野生动物中寄生虫的采集与鉴定

摘要

野生动物通常寄生有多种多样的蠕虫。  蠕虫主要包括四类：“线虫”（nematodes）、“棘头虫”（acanthocephalans）、“吸虫”（trematodes）和“绦虫”（cestodes）。  本文描述了如何从脊椎动物体内采集蠕虫，以及如何对这些蠕虫进行保存、分类和鉴定。 

摘要

野生动物通常寄生有多种多样的蠕虫。主要的四类蠕虫包括"线虫"（nematodes）、"棘头虫"（acanthocephalans）、"吸虫"（trematodes）以及"绦虫"（cestodes）。采集蠕虫的最佳方法是检查死亡时间少于4–6小时的宿主，因为大多数蠕虫在此期间仍处于存活状态。应进行全面的尸体解剖，并仔细检查所有主要器官。将器官在流水下冲洗至106 μm的筛网上，收集冲洗液并在体视显微镜下检查内容物。统计所有蠕虫的数量，并选取代表性样本进行固定（可使用70%乙醇、10%缓冲福尔马林或乙醇-福尔马林-乙酸溶液）。对于物种鉴定，线虫和小型棘头虫可采用乳酚油透明处理，而吸虫、绦虫及大型棘头虫则需使用哈里斯苏木精染色法或塞米雄卡明染色法进行染色。通过观察不同形态结构（e.g. 线虫的雄性交合刺或绦虫的顶突）进行物种分类鉴定。此处所述方案适用于任何脊椎动物。操作者需具备识别不同器官的能力，并能将蠕虫与其它组织碎片或肠道内容物区分开来。采集、保存和染色均为简单易行的技术，所需仪器和试剂极少。分类学鉴定，尤其是种级鉴定，可能非常耗时，有时需要将标本送交专家或进行DNA分析。

引言

脊椎动物寄生有四大类蠕虫（helminths）。其中两类属于扁形动物门（Phylum Platyhelminthes），即吸虫纲（trematodes，或称flukes）和绦虫纲（cestodes，或称tapeworms）。另外两类为线虫动物门（Nematoda）的线虫（nematodes，或称roundworms）和棘头动物门（Acanthocephala）的棘头虫（acanthocephalans，或称thorny-headed worms）。许多此类寄生虫已被证实可导致野生鸟类和哺乳动物发病和死亡^1,2。

大多数寄生蠕虫具有复杂的生活史，涉及一个以上的宿主^1,2 。例如，吸虫类需要一个或两个中间宿主（通常为无脊椎动物）以及一个终末宿主。只有当所有宿主均存在时，生活史才能完成，从而使得成虫寄生在终末宿主中（这也是本文讨论的重点）。因此，必须认识到某些寄生蠕虫物种的感染率和感染强度可能存在季节性波动，进行长期监测有助于全面掌握特定宿主的寄生蠕虫区系组成。

收集寄生蠕虫的最佳方法是检查已被实施安乐死的宿主。这种方法可以在寄生虫仍存活时进行采集，并使其正确舒展和固定。宿主死亡超过24小时，或经过冷冻与解冻后用于检查的材料，通常质量较差且难以鉴定。来自冷冻或经福尔马林固定的宿主的吸虫和绦虫常常严重收缩，失去对鉴定至关重要的结构，例如吸虫的口棘或绦虫头节上的钩子。然而实际情况是，目前....

方案

以下实验所用动物均为路杀后发现的死亡个体。

1. 动物尸检及主要器官的寄生虫采集筛查

1. 将动物置于平坦的表面上，使用放大镜检查所有外部开口，包括耳部、口腔和眼睛，观察是否存在线虫（圆形）和吸虫（扁平且无节片）（参见 图 1).
2. 若操作对象为鸟类，解剖前需用自来水冲洗以浸湿羽毛。
3. 使用锋利的刀片或手术刀，在解剖镊的辅助下，沿腹腔区域做切口，注意避免刺破任何器官。对于具有坚硬背甲的龟类，使用手持锯在胸盾与腹盾之间的桥区骨质部位进行切割。
4. 打开胸腔的方法同上；对于大型动物，可能需要使用骨剪或小型手持锯来切断肋骨。
5. 若操作鸟类，需检查气囊 原位 在移除任何器官之前，如有需要，可使用放大镜。
6. 检查两个腔体中是否存在丝虫类线虫和大型吸虫。
7. 在将胃肠道从腹腔中取出之前，于食管起始处附近结扎一根线，另在大肠末端（直肠）结扎一根线。
8. 将以下胸腔器官分别放入培养皿（若器官过大则使用玻璃托盘）中，以便在体视显微镜（10–30×）下进行检查：心脏及主要血管、气管和肺。
9. 取出肝脏、胆囊及胆管、胰腺、脾脏、肾脏和膀胱，并按照步骤1.8所述进行检查。
10. 移除完整的消化系统，并将每一段放入玻璃皿/托盘中。
11. 器官取出后，用装有0.9....

结果

根据上述方法，于2007年至2011年间在美国蒙大拿州米苏拉县对 masked shrew（Sorex cinereus）的寄生蠕虫进行了调查。共采集56只鼩鼱，通过陷阱捕获后在死亡2小时内进行检查。总体感染率为96%；仅有2只鼩鼱未发现寄生虫。共鉴定出15种寄生蠕虫，包括9种绦虫和6种线虫。其中，绦虫属Staphylocystoides中有一个物种此前尚未被描述。受感染的器官包括小肠（9种绦虫、3种线虫）、胃（1种线虫）、肺（1种线虫）和膀胱（1种线虫）。每只感染宿主体内的总虫数（感染强度）为7–234条。每只感染宿主所携带的寄生蠕虫物种数（物种丰富度）为1–8种，平均为4.1种（图2）。

讨论

即使仅鉴定到属，基于质量较差的标本也极难识别寄生蠕虫。绦虫和吸虫尤其在宿主死亡后会迅速死亡并退化。绦虫的分类在很大程度上依赖于头节钩的数量、大小和形状，而这些结构在冷冻标本中常常丢失。同样，某些在口吸盘周围具有棘刺的吸虫（如棘口吸虫和异形吸虫）的棘刺也经常脱落。由于具有较厚的角质层，线虫和棘头虫相对更耐保存，但仍可能出现收缩或吻部回缩的情况。因此，获取尽可能新鲜的标本的重要性再怎么强调也不为过。理想情况下，应捕获活体宿主，实施安乐死后立即进行检查。若无法做到，则应在宿主死亡后3至4小时内完成检查，或尽快将其冷冻。在采集宿主后立即取出肠道组织，并用液氮进行速冻，可获得极佳的标本材料。即使仅能对少数宿主进行新鲜检查，并正确鉴定其中的寄生蠕虫，也可能有助于对后续来自冷冻标本的物种进行分类。宿主死亡后，寄生蠕虫可能在体内发生移动，因此在尸体解剖过程中描述寄生虫位置时，必须考虑这一因素。

使用筛子筛选肠道内容物以及用水冲洗其他器官上的血液，是对早期尸检方法的重要改进。该方法显著提高了检出较小蠕虫的机会，并改善了定量分析效果。将绦虫和吸虫在热水中杀死后，所获得的标本比未经处理的更适用于染色&#.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
固定
乙醇-福尔马林-冰醋酸（AFA）	费舍尔科技公司	A407-1 (ethanol) F75F-1GAL (formaldehyde) BP2401500 (glacial acetic acid)	乙醇 85% (85 ml) + 甲醛 37% (10 ml) + 冰醋酸 (5 ml)
用于杀死和长期保存的乙醇	费舍尔科技公司	A407-1	乙醇 100% (70 ml) + 蒸馏水 (30 ml)
用于固定和DNA研究的乙醇	费舍尔科技公司	AC61511-0010	乙醇 80-90% (80-90 ml) + 蒸馏水 (20-10 ml)，分别对应
缓冲福尔马林	费舍尔科技公司	SF100-4	福尔马林 10% (10 ml) + 蒸馏水 (90 ml)
甘油-乙醇混合液	费舍尔科技公司	A407-1 (ethanol) AC15365-1000 (glycerine)	乙醇 70% (95 ml) + 甘油 (5 ml)
透明、染色与封片
染色过程中用于脱水的乙醇	费舍尔科技公司	A407-1	乙醇 80%、95%、100% (80 ml、95 ml、100 ml) + 蒸馏水 (20 ml、5 ml、0 ml)
乳酸苯酚	费舍尔科技公司	R400-27	-
苯酚	费舍尔科技公司	A931I-1 (phenol) A407-1 (ethanol)	苯酚 100% (80 ml) + 乙醇 100% (20 ml)
Harris’ 苏木精	费舍尔科技公司	S25347 (hematoxylin) A407-1 (ethanol) A567-500 (ammonium aluminum sulfate) S25553 (sodium iodate)	苏木精 (5 g) + 乙醇 100% (50 ml) + 硫酸铝铵 (100 g) + 碘酸钠 (0.37 g) + 蒸馏水 (1,000 ml)
Semichon’s 乙酸洋红	费舍尔科技公司	BP2401500 (glacial acetic acid) S25236 (carmine) A407-1 (ethanol)	冰醋酸 (100 ml) + 洋红 (1.5 g) + 蒸馏水 (100 ml)。在沸水浴中加热15分钟，冷却后过滤制成储备液。使用时与70%乙醇按1:2比例混合进行染色。
二甲苯	费舍尔科技公司	X4-4	仅可在化学通风橱中使用。
水杨酸甲酯	费舍尔科技公司	S25437	-
碱性乙醇	费舍尔科技公司	A407-1 (ethanol) S25159A (concentrated ammonium hydroxide)	乙醇 70% (100 ml) + 氨水 (0.1 ml)
酸性乙醇	费舍尔科技公司	A407-1 (ethanol) SA9233-100 (hydrochloric acid)	乙醇 70% (99.5 ml) +  盐酸 (0.5 ml)
加拿大树胶	费舍尔科技公司	B10-100	-