利用压力肌动图评估肠系膜阻力动脉的肌源性反应和血管活性

摘要

压力肌动描记法用于评估小动脉在加压时产生持续性收缩的血管活性。本文提供了一项详细方案，用于评估从大鼠分离的小肠系膜动脉节段的血管活性，以及管腔内压力对血管直径的影响。

摘要

小阻力动脉分别在管腔内压力升高或降低时发生收缩和舒张；这种现象称为肌源性反应，是局部血流的关键调节机制。在等压条件下，小阻力动脉会产生持续性收缩，称为肌源性张力（MT），这是全身血管阻力（SVR）的主要决定因素之一。因此，ex vivo 加压的小阻力动脉制备物是研究微血管功能在接近生理状态下的重要工具。为实现这一目标，将一段新分离的完整小阻力动脉（直径约260 μm）套在两根细玻璃套管上并进行加压。这些动脉制备物保留了大部分in vivo的特性，可实现实时评估血管张力。本文提供了一种详细方案，用于评估大鼠加压状态下小阻力肠系膜动脉的血管活性；当压力维持在70 mmHg时，这些动脉会发展出持续的血管收缩——约为最大直径的25%。这些动脉制备物可用于研究实验性化合物对动脉内压力与血管活性之间关系的影响，并确定多种疾病动物模型中微血管功能的变化。

引言

小阻力动脉是系统性血管阻力（SVR）的主要决定因素，在多种疾病的病理生理过程中发挥重要作用^1,2。糖尿病³、妊娠⁴、缺血-再灌注⁵、肥胖和高血压^6,7等状态常伴有微血管功能的改变。血管肌张力测定不仅可深入揭示各种疾病中微血管功能的变化，还有助于识别治疗靶点并评估血管活性化合物的疗效。血管功能的研究可通过在等长或等压条件下离体培养的小动脉进行⁸。等长肌张力测定的详细描述见其他文献⁹。然而，等长与等压制备所获得的数据存在差异^10-12。由于加压动脉制备可在接近生理条件下研究微血管功能，所得结果可能更贴近血管床的体内行为^8,13。

1902年，Bayliss首次描述了跨壁压对血管直径的影响¹⁴。他观察到，在来自兔、猫和狗不同血管床的小阻力动脉中，压力降低会引起血管舒张，而压力升高则会引起血管收缩。这一现象被称为肌源性反应。Bayliss及后续研究者发现，在等压条件下，小阻力动脉会产生持续性收缩，称为肌源性张力（MT）^15,16。肌源性反应和MT均可通过压力肌张力测定法（PM）进行评估。PM主要用于测定小动脉、静脉及其他血管的血管活性。除了评估血管活性化合物对血管直径的影响外，PM顾名思义还可用于评估血管内压力介导的血管直径变化....

方案

此处所示示例来自佐治亚州立大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准的实验——方案编号：# 2011-0408

1. 试剂的准备

1. 配制解剖液母液：配制500 ml 5倍浓缩的解剖液母液，溶解21.18 g NaCl、0.875 g KCl、0.739 g MgSO₄·7H₂O、1.361 g NaH₂PO₄·H₂O、1.55 g NaHCO₃、1.8 g葡萄糖和0.5 g牛血清白蛋白（BSA）于去离子水中，用去离子水定容至500 ml。使用前用去离子水稀释至1倍工作浓度。₄，将1.049 g MOPS和0.019 g EDTA溶于450 ml Milli-Q水中，用1 N NaOH调节pH至7.3–7.4，再用Milli-Q水定容至500 ml。该贮存液可保存7–10天。参见 表1 有关化学品及其供应商的列表，请参见 表2 用于表示浓度单位为 mM。
2. 配制工作用解剖液：每天新鲜配制工作用解剖液。配制100 ml工作液时，溶解0.091 g葡萄糖、0.016 g NaH₂PO₄ 以及0.022 g丙酮酸钠溶于79.8 ml Milli-Q水中。加入0.2 ml 1 M CaCl₂。₂ 加入20 ml解剖液原液以定容至100 ml。
3. 制备生理盐溶液（PSS）：配制....

结果

典型的压力肌动图装置示意图如图1所示。血管两端分别用玻璃微移液管插管，并在两侧用缝线固定。通过导管和一个开放的旋塞阀，其中一个插管连接至伺服控制的压力调节器；另一个插管则连接至一个封闭的旋塞阀。腔室用PSS灌流，通过连接了CCD相机的倒置显微镜观察血管直径的变化。

在70 mmHg压力下固定的动脉节段被孵育于新鲜配制的温热PSS中，PSS以2–4 ml/min的流速流经动脉腔室并被吸出。通过显微录像和边缘检测软件监测并记录动脉直径。约40分钟后，动脉节段自发收缩至初始直径的20–40%（图2A）。在本实验室条件下，小鼠小阻力动脉通常收缩25–30%（平均值因实验条件、操作者及动脉床的不同而有所变化）。随后，通过乙酰胆碱（ACh，1 μM）和苯肾上腺素（Phe，1 μM）引起的舒血管和缩血管反应评估动脉的功能活性（图2A）。尽管可使用其他舒血管药物，但ACh可诱导内皮依赖性舒张，因此可用于同时评估内皮细胞和血管平滑肌的功能活性。随后将动脉节段重新置于PSS中孵育，待直径稳定后即可用于.......

讨论

关键步骤、故障排除与改进方法

在典型的等压血管制备过程中，将动脉置于两根玻璃微管之间，并用温暖的（37 °C）生理盐溶液（PSS）灌流，加压至70 mmHg。经过30–45分钟后，动脉会发展出肌源性张力（MT），表现为管径自发性减小，并在20–30分钟内趋于稳定。来自不同血管床的阻力动脉所发展的MT程度各不相同。例如，大鼠肠系膜阻力动脉的MT约为最大管径（PD）的25%，而提睾肌动脉的MT可达PD的约40%。若动脉在60分钟内未能形成MT，则应予以弃用；该时间阈值可能因血管床和物种不同而有所变化。对苯肾上腺素（Phe）和乙酰胆碱（ACh）反应不足的动脉也应弃用。

PSS 的 pH 值和温度对肌源性张力（MT）的形成具有显著影响。PSS 若长时间未充气，其 pH 值可能升高。此外，在室温下血管通常难以形成肌源性张力。因此，应尽快使用方案部分所述的气体混合物对 PSS 进行充气，并持续监测灌流腔室的温度，利用流体加热器将其维持在约 37 °C。

由于这些实验持续3-5小时，灌流室及.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学
乙酰胆碱	Sigma Aldrich	A6625
氯化钙（CaCl₂）2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-葡萄糖	Sigma Aldrich	G5767
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N’，N’四乙酸（EGTA）	Sigma Aldrich	E3889
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
硫酸镁（MgSO₄）4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
去氧肾上腺素	Sigma Aldrich	P6126
氯化钾（KCl）	Sigma Aldrich	P3911
磷酸氢二钾（KH₂PO₄）2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
碳酸氢钠（NaHCO₃）3 )	Sigma Aldrich	S6014
氯化钠（NaCl）	Sigma Aldrich	S7653
氢氧化钠（NaOH）	Sigma Aldrich	S5881
硝普钠	Sigma Aldrich	13451
磷酸二氢钠一水合物（NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
丙酮酸钠	Sigma Aldrich	P8574
表1.
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生理盐溶液（1,000 ml）	mM
KCl	4.9	0.365 g
NaCl	112	6.545 g
MgSO₄4.7H2O	1.2	0.296 g
KH2PO4	1.2	0.163 g
葡萄糖	11.5	2.072 g
NaHCO₃3	26	2.184 g
HEPES	10	2.383 g
CaCl2	2	2 ml（1 M 原液）
去离子水		998 ml
钙2+ 自由生理盐溶液（100 ml）	mM
KCl	4.9	0.036 g
NaCl	112	0.645 g
MgSO₄4.7H2O	1.2	0.029 g
KH2PO4	1.2	0.016 g
葡萄糖	11.5	0.207 g
NaHCO₃3	26	0.218 g
HEPES	10	0.238 g
EGTA	0.39	0.015 g
硝普钠	0.1	0.0026 g
去离子水		100 ml
解剖液，储备液（500 ml）	mM
NaCl	145	21.18 g
KCl	4.7	0.875 g
MgSO₄4	1.2	0.739 g
MOPS	2	1.049 g
EDTA	0.02	0.019 g
去离子水		500 ml
工作解剖液（100 ml）	mM
解剖液原液	20 ml
葡萄糖	1.2	0.091 g
NaH2PO4	5	0.016 g
丙酮酸钠	2	0.022 g
CaCl2	2	0.2 ml（1 M 储液）
去离子水		79.8 ml

表2. 实验溶液的组成设备CCD 黑白相机成像源DMK 21AU04单通道 inline 溶液加热器Warner Instruments64-0102热敏电阻器Warner Instruments64-0108双自动温度控制器Warner InstrumentsTC-344BFlaming/Brown 微电极拉制仪Sutter InstrumentsP-97荧光系统接口IonOptixmodel FSI-700镊子和剪刀 World Precision Instruments离子向导核心与分析IonOptixIon Wizard 6.0实验室管路硅胶508-005雄性 斯普拉格-道利 大鼠Harlan LaboratoriesMaster flex 控制台驱动器Cole-parmerMilli-Q Plus 超纯水系统MilliporeZD5211584眼科单丝尼龙缝合线 Ethicon9007G测光与尺寸测量显微镜MoticAE31带蠕动泵和压力传感器的压力伺服控制器活体系统仪器PS-200体视显微镜尼康仪器公司SMZ660血管腔室活体系统仪器CH-1解剖皿活体系统仪器DD-90-S薄壁玻璃毛细管世界精密仪器公司TW120-6显微操作仪斯托尔廷51550表3.