反应物分子量调控聚乙二醇沉淀微凝胶的特性

摘要

本研究描述了通过光聚合沉淀反应制备聚乙二醇（PEG）微凝胶的方法。增加PEG的分子量可提高微凝胶的直径和溶胀比。本文探讨了对PEG微凝胶沉淀反应的简单改进，以拓展其在未来作为药物递送载体和组织工程支架中的应用。

摘要

本研究描述了通过光聚合沉淀反应制备聚乙二醇（PEG）微凝胶的方法。与传统的微球制备技术相比，沉淀反应具有多项优势。与乳液法、悬浮法和分散法不同，通过沉淀反应形成的微凝胶具有均一的形态和尺寸， 即 低多分散性指数，且无需使用有机溶剂或稳定剂。该沉淀反应条件温和，微凝胶性质可调，并具有低黏度以适用于注射，因此可应用于 体内 目的。与其他制造技术不同，可通过改变起始聚合物的分子量来调节微凝胶的特性。提高起始聚乙二醇（PEG）的分子量可增加微凝胶的直径和溶胀比。建议进一步改进，例如在微凝胶交联过程中包封分子。本文探讨了对PEG微凝胶构建单元进行简单改造的可能性，以推动微凝胶在未来作为药物递送载体和组织工程支架的应用。

引言

根据定义，微凝胶是任何形状的水凝胶，其等效直径约为 0.1–100 μm¹。由于其尺寸和特性，聚合物微凝胶成为推动药物递送和组织工程系统发展的一种多功能工具。尽管块状水凝胶已被广泛成功地用作组织工程支架和药物递送载体^2–4，但近年来向微尺度支架控制的转变，为将微凝胶用作构建支架的基础材料提供了独特机遇。此外，微凝胶具有较高的表面积与体积比，有利于细胞相互作用，且在溶液中黏度较低，非常适合注射使用。最后，微凝胶可通过多种方法利用多种聚合物制备，具体方法取决于所需的微凝胶特性，因此可高度定制化，适用于多种应用场景。

制备微凝胶的技术包括悬浮聚合、乳液聚合、分散聚合或沉淀聚合。乳液聚合和悬浮聚合通常需要使用有机溶剂以及表面活性剂或稳定剂来形成微凝胶。这些方法所得到的微凝胶粒子尺寸分布高度分散⁵。分散聚合和沉淀反应可生成多分散性较低的粒子⁶；然而，通过分散聚合形成的粒子仍需使用稳定剂⁶。沉淀反应形成的微凝胶具有独特性，因其可在无需稳定剂或表面活性剂的情况下形成尺寸和形状均一的粒子。当生长中的聚合物链通过焓驱动或熵驱动的沉淀作用从连续相中发生相分离时，即可实现微凝胶的形成⁷。沉淀聚合通常在高温下进行，但可通过使用 kosmotropic 盐类降低反应温度，这类盐可降低聚合物在溶剂中的溶解度⁸。本研究聚焦于在生物相容性条件下，通过光引发沉淀聚合反应制备聚乙二醇（PEG）微凝胶，并通过参数调控改变微凝胶特性，以实现分子包封，用于药物递送应用。

先前关于聚乙二醇（PEG）水凝胶的研究表明，聚合条件会显著影响水凝胶的物理和力学性能，即水凝胶的含水量和压缩模量^3,9。这类交联材料备受关注，是因为可利用Flory所描述的结构与物理性能之间的关系¹⁰，针对特定应用定制交联水凝胶。这些原理同样适用于微凝胶。已有研究发现，通过沉淀法形成的PEG微凝胶在再生医学领域具有应用潜力¹¹，但尚需进一步研究微凝胶的性能，以拓展其在未来生物医学应用中的用途。本报告描述了通过沉淀反应制备微凝胶的方法，并调控微粒直径、多分散性指数（PDI）、密度和溶胀性等特性，这些特性对于进一步开发用于药物递送或再生医学的材料至关重要。

方案

1. 微凝胶制备用溶液的配制

1. 开始沉淀反应前，配制所需的溶液并将其预热至 37 °C。所需溶液包括 0.5% 光引发剂、1.5 M Na₂SO₄、缓冲溶液、200 mg/ml 聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA）溶液和 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。注意：根据已发表的方法对所有 PEG 前体进行丙烯酸化处理，并在氩气保护下储存于 -20 °C 直至使用¹²。
2. 称取光引发剂，溶于去离子（DI）H₂O 中，配制成 0.5 (w/v)% 的溶液。必须避免该溶液暴露于紫外光下。
   1. 待完全溶解后，经 0.22 μm 滤膜过滤。该溶液可预先配制，并避光保存于 4 °C。注意：搅拌过程中将溶液加热至 40 °C 可将搅拌时间缩短至约 1 小时。
3. 配制 1× PBS 时，将 1 片 PBS 片剂加入 1 L 去离子 H₂O 中，再经 0.22 μm 滤膜过滤。PBS 可预先配制，并储存于 4 °C。
4. 量取 39.4 ml 磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4），加入 612 μl 三乙醇胺（TEOA）和 260 μl 6 M 盐酸（HCl）。注意：TEOA 黏度较高；移液前应先将其预热至 37 °C。
   1. 调节缓冲液 pH 至约 7.7，并经 0.22 μm 滤膜过滤（最终 pH 约为 7.8）。该缓冲溶液可按比例放大配制，预先制备后储存于 37 °C。
5. 每次开始反应前均需新鲜配制 PEG-DA 溶液；若储存该溶液，其反应活性会下降。称取 PEG-DA，加入 PBS/TEOA/HCl 缓冲液至终浓度为 200 mg/ml。注意：由于 PEG 在溶液中会溶胀，应缓慢加入缓冲液以精确控制 PEG 浓度。
   注意：该溶液具有高度可定制性。微凝胶的定制选项包括：改变 PEG 的起始分子量以调节微凝胶性能，使用可降解的 PEG 前体制备可降解微凝胶，对所有溶液进行无菌过滤以获得生物学无菌的微凝胶，在层流罩内完成微凝胶的制备过程，以及通过在 PEG 溶液中引入功能基团来实现微凝胶表面的功能化。
6. 称取 Na₂SO₄，溶于去离子 H₂O 中配制成 1.5 M 溶液。为获得最佳效果，硫酸钠溶液也应在反应开始前现配现用。
   1. 加热并涡旋振荡溶液，直至 Na₂SO₄ 完全溶解。必要时经 0.22 μm 滤膜过滤。

2. 微凝胶的制备

1. 加入 127.5 μl PBS/TEOA/HCl 缓冲液，10 μl 0.5% 光引发剂和 25 μl 200 mg/ml 将 PEG 溶液加入将要形成微凝胶的试管中；通常为 2 ml 微量离心管
   1. 将这些试管与 1.5 M Na 一同加热₂SO₄ 溶液升温至 37 °C。
   2. 加热时混匀各管。注意：本微凝胶实验方案 可进行放大。
2. 要将分子包封到微凝胶中，加入目标分子（例如 将卵清蛋白（ovalbumin）加入 PBS/TEOA/HCl 缓冲液、光引发剂和 PEG 溶液中。交联后，该分子将被固定在微凝胶网络内。
3. 一次完成一个微凝胶反应。取第一个试管，加入87.5 μl 1.5 M Na₂SO₄.
4. 用移液器吹打混匀3–5次；也可选择静置30秒。混匀后，盐浓度将均匀分布，溶液应呈澄清状态。
5. 将试管置于紫外光下交联30秒。交联后，溶液表面应出现一层浑浊层，此层含有微凝胶。参见 图1 用于反应方案。
6. 加入 750 μl PBS中离心形成沉淀并充分混匀。
7. 以 4,000 × g 离心 2 分钟，洗涤微凝胶 5 次 g以形成沉淀，并用PBS更换上清液。注意：更换缓冲液时不要扰动微凝胶沉淀，可能无法完全去除所有上清液。

3. 微凝胶尺寸与多分散性

1. 从离心后在1 ml 去离子H₂O中形成的沉淀中，用移液器吸取30 μl 微凝胶。为获得最佳效果，将微凝胶溶液置于水浴超声仪中处理1小时（50–60 Hz，1.4 A），或剧烈混合以充分悬浮微凝胶。
2. 用移液器吸取15 μl 微凝胶溶液滴加至洁净的载玻片上，盖上一张#1.5盖玻片。将载玻片和盖玻片翻转，置于实验用纸巾上，轻压载玻片以去除多余液体，并确保微凝胶呈单层分布。
3. 使用微分干涉差（DIC）100倍油镜采集多个微凝胶图像。通常每份样品采集5张图像，每批次建议检测3份样品，共15张图像。注意：截至目前未观察到批次间差异。
4. 测量微凝胶尺寸，获得具有代表性的直径数据。
5. 使用以下基于体积的公式计算多分散系数（PDI），其中N为微凝胶总数，V_i为第i个微凝胶的体积。

4. 微凝胶密度

1. 配制 7、6、5、4、3 和 1 (w/v)% 的葡聚糖水溶液（溶剂为去离子水 H₂O），用于测定微凝胶密度。这些溶液的密度分别计算为 1.022、1.020、1.018、1.016、1.014 和 1.010 g/cm³。
2. 向一支 15 ml 离心管中加入 1 ml 7% 葡聚糖溶液。
   1. 缓慢用移液器加入 1 ml 6% 葡聚糖溶液，使其在 7% 葡聚糖溶液上方形成清晰的分层。
   2. 静置 5 分钟后，加入 1 ml 5% 溶液。
   3. 依此类推，直至所有葡聚糖溶液按浓度从高到低顺序完成分层。
3. 小心地将微凝胶加在 1% 葡聚糖溶液上方。
4. 将密度梯度在 4,000 x g、5 °C 条件下离心 10 分钟。离心后微凝胶的位置可用于简便计算其密度¹³。

5. 微凝胶平衡溶胀

1. 为测量微凝胶的溶胀质量（M_s，定义为平衡溶胀后48小时的质量），首先将微凝胶用去离子水（DI H₂O）洗涤5次，并在已预先称重的微量离心管中溶胀至少48小时。
2. 在4,000 × g条件下离心微凝胶10分钟。
3. 完全移除上清液并记录湿重。采用过滤方法确保去除所有过量水分，以获得更准确的结果。
4. 将微凝胶在-80 °C下冷冻，随后冻干至恒重，以获得干重（M_d）。
5. 通过公式 Water% = (M_s - M_d) / M_d × 100 计算微凝胶中的水含量。
6. 通过公式 Polymer% = 100 - Water%  计算聚合物含量。
7. 使用SAS软件对所有数据进行统计分析，采用n因素方差分析（n-way ANOVA）及Tukey事后检验。当p<0.05时认为差异具有统计学意义。

结果

微凝胶的尺寸取决于聚合条件。图2A展示了微凝胶直径随聚乙二醇（PEG）起始分子量和交联时间的增加而增大的趋势。用于测定不同分子量及交联30秒后微凝胶尺寸的代表性图像如图2C-G所示。对于分子量为3,000 Da的PEG，当紫外光照射时间从30秒增加至600秒时，微凝胶的平均直径从1.65±0.26增长至2.20±0.54 μm（图2B）。在保持紫外光照射时间恒定为30秒的条件下，随着PEG分子量从3,000 Da增至10,000 Da，微凝胶直径从1.65±0.26 μm增至2.17±0.33 μm（图2A）。在分子量为3,000、4,000和4,600 Da的条件下，未观察到显著差异。与沉淀形成的微凝胶之间具有统计学显著差异的详细结果见表1和表2。较长的聚合时间可促进更多的交联反应，使多条聚合物链之间发生交联并沉淀。延长紫外光照射时间可使部分具有更长聚合物链长度的链参与微凝胶形成，从而导致尺寸分布更加不均一，表现为微凝胶直径分布范围扩...

讨论

考察了聚合条件变化对PEG微凝胶物理性质的影响。对于该沉淀反应，将缓冲溶液、20%（w/v） PEG-二丙烯酸酯溶液（分子量分别为3,000、4,600或6,000 Da）以及光引发剂混合后加热至37 °C。加入1.5 M的Na₂SO₄（一种增强水分子间相互作用的促凝盐），会导致PEG在加入时瞬间沉淀。该效应在高分子量PEG中更为显著⁸，表明实际的微凝胶形成过程是链增长与沉淀共同作用的结果。微凝胶通过紫外光（UV）引发的光聚合反应获得。UV照射时间分别为30、90、120、300和 600秒。当聚合物达到临界分子量时即发生沉淀，形成缠结且交联的微凝胶。通过在UV照射前将蛋白质分子加入溶液中，可实现其在微凝胶中的包封。随着聚合物链形成交联结构，蛋白质即被截留在聚合物网络中^2,4。

采用光学显微镜结合Axiovision软件对微凝胶的粒径和多分散指数（PDI）进行测量。使用基于体积的公式计算PDI，其中PDI为1时表示单一分散。随着聚乙二醇（PEG）分子量的增加，由PEG 3,0...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS）	MP Biomedical	2810305
三乙醇胺（TEOA）	J.T. Baker	9468-01	移液前预热至 37 °C
盐酸（HCl）	BDH Aristar	BDH3028
硫酸钠	J.T. Baker	3891-01
Irgacure 2959	Ciba	029891301PS04
卵白蛋白（OVA）	Invitrogen	34782
PEG 1,500	Alfa Aesar	A16241
PEG 3,000	Fluka	03997-1KG
PEG 4,000	Alfa Aesar	A16151
PEG 4,600	Sigma	373001-250G
PEG 6,000	Fluka	03394-1KG
PEG 10,000	Alfa Aesar	B21955
葡聚糖 70	TCI	D1449