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方法文章

野生动物中寄生虫的采集与鉴定

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DOI：

10.3791/51000

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2013年12月14日

 , 
1Department of Forestry and Natural Resources, Purdue University, 2Helm West Laboratory

本文内容

摘要

野生动物通常寄生有多种多样的蠕虫。  蠕虫主要包括四类：“线虫”（nematodes）、“棘头虫”（acanthocephalans）、“吸虫”（trematodes）和“绦虫”（cestodes）。  本文描述了如何从脊椎动物体内采集蠕虫，以及如何对这些蠕虫进行保存、分类和鉴定。 

摘要

野生动物通常寄生有多种多样的蠕虫。主要的四类蠕虫包括"线虫"（nematodes）、"棘头虫"（acanthocephalans）、"吸虫"（trematodes）以及"绦虫"（cestodes）。采集蠕虫的最佳方法是检查死亡时间少于4–6小时的宿主，因为大多数蠕虫在此期间仍处于存活状态。应进行全面的尸体解剖，并仔细检查所有主要器官。将器官在流水下冲洗至106 μm的筛网上，收集冲洗液并在体视显微镜下检查内容物。统计所有蠕虫的数量，并选取代表性样本进行固定（可使用70%乙醇、10%缓冲福尔马林或乙醇-福尔马林-乙酸溶液）。对于物种鉴定，线虫和小型棘头虫可采用乳酚油透明处理，而吸虫、绦虫及大型棘头虫则需使用哈里斯苏木精染色法或塞米雄卡明染色法进行染色。通过观察不同形态结构（e.g. 线虫的雄性交合刺或绦虫的顶突）进行物种分类鉴定。此处所述方案适用于任何脊椎动物。操作者需具备识别不同器官的能力，并能将蠕虫与其它组织碎片或肠道内容物区分开来。采集、保存和染色均为简单易行的技术，所需仪器和试剂极少。分类学鉴定，尤其是种级鉴定，可能非常耗时，有时需要将标本送交专家或进行DNA分析。

引言

脊椎动物寄生有四大类蠕虫（helminths）。其中两类属于扁形动物门（Phylum Platyhelminthes），即吸虫纲（trematodes，或称flukes）和绦虫纲（cestodes，或称tapeworms）。另外两类为线虫动物门（Nematoda）的线虫（nematodes，或称roundworms）和棘头动物门（Acanthocephala）的棘头虫（acanthocephalans，或称thorny-headed worms）。许多此类寄生虫已被证实可导致野生鸟类和哺乳动物发病和死亡1,2。

大多数寄生蠕虫具有复杂的生活史，涉及一个以上的宿主1,2 。例如，吸虫类需要一个或两个中间宿主（通常为无脊椎动物）以及一个终末宿主。只有当所有宿主均存在时，生活史才能完成，从而使得成虫寄生在终末宿主中（这也是本文讨论的重点）。因此，必须认识到某些寄生蠕虫物种的感染率和感染强度可能存在季节性波动，进行长期监测有助于全面掌握特定宿主的寄生蠕虫区系组成。

收集寄生蠕虫的最佳方法是检查已被实施安乐死的宿主。这种方法可以在寄生虫仍存活时进行采集，并使其正确舒展和固定。宿主死亡超过24小时，或经过冷冻与解冻后用于检查的材料，通常质量较差且难以鉴定。来自冷冻或经福尔马林固定的宿主的吸虫和绦虫常常严重收缩，失去对鉴定至关重要的结构，例如吸虫的口棘或绦虫头节上的钩子。然而实际情况是，目前大多数可获得的脊椎动物宿主材料均为冷冻或保存状态。

包含寄生蠕虫DNA序列信息的数据库正在迅速增长，因此许多物种的分类学鉴定已成为可能。因此，应尽可能保存寄生蠕虫以用于潜在的DNA分析。然而，若标本经福尔马林固定，则无法获得高质量的DNA。本文所述的寄生蠕虫采集与处死方法可获得适用于DNA提取及遗传学分析的材料。

下文详细描述了如何对脊椎动物（包括两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类；不包括鱼类单殖吸虫）进行解剖以采集寄生蠕虫，并随后介绍如何保存和处理这些蠕虫以进行分类学鉴定。

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方案

以下实验所用动物均为路杀后发现的死亡个体。

1. 动物尸检及主要器官的寄生虫采集筛查

  1. 将动物置于平坦的表面上，使用放大镜检查所有外部开口，包括耳部、口腔和眼睛，观察是否存在线虫（圆形）和吸虫（扁平且无节片）（参见 图 1).
  2. 若操作对象为鸟类，解剖前需用自来水冲洗以浸湿羽毛。
  3. 使用锋利的刀片或手术刀，在解剖镊的辅助下，沿腹腔区域做切口，注意避免刺破任何器官。对于具有坚硬背甲的龟类，使用手持锯在胸盾与腹盾之间的桥区骨质部位进行切割。
  4. 打开胸腔的方法同上；对于大型动物，可能需要使用骨剪或小型手持锯来切断肋骨。
  5. 若操作鸟类，需检查气囊 原位 在移除任何器官之前，如有需要，可使用放大镜。
  6. 检查两个腔体中是否存在丝虫类线虫和大型吸虫。
  7. 在将胃肠道从腹腔中取出之前，于食管起始处附近结扎一根线，另在大肠末端（直肠）结扎一根线。
  8. 将以下胸腔器官分别放入培养皿（若器官过大则使用玻璃托盘）中，以便在体视显微镜（10–30×）下进行检查：心脏及主要血管、气管和肺。
  9. 取出肝脏、胆囊及胆管、胰腺、脾脏、肾脏和膀胱，并按照步骤1.8所述进行检查。
  10. 移除完整的消化系统，并将每一段放入玻璃皿/托盘中。
  11. 器官取出后，用装有0.9%生理盐水的软管或冲洗瓶冲洗体腔，并将冲洗液滤过106 μm网筛，在体视显微镜下检查网筛内容物中是否存在丝虫或血吸虫。
  12. 用剪刀打开每一段消化道，刮取黏膜并仔细检查是否存在大型寄生虫（>1 厘米）。必要时可使用放大镜。棘头虫的吻部常深陷于肠壁中，需用镊子和/或小剪刀小心地从组织中分离。
  13. 将每个打开的片段置于流水下冲洗，并将所有内容物冲洗至106 μm筛网中，具体操作如步骤1.11所述。
  14. 打开心脏和主要血管（肺动脉和主动脉）、气管、以及尿囊和胆囊，以相同方式检查其内容物。
  15. 使用锋利的刀片和镊子切开并分离肺、肝、肾、脾和胰等实体器官。按照步骤1.11所述，将组织在流动水下冲洗至106 μm筛网中。
  16. 记录所发现寄生虫的种类、每种的数量及其所在的器官。固定与染色方法如下所示。
  17. 用铅笔在空白索引卡的小片上书写标签，然后贴在小瓶或广口瓶上（墨水笔和带横线的索引卡会 "运行" 在酒精中并染色标本。

2. 寄生蠕虫的保存

  1. 对于需要保存以供后续遗传学研究的蠕虫，应直接将其放入80-90%乙醇（不含甘油）中。乙醇应通过稀释95%乙醇配制，建议使用试剂级乙醇（表1）。切勿让这些样本接触福尔马林，因为福尔马林会将DNA降解至无法使用的状态。
  2. 将活体吸虫置于载玻片上的生理盐水滴中，盖上盖玻片，然后将载玻片在火焰上轻轻通过，使盐水不沸腾即可。
    1. 将载玻片放入含有AFA（酒精-福尔马林-乙酸，见表1）的培养皿中，使盖玻片自然脱落。
    2. 在AFA中固定1天至数天，用自来水冲洗后，转移至5 ml玻璃小瓶（或根据寄生虫大小和数量选择更大的玻璃瓶/罐），并加入70%乙醇进行长期保存。
  3. 将死亡吸虫用AFA或10%缓冲福尔马林固定48小时，然后转移至装有70%乙醇的玻璃瓶/罐中进行长期保存。
  4. 将活体绦虫放入培养皿中，倒入接近沸腾的热水使其松弛，随后转移至装有70%乙醇的玻璃瓶/罐中进行长期保存。
  5. 将活体棘头虫置于培养皿中，在冰箱（约4 °C）中用自来水浸泡1至数小时，直至吻突完全外翻（可能需要长达24小时）。随后转移至装有70%乙醇或AFA的玻璃瓶/罐中进行长期保存。
  6. 将死亡绦虫和棘头虫的处理方式与死亡吸虫相同（见上文）。
  7. 将活体小型（<5 mm）或脆弱线虫（例如毛圆科、毛尾科）放入热的（接近沸腾）70%乙醇中杀死，并保存于添加了5%甘油的70%乙醇玻璃瓶/罐中（表1），以防蒸发导致虫体损坏。
  8. 杀死（并透明化）中至大型（>5 mm）线虫（例如蛔科、旋锐科、蛲科、丝虫科），将其置于含有冷冰醋酸的培养皿中（表1），15分钟后转移至装有70%乙醇和5%甘油的玻璃瓶/罐中。冰醋酸可重复使用。
  9. 将死亡线虫直接放入装有70%乙醇和5%甘油的玻璃瓶/罐中。

3. 寄生蠕虫的分类学鉴定

  1. 通过将苏木精溶解于酒精中，以及将硫酸铝铵加热溶解于水中，配制 Harris 苏木精染液。将两种溶液混合后煮沸。
    1. 加入碘酸钠，煮沸 2-3 分钟。待溶液冷却至室温后，用 541 滤纸过滤。
  2. 将吸虫、绦虫和棘头虫置于稀释（1:10）的哈里斯苏木精染液或塞米雄卡红染液中过夜染色过度（参见 表1).
    1. 使用70%酸性乙醇脱色，直至器官可见（所需时间从几秒到一小时以上不等，应密切观察）。
    2. 通过将样本转移至70%基础乙醇中至少30分钟以终止脱色。随后，将样本依次经80%、95%、100%梯度乙醇脱水，并在二甲苯或水杨酸甲酯中透明。
    3. 在载玻片上滴加一滴加拿大树胶，放入标本后加盖盖玻片，置于室温下过夜干燥。
  3. 在载玻片上用乳酸苯酚临时封片，将小型至中型线虫和棘头虫透明处理 15–30 分钟。
    1. 对于大型线虫（如蛔虫和旋尾线虫）以及棘头虫，使用80%苯酚处理最多60分钟。在光学显微镜下（40–400×）观察，以评估较小结构（如雄虫交合刺和钩）。
  4. 使用以下方法检查特殊结构。
    1. 对于绦虫，切下头节并置于含乳酸苯酚的载玻片上 "压片" 用盖玻片测量和计数头节钩（参见 图1B).
    2. 对于线虫，切断前端并制片 正面 在载玻片上滴加几滴乳酸苯酚（不加盖玻片）或甘油胶（用于永久封片，需加盖玻片），于光学显微镜下（35–400×）观察口器结构（参见 图1D).
    3. 剪去大型线虫的尾部，置于含乳酸酚的载玻片上，加盖盖玻片，在光学显微镜下观察雄虫的腹乳突及交合刺形态（参见 图1D).
  5. 使用原始文献和标准分类学参考文献相结合的方法鉴定寄生虫至物种水平，例如：
    1. 吸虫：山口（Yamaguti，1958，1971）3,4 和吉布森 等.5-7
    2. 棘头虫：山口（Yamaguti）8
    3. 绦虫：山口（Yamaguti）9，Schmidt10，以及 Khalil 等.11
    4. 线虫：山口12 和 Anderson 等.13

4. 美国国家寄生虫标本馆的蠕虫保藏

  1. 将代表性的蠕虫标本保存至美国国家寄生虫标本馆（USNPC）。大多数寄生虫学期刊对此有强制要求。提交后，每种蠕虫物种将被分配一个登录号，需在论文中注明。
  2. 提交标本时应包括以下信息：1）寄生虫的学名；2）宿主信息（物种名称、地理坐标的经度和纬度）；3）在宿主体内发现的器官；4）标本采集人姓名及采集日期；5）所用固定剂、染色剂或透明/封片介质的类型；6）若另有标本提交至其他收藏机构，需注明机构名称及登录号；7）相关出版物及期刊信息。上述资料应随标本一同寄送，并另附信函单独封装。
  3. 将标本置于坚固容器中，并使用防震吸水材料包裹。用胶带或Parafilm密封玻璃小瓶的螺旋盖，每个小瓶单独放入塑料袋中。将载玻片用纸包裹后放入带有减震材料的载玻片盒中，片间需有缓冲材料隔开。
  4. 将标本及附带信息的单独信函寄送至：U.S. National Parasite Collection, USDA, ARS, ANRI, Bldg. 1180, BARC-East, 10300 Baltimore Avenue, Beltsville, MD 20705-2350。

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结果

根据上述方法，于2007年至2011年间在美国蒙大拿州米苏拉县对 masked shrew（Sorex cinereus）的寄生蠕虫进行了调查。共采集56只鼩鼱，通过陷阱捕获后在死亡2小时内进行检查。总体感染率为96%；仅有2只鼩鼱未发现寄生虫。共鉴定出15种寄生蠕虫，包括9种绦虫和6种线虫。其中，绦虫属Staphylocystoides中有一个物种此前尚未被描述。受感染的器官包括小肠（9种绦虫、3种线虫）、胃（1种线虫）、肺（1种线虫）和膀胱（1种线虫）。每只感染宿主体内的总虫数（感染强度）为7–234条。每只感染宿主所携带的寄生蠕虫物种数（物种丰富度）为1–8种，平均为4.1种（图2）。

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讨论

即使仅鉴定到属，基于质量较差的标本也极难识别寄生蠕虫。绦虫和吸虫尤其在宿主死亡后会迅速死亡并退化。绦虫的分类在很大程度上依赖于头节钩的数量、大小和形状，而这些结构在冷冻标本中常常丢失。同样，某些在口吸盘周围具有棘刺的吸虫（如棘口吸虫和异形吸虫）的棘刺也经常脱落。由于具有较厚的角质层，线虫和棘头虫相对更耐保存，但仍可能出现收缩或吻部回缩的情况。因此，获取尽可能新鲜的标本的重要性再怎么强调也不为过。理想情况下，应捕获活体宿主，实施安乐死后立即进行检查。若无法做到，则应在宿主死亡后3至4小时内完成检查，或尽快将其冷冻。在采集宿主后立即取出肠道组织，并用液氮进行速冻，可获得极佳的标本材料。即使仅能对少数宿主进行新鲜检查，并正确鉴定其中的寄生蠕虫，也可能有助于对后续来自冷冻标本的物种进行分类。宿主死亡后，寄生蠕虫可能在体内发生移动，因此在尸体解剖过程中描述寄生虫位置时，必须考虑这一因素。

使用筛子筛选肠道内容物以及用水冲洗其他器官上的血液，是对早期尸检方法的重要改进。该方法显著提高了检出较小蠕虫的机会，并改善了定量分析效果。将绦虫和吸虫在热水中杀死后，所获得的标本比未经处理的更适用于染色&#...

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披露

我们无任何利益冲突需要披露

致谢

作者谨此感谢普渡大学印第安纳州美国农业部动植物卫生检验局野生动物服务项目疾病生物学家 Joe N. Caudell 博士，他提供了用于采集线虫以制作本视频的标本。Jennifer Serafin 配制了所有化学溶液。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
固定
乙醇-福尔马林-冰醋酸（AFA）费舍尔科技公司A407-1 (ethanol)
F75F-1GAL (formaldehyde)
BP2401500 (glacial acetic acid)		乙醇 85% (85 ml) + 甲醛 37% (10 ml) + 冰醋酸 (5 ml)
用于杀死和长期保存的乙醇费舍尔科技公司A407-1乙醇 100% (70 ml) + 蒸馏水 (30 ml)
用于固定和DNA研究的乙醇费舍尔科技公司AC61511-0010乙醇 80-90% (80-90 ml) + 蒸馏水 (20-10 ml)，分别对应
缓冲福尔马林费舍尔科技公司SF100-4福尔马林 10% (10 ml) + 蒸馏水 (90 ml)
甘油-乙醇混合液费舍尔科技公司A407-1 (ethanol)
AC15365-1000
(glycerine)		乙醇 70% (95 ml) + 甘油 (5 ml)
透明、染色与封片
染色过程中用于脱水的乙醇费舍尔科技公司A407-1乙醇 80%、95%、100% (80 ml、95 ml、100 ml) + 蒸馏水 (20 ml、5 ml、0 ml)
乳酸苯酚费舍尔科技公司R400-27-
苯酚费舍尔科技公司A931I-1 (phenol)
A407-1 (ethanol)		苯酚 100% (80 ml) + 乙醇 100% (20 ml)
Harris’ 苏木精费舍尔科技公司S25347 (hematoxylin)
A407-1 (ethanol)
A567-500 (ammonium aluminum sulfate) S25553 (sodium iodate)		苏木精 (5 g) + 乙醇 100% (50 ml) + 硫酸铝铵 (100 g) + 碘酸钠 (0.37 g) + 蒸馏水 (1,000 ml)  
Semichon’s 乙酸洋红费舍尔科技公司BP2401500 (glacial acetic acid)
S25236 (carmine)
A407-1 (ethanol)		冰醋酸 (100 ml) + 洋红 (1.5 g) + 蒸馏水 (100 ml)。在沸水浴中加热15分钟，冷却后过滤制成储备液。使用时与70%乙醇按1:2比例混合进行染色。
二甲苯费舍尔科技公司X4-4仅可在化学通风橱中使用。
水杨酸甲酯费舍尔科技公司S25437-
碱性乙醇费舍尔科技公司A407-1 (ethanol)
S25159A (concentrated ammonium hydroxide)		乙醇 70% (100 ml) + 氨水 (0.1 ml)
酸性乙醇费舍尔科技公司A407-1 (ethanol)
SA9233-100 (hydrochloric acid)		乙醇 70% (99.5 ml) +  盐酸 (0.5 ml)
加拿大树胶费舍尔科技公司B10-100-

参考文献

  1. Atkinson, C. T., Thomas, N. J. Parasitic Diseases of Wild Birds. Hunter, D. B. , John Wiley & Sons, Blackwell Press. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
  2. Parasitic Diseases of Wild Mammals. Samuel, W. M., Pybus, M. J., Kocan, A. A. , Second Edition, Iowa State University Press. Ames, Iowa, USA. (2001).
  3. Yamaguti, S. Parts 1 and 2. The Digenetic Trematodes of Vertebrates. Systema Helminthum. I, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1958).
  4. Yamaguti, S. Synopsis of Digenetic Trematodes of Vertebrates. I and II, Keigaku Publishing Company. Tokyo, Japan. (1971).
  5. Gibson, D. I., Jones, A., Bray, R. A. Keys to the Trematoda. 1, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2002).
  6. Jones, A., Bray, R. A., Gibson, D. I. Keys to the Trematoda. 2, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2005).
  7. Bray, R. A., Gibson, D. I., Jones, A. Keys to the Trematoda. 3, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2008).
  8. Yamaguti, S. Acanthocephala of Vertebrates. Systema Helminthum. V, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1963).
  9. Yamaguti, S. The Cestodes of Vertebrates. Systema Helminthum. II, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1959).
  10. D, G. Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates. CRC Handbook of Tapeworm Identification. , CRC Press Inc. Boca Raton, Florida, USA. (1986).
  11. Khalil, L. F., Jones, A., Bray, R. A. Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates. , CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (1994).
  12. Yamaguti, S. The Nematodes of Vertebrates. Parts 1 and 2. Systema Helminthum. III, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1961).
  13. Anderson, R. C., Chabaud, A. G., Willmott, S. Keys to the Nematode Parasites of Vertebrates: Archival Volume (Nos). 1-10. , CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2009).

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