此类研究文献数量众多，已在若干综述中得到系统总结。^9-11尽管早期已有一些出色的研究，但我们对植物分泌结构的生化与分子层面的认识仍然有限 例如 在薄荷腺毛中表明，单萜类化合物在腺毛中生物合成，并分泌至角质层下空间¹²因此，有必要开发工具和分离技术，以独立研究这些特化的器官。直接获取这些腺体将有助于深入探究和理解植物分泌系统中的生理和分子过程。此外，还可研究在分泌物生物合成与转运中起关键作用的基因功能，以及此类高度特化器官的发育调控机制。

需要强调的是，许多分泌腺的产生和分泌能力使其成为植物代谢工程的主要靶点，在人类健康或持久作物保护等多个领域具有潜在应用价值^13,14。此外，这些不同结构的分泌物在植物与其非生物和生物环境（特别是与昆虫）的相互作用中发挥着重要作用。分泌的化合物可作为传粉昆虫的引诱剂，例如腺毛产生的挥发性单萜类物质芳樟醇，以及花蜜腺分泌的糖类¹⁵。抗昆虫害虫是另一个重要方面，已有大量相.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNAqueous-Micro 试剂盒	Life Technologies GmbH, Germany	AM1931	总 RNA 提取，50 个样品
Dynabeads mRNA DIRECT Micro 试剂盒	Life Technologies GmbH, Germany	61011	5 ml Dynabeads Oligo (dT)25
DynaMag-2 磁力架	Life Technologies GmbH, Germany	12321D
SuperScript CellsDirect cDNA 合成系统	Life Technologies GmbH, Germany	18080-200	25 次反应
RNaseOUT	Life Technologies GmbH, Germany	10777-019	RNase 抑制剂，5,000 单位
随机六聚体引物（0.4 μg/μl）	QIAGEN GmbH, Germany	79236	100 μl
10 mM dNTP 混合液，分子生物学级	Fermentas GmbH, Germany	R0192	1 ml
Taq DNA 聚合酶（重组）	Fermentas GmbH, Germany	EP0402	附带 10x Taq 缓冲液（含 KCl 或 (NH4)2SO4) 和 25 mM MgCl2
TURBO DNase	Life Technologies GmbH, Germany	AM2238	1,000 单位
琼脂糖	Carl Roth GmbH Co. Germany	T846.3
GeneRuler 低分子量 DNA Marker，即用型	Fermentas GmbH, Germany	SM1193	50 μg
Brilliant II SYBR Green QPCR 主混合液	Agilent Technologies, Inc., USA	600828	单个试剂盒
RNaseZAP	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	R2020
剃刀刀片	Carl Roth GmbH Co., Germany	CK08.1
镊子	Carl Roth GmbH Co., Germany	2801.1 / 2855.1
GE NanoVue 分光光度计	GE Healthcare Europe GmbH, Germany	28-9569-62
Mastercycler gradient	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5331 000.010
Mx3000P 实时荧光定量 PCR 系统	Stratagene, USA	401403
Agagel 标准水平琼脂糖凝胶电泳槽	Biometra	已停产
显微操作仪	aura optik gmbh	aureka	配备显微镊
体视显微镜	Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	SteREO Lumar.V12	配备 AxioCam 相机
Lumar 滤光片组 01	Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Germany	485001-0000-000	紫外滤光片
Lumar 滤光片组 09	Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Germany	485009-0000-000	非紫外滤光片