野生动物的蠕虫收集和鉴定

脊椎动物被四大类蠕虫（蠕虫）寄生。其中两组，吸虫或吸虫，以及绦虫或绦虫，属于扁形蠕虫门。另外两组是线虫或蛔虫 （Nematoda） 和棘头虫或棘头虫 （Acanthocephala）。其中许多寄生虫已被记录为野生鸟类和哺乳动物发病和死亡的原因^1,2。

大多数蠕虫的生命周期很复杂，涉及不止一个宿主^1,2 。例如，吸虫有一个或两个中间宿主（通常是无脊椎动物）和一个最终宿主。所有宿主都需要可用才能完成周期，因此成年蠕虫才能出现在最终宿主中（这是本手稿的主题）。因此，重要的是要记住，某些蠕虫物种的流行率和强度可能会出现季节性波动，需要长期监测以捕捉特定宿主的完整蠕虫。

收集蠕虫的最佳方法是检查已被安乐死的宿主。这允许在蠕虫还活着时收集它们，并让它们得到适当的放松和固定。来自已死亡超过 24 小时或已冷冻和解冻以供检查的宿主的材料通常较差且难以识别。来自冷冻或正式化宿主的吸虫和绦虫通常严重收缩，并且丢失了对鉴定至关重要的结构，如吸虫上的口腔棘或绦虫头节上的钩子。然而，现实情况是，如今脊椎动物宿主提供的大多数材料都是冷冻或保存的。

包含蠕虫 DNA 序列信息的数据库正在迅速增长，因此许多物种的分类学鉴定已经成为可能。因此，应尽可能保留蠕虫以进行潜在的 DNA 分析。然而，如果标本固定在福尔马林中，就不可能获得高质量的 DNA。此处概述的收集和杀死蠕虫的方法将产生适合 DNA 提取和遗传分析的材料。

下面，我们详细介绍了如何对脊椎动物（两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物;不包括鱼类的单基因吸虫）进行尸检以收集蠕虫的方法，然后是如何保存和处理它们以进行分类鉴定的程序。

以下实验中使用的动物被发现死于道路杀戮。

1. 动物尸检和蠕虫采集主要器官的筛选

1. 将动物放在平坦的表面上，用放大镜检查所有外部开口，包括耳朵、口腔和眼睛，看看是否存在线虫（圆形）和吸虫（扁平且未分段）（见图 1）。
2. 如果与鸟类一起工作，请在解剖前用自来水清洗以弄湿羽毛。
3. 使用锋利的刀片或刀，并借助一对解剖钳，在腹腔上切开，小心不要破裂任何器官。对于甲壳坚硬的海龟，使用手持锯切开胸鳞片和腹鳞片之间鼻梁区域的骨头。
4. 如上所述打开胸腔;对于大型动物，可能需要骨头切割器或小型手持锯来切割肋骨。
5. 如果与鸟类一起工作，请在去除任何器官之前原位检查气囊。如果需要，请使用放大镜。
6. 检查两个腔中是否有丝虫蛔虫和大吸虫。
7. 在从腹腔中取出胃肠道之前，在靠近食管起点的地方系一根线，在大肠（直肠）末端系一根线。
8. 将以下胸部器官分成培养皿（如果器官太大，则分为玻璃盘）在立体显微镜 （10-30X） 下检查：心脏和主要血管、气管和肺。
9. 切除肝脏、胆囊和导管、胰腺、脾脏、肾脏和膀胱，并按照步骤 1.8 中的说明进行检查。
10. 取出完整的消化系统，将每个部分放入玻璃盘/托盘中。
11. 取出器官后，用装满 0.9% 盐水的软管或喷瓶清洗体腔，放入 106 μm 网筛中，并在立体显微镜下检查筛子内容物是否存在丝虫或吸虫。
12. 用剪刀打开每个消化道切片，刮擦粘膜并仔细检查是否存在大型寄生虫 （>1 cm）。如果需要，请使用放大镜。棘头动物的长鼻通常深深嵌入肠壁中，可能需要用镊子和/或小剪刀小心地从组织中梳理出来。
13. 将每个打开的部分放在流水下，并按照步骤 1.11 所述将所有内容物洗涤到 106 μm 筛子中。
14. 打开心脏和主要血管（肺和主动脉）、气管、泌尿和胆囊，并以相同的方式检查内容物。
15. 使用锋利的刀片和镊子将肺、肝、肾、脾和胰腺等实体器官切片和梳理开。如步骤 1.11 所述，在流水下将它们清洗到 106 μm 筛子中。
16. 记录发现的寄生虫类型、每种类型的数量以及发现它们的器官。固定和染色方法如下。
17. 通过放置一小块用铅笔书写的普通索引卡来标记样品瓶/罐子（墨水和直纹索引卡会在酒精中"流淌"并染色标本）。

2. 蠕虫的保存

1. 对于需要保存以备后用的蠕虫，请直接放入 80-90% 乙醇（不含甘油）中。乙醇应通过稀释 95% 乙醇制成，最好是试剂级乙醇（表 1）。切勿让这些样本暴露于福尔马林中，因为福尔马林会将 DNA 降解到无法使用的状态。
2. 将活吸虫放在玻璃显微镜载玻片上，加入一滴盐水，放置玻璃盖玻片，然后将载玻片放在火焰上，不要煮沸盐水。
   1. 将玻片放入含有 AFA（醇 - 福尔马林 - 乙酸，见表 1）的培养皿中，让盖玻片浮出。
   2. 在 AFA 中固定一到几天，用自来水冲洗，然后转移到装有 70% 乙醇的 5 ml 玻璃瓶（或更大的玻璃瓶/罐，具体取决于寄生虫的大小和数量）中长期储存。
3. 将死吸虫固定在 AFA 或 10% 缓冲福尔马林中 48 小时，然后转移到装满 70% 乙醇的小瓶/罐中长期储存。
将
4. 接近沸腾的水倒在培养皿中，将活的绦虫倒在培养皿中，然后转移到装满 70% 乙醇的小瓶/罐中进行长期储存。
5. 将活的棘头孢菌放入培养皿中，在冰箱 （~4 °C） 的自来水中放置一到几个小时，直到长鼻完全外翻（这可能需要长达 24 小时）。转移到装有 70% 乙醇或 AFA 的小瓶/罐中长期储存。
6. 将死绦虫和棘头虫与死吸虫相同（见上文）。
7. 在热（接近沸腾）的 70% 乙醇中杀死活的小 （<5 mm） 或脆弱的线虫（例如毛圆线虫、毛细管），并保存在装满 70% 乙醇和 5% 甘油的小瓶/罐中（表 1），以在蒸发的情况下保存蠕虫。
将球菌
8. 放入装有冷冰醋酸的培养皿中（表 1），杀死（并清除）中到大 （>5 mm） 线虫（例如蛔虫、螺旋藻、氧尿虫、丝虫），并在 15 分钟后转移到装有 70% 乙醇和 5% 甘油的小瓶/罐中。乙酸可以通过这种方式重复使用。
9. 将死线虫直接放入装有 70% 乙醇和 5% 甘油的小瓶/罐中。

3. 蠕虫的分类学鉴定

1. 通过将苏木精溶解在酒精中并将硫酸铝铵溶于水中加热来制备 Harris 苏木精。混合两种溶液并煮沸。
   1. 加入碘酸钠，煮沸 2-3 分钟。恢复到室温后过滤（541 滤纸）溶液。
将吸虫
2. 、绦虫和棘头菌留在稀释的 （1：10） 哈里斯苏木精或塞米琼胭脂红中过夜，使吸虫、绦虫和棘头虫过度染色（见表 1）。
   1. 使用 70% 酸性乙醇脱色，直到器官可见（可能需要几秒钟到一个多小时，应密切观察）。
   2. 通过将标本转移到 70% 碱性乙醇中至少 30 分钟来停止脱色。接下来，在一系列分级乙醇（80%、95%、100%）中脱水，并在二甲苯或水杨酸甲酯中清除它们。
   3. 加入一滴加拿大香脂和盖玻片后，将标本安装在显微镜载玻片上。晾干一夜。
3. 在带有盖玻片的显微镜载玻片上的临时乳酚封片中清除小至中线虫和棘头线虫 15-30 分钟。
   1. 对于大型线虫（蛔虫和螺旋虫）和棘头虫，使用 80% 苯酚长达 60 分钟。在光学显微镜 （40-400X） 下检查以评估较小的结构（雄性针状体和钩状物）。
4. 使用以下方法检查特殊结构。
   1. 对于绦绦虫，切掉头节，放在显微镜载玻片上，放入乳酚中，用盖玻片"挤压"，用于测量和计数玫瑰钩（见图 1B）。
   2. 对于线虫，切掉前端，并在显微镜载玻片上正面贴上几滴乳酚（无盖玻片）或甘油果冻以进行永久安装（带盖玻片），并在光学显微镜下观察口器（35-400X）（见图 1D）。
   3. 切掉大线虫的尾巴，用盖玻片安装在乳酚中的显微镜载玻片上，以在光学显微镜下观察雄性的腹侧和针状体形态（见图 1D）。
5. 结合使用原始文献和标准分类参考文献来识别物种的寄生虫，例如：
   1. 吸虫：Yamaguti （1958， 1971）^3,4 和 Gibson 等人。^5-7
   2. 棘头动物：Yamaguti⁸
   3. Cestodes：Yamaguti⁹、Schmidt¹⁰ 和 Khalil 等人。¹¹
   4. 线虫：Yamaguti¹² 和 Anderson 等人。¹³

4. 美国国家寄生虫收藏中的蠕虫存放处

1. 将具有代表性的蠕虫标本存放在美国国家寄生虫收藏中心 （USNPC）。对于大多数寄生虫期刊来说，这是强制性的。提交后，每个蠕虫物种都会被分配一个登录号，以便收录在手稿中。
2. 提交标本时包括以下信息： 1） 寄生虫的学名;2） 宿主信息（物种、地理位置的经/纬度坐标）;3） 在宿主中发现器官;4） 采集标本的人员姓名和采集日期;5） 使用的固定剂、染色剂或透明/封片剂的类型;6） 其他藏品的位置（博物馆和藏品编号），如果其他标本在其他地方提交;7） 出版物和期刊信息。这些数据也应与标本一起发送，并单独包装。
3. 将标本包装在带有防震吸收材料的坚固容器中。用胶带/封口膜螺上玻璃瓶盖，并将每个样品瓶放入单独的塑料袋中。用纸包裹玻片，然后放入载玻片盒中，载玻片盒之间有减震材料。
4. 将标本和包含标本信息的单独信件运送到：美国国家寄生虫收藏馆、美国农业部、ARS、ANRI、Bldg. 1180， BARC-East， 10300 Baltimore Avenue， Beltsville， MD 20705-2350。

使用上述方法，于 2007 年至 2011 年在蒙大拿州米苏拉县对蒙面鼩鼩 Sorex cinereus 的蠕虫进行了调查。共有 56 只鼩鼱从陷阱中收集，并在死后 2 小时内进行检查。感染的总体患病率为 96%;只有 2 只鼩鼱没有寄生虫。共鉴定出 15 种蠕虫，包括 9 种绦虫和 6 种线虫。绦虫属 Staphylocystoides 的一个物种以前没有描述过。发现感染的器官包括小肠（9 个绦虫、3 个线虫）、胃（1 个线虫）、肺（1 个线虫）和膀胱（1 个线虫）。每个受感染宿主的总感染强度为 7-234 条蠕虫。物种丰富度（每个受感染宿主的蠕虫物种数量）范围为 1-8，平均值为 4.1（图 2）。

图 1.蠕虫类群的代表性图画和照片，显示了每个门的主要解剖特征。A） 吸虫;B） 切斯托达;C） 棘头纲;和 D） 线虫。对于照片，包括有关学名、器官和宿主的信息。吸虫和绦虫是雌雄同体的。图纸的比例不一定相同。点击这里查看大图。

图 2.2007 年至 2011 年间从蒙大拿州米苏拉县收集的蒙面鼩 Sorex cinereus 的初步蠕虫数据摘要。 单击此处查看大图。

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