皮层小胶质细胞的分离与保存免疫表型和功能从新生儿鼠

摘要

一键小胶质细胞生物学的研究成功是小胶质细胞免疫功能的体外从中枢神经系统组织分离过程中的保存。通过旋转振动造成的高纯度和immunofunctional细胞培养物中分离的小胶质细胞所评估的荧光成像，免疫细胞化学，ELISA和以下的小胶质细胞活化的促炎性刺激脂多糖（LPS）和Pam ₃ CSK _{4（PAM）。}

摘要

从中枢神经系统组织的小胶质细胞的隔离是用于研究小胶质细胞生物学体外强大的调查工具。本发明方法详述的程序用于通过机械搅拌，用旋转摇动器隔离的小胶质细胞的新生鼠皮层。这个小胶质细胞的分离方法产率，表现出在体内正常的，非病理性状况指示静态小胶质细胞的形态和功能特征的高纯度皮质小神经胶质细胞。此过程还保留了小胶质细胞的免疫表型和生化功能就证明了形态变化，NF-κB（p65蛋白）的P65亚基的核转运，和标志促炎性细胞因子的分泌，肿瘤坏死因子-α（TNF-α的诱导），经脂多糖（LPS）和Pam ₃ CSK _4（PAM）的挑战。因此，本分离方法保留了两个静态和激活的免疫vated小胶质细胞，提供调查在体外条件下小胶质细胞生物学的实验方法。

引言

小胶质细胞，CNS实质的监视巨噬细胞，包括成年哺乳动物大脑的总细胞群的约12％。小胶质细胞来源于卵黄囊骨髓前体细胞，改变细胞密度和形态在不同的细胞结构区域的成人中枢神经系统^1-5范围内。在一个健康的成年人的大脑，小胶质细胞小，分枝或极性细胞，精，动态过程。相较于周边的巨噬细胞的形态，小胶质展示，可能会出现蜂窝闲置健康的大脑静止，低调的表型，但在体内成像研究表明，小胶质细胞的过程中动态地伸出和缩回，以监测他们的微环境的方式让人想起"采样和测量^"6,7。

小胶质细胞是高度和差分响应于环境和病理生理改变在大脑中，切换从监视者与效应国家通常被视为他们的休息和激活状态，分别为。这在激活开关可以通过膜结合的模式识别受体（的PRRs），如Toll-样受体（TLRs），其中病原体相关分子模式响应（的PAMP），包括细菌和病毒衍生的脂蛋白的啮合来介导，核酸，碳水化合物和^8-11。除的PAMP，模式识别受体也已显示出诱导小胶质细胞活化对被称为危险/损伤相关分子模式（D-AMPS），无菌的，非致病性的分子，其代表在中枢神经系统内环境稳定的扰动，如细 ​​胞损伤^12-16。一旦接合，模式识别受体引发的细胞内信号级联放大，结果在变化中的小胶质细胞形态和基因表达，具体而言，活化的小胶质细胞适应的变形虫状的表型，转运的p65的NF-κB亚基（p65蛋白）的细胞的细胞核，并且上调了机生产线CTION和促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白介素-1β（IL-1β），随着活性氧（ROS）的^16-24的分泌。虽然积分在CNS中的先天免疫应答，这些分泌的分子也已发现增加神经细胞的氧化应激，从而诱发并加重神经变性疾病状态，如帕金森氏症和阿尔茨海默氏病^25-29。

然而，在病理状态的小胶质细胞活化的机制尚未完全了解。因此，小胶质细胞的分离是一个强大的调查工具为这些生物过程，因为许多在小胶质细胞激活体内功能可以在培养中概括。有几种方法可用于通过Percoll梯度以下CNS组织^30,31的酶消化分离的小胶质细胞，包括隔离。然而，酶消化可以改变细胞通过减少细胞表面抗原的表达^32，结果在每个动物的低细胞产量比本文所描述的方法中的免疫表型。具体来说，我们报告每小狗皮质的平均收益率小胶质细胞7.5×10 ⁵细胞，而以前报道的整个中枢神经系统隔离的方法通过Percoll梯度产量3-5×10 ⁵细胞^30,33,34。本程序规避通过隔离基于其低粘附性小胶质细胞，从而保留了小胶质细胞免疫表型和功能的使用消化酶。

在本研究中，我们描述了从新生儿杂CX3CR1-GFP（CX3CR1-GFP ^{+ / - ）}衍生的混合胶质细胞培养的小胶质细胞的分离通过在旋转摇床上，先前的延长机械搅拌和C57BL / 6小鼠皮层出版法^24,35。我们利用前小鼠品系的小胶质细胞易于可视化，这些小鼠表达内源性CX3CR1轨迹的控制下的GFP -单核细胞特异性启动子^36-38。这种方法可以产生高纯度的小胶质细胞培养物具有保藏免疫体外 ，当与细菌脂多糖（LPS）或帕姆₃ CSK ₄挑战就证明了形态变化，p65蛋白的核转位，和TNF-α的分泌，TLR4和TLR1 / 2激动剂元。

方案

再开始此协议，在出生后几天收集新生小鼠1-3（P1-3）在无菌容器中嵌套原笼床上用品的保护和温暖。它可以快速，高效地工作，通过该协议来优化小胶质收益率是很重要的。请参阅表1为完整的试剂列表。

1。仪器仪表，文化传媒，以及菜肴的制备

1. 制备出10毫升/小狗小胶质细胞完全培养基（MCM，1个最低必需培养基Earle的[存储]补充有:1 2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，0.6％体积/体积的D-（+） - 葡萄糖，100微克/毫升青霉素/链霉素（P / S），4％V / V胎牛血清（FBS），6％v / v马血清），并添加到每个T-75瓶（1瓶/小狗）;帽和地方水平成培养箱（37℃，5％CO _2）中平衡1小时。 重要的是在开始剥离之前达到平衡这一媒体在烧瓶（次）。
2. 准备相再次，分装，并在温暖的37℃水浴MCM解剖（6毫升/小狗），并在一个单独的锥形管的MCM细胞悬浮（2毫升/小狗）。制备，分装，并冰上冷却介质切碎（MM; HBSS中补充有100微克/毫升的P / S，0.01M HEPES，3毫升/小狗）和夹层媒体（DM; MEM补充了100微克/毫升的P / S;为2ml /小狗）。
3. 消毒以下手术工具浸没于70％乙醇10分钟:剪刀＃1（1;杀头），钳子＃1（2，确保鼻子和去除皮质），剪刀＃2（1; nonangled，打开头皮），钳子＃2（1，去除头皮），钳子＃3（1，去除颅骨），钳子＃4（2，去除脑膜），剪刀＃3（1，剁碎的脑组织）。风干的无菌垫。
4. 擦拭用70％乙醇的水平气流工作站和解剖显微镜。
5. 免除糖尿病分为2无菌100毫米培养皿捕捉头（3毫升; 1碟/ 3的幼崽）和解剖（1毫升;1碟/小狗;前清扫冰上冷却）。分装成的MM无菌1 100毫米的培养皿用于切碎脑组织（1毫升; 1碟/小狗）。

2。脑组织解剖

1. 在此之前安乐死，使用实验室组织轻轻消毒颈部和小狗的头部用70％乙醇。用剪刀＃1，很快就被除去头安乐死的小狗;捕获的头在先前准备的培养皿中。安乐死，并继续下一个动物之前完成一个小狗的解剖。
2. 头部转移到冷冻解剖盘，解剖显微镜下固定头使用镊子＃1（或者，头部可以通过眼窝刺入血管钳固定）捏鼻子，用剪刀＃2开头皮通过创建一个Y切:从头部的基地，并在朝着眼睛的角度开始。使用镊子＃3由横向剥落轻轻地取下头皮，暴露颅骨。
3. 使用镊子＃3，轻轻在底座上卸下结缔组织头。当颅底暴露出来，小心地打开颅骨通过螺纹钳子的大脑和颅骨（下半球间裂）之间的一个臂，抓地力;轻轻一拉头骨向上撕裂开来。
4. 根据打乱大脑的腹侧结缔组织使用镊子＃1，随后使用相同的工具取出大脑。通过使用大脑的腹侧下一个向上的力提起了脑颅骨。
5. 保持大脑在其解剖位置:背侧朝上，以可视化的解剖显微镜下的皮质，在中脑和皮质的交点插入镊子尖端固定大脑到位;彻底去除皮质脑膜与镊子＃4，然后进行删除腹侧脊膜。一旦脑膜已经完全去除，从用钳子＃4的脑的其余部分分离的皮层， 它是必不可少的，以完全除去脑膜组织最大化的小胶质细胞的纯度和yielð。

3。脑组织切碎

1. 皮质转移到事先准备好的切碎的菜;继续使用无菌技术在II类生物安全柜切碎的一步。
2. 用剪刀＃3切末脑组织;转移组织糜到15毫升锥形管;冲洗剪刀和切碎的菜用1毫升的MM各，收集和分配冲洗进15毫升锥形管中组织糜此冲洗步骤将最大化小胶质细胞通过确保所有残留的组织转移至锥形管中的产率 。离开组织悬液静置1-2分钟，使组织糜，收于试管底部。 不要超过2分钟的MM不含有人体必需的营养素。
3. 小心地取出并丢弃2毫升上清液与通用1,000微升移液器与标准的枪头，使某些不破坏落户剁碎组织。
4. 加3毫升的MCM的碎组织，使用通用的1,000微升移液器使用标准的枪头全部力量磨碎的组织没有可辨别的实体组织应保持研磨时完成 。添加另一个3毫升MCM具有相同枪头，从移液管尖收集残留研磨样品。

4。不断增长的皮层细胞

1. 离心机组织糜以沉淀细胞（215×g离心，5分钟;放疗;临床用离心机水平转头）。返回沉淀的细胞的生物安全柜，取出，弃去上清液，轻轻重悬细胞沉淀（2毫升/管; MCM）;细胞悬浮添加到先前准备的T-75瓶中，盖上瓶和水平放置到湿润的标准组织培养箱（37℃，5％CO _2）。使细胞温育24小时。
2. 24小时后，轻轻拍打瓶对手掌破坏组织碎片。之前和攻丝以确保完全去除杂物后，检查细胞。集烧瓶垂直;取出并丢弃媒体;添加新鲜的MCM到烧瓶的底部（12毫升; 37℃）;帽和放置放回培养箱中，水平。
3. 每天检查细胞的污染和监测的增长。
4. 在体外 （DIV）约17-21天，小胶质细胞会准备好收成从混合胶质文化。如果要判断细胞准备，检查倒置相差显微镜下观察细胞。 小胶质细胞是准备收获时在〜40％汇合。它们显示为小，明亮，球形细胞，成长为对其他神经胶质细胞顶部的单层。

5。从混合胶质细胞培养分离的小胶质细胞

1. 隔离的小胶质细胞，大力挖掘对烧瓶实验台。这有助于鼓动来自其他神经胶质细胞，由于小胶质细胞的低粘附性分开的小胶质细胞。
2. 印章的T-75瓶瓶盖封口膜和旋转的混合胶质细胞培养（200转，37℃，5小时），使用温度控制，nonhumidified旋转摇床不要让细胞振摇5小时更长的目视检查。那小胶质细胞已经抬离烧瓶表面5小时后，用倒置相差显微镜， 小胶质细胞是光明的，球形的，自由浮动的细胞。会有星形胶质细胞和少突胶质细胞附着在烧瓶底部的残留层。
3. 收集含有胶质进入无菌的离心管中的上清液媒体，颗粒小胶质细胞（215×g离心，5分钟;水平转头）。
4. 悬浮在温水中的小神经胶质生长培养基（MGM的小胶质沉淀; MEM补充有:1mM丙酮酸钠，0.6％的v / vglucose，1mM的L-谷氨酰胺，100μg/ ml的P / S，5％体积/体积的FBS;〜2毫升/瓶），确定使用血球细胞浓度，并且板1×10 ⁵个细胞/孔在24孔板格式上塑料或无菌玻璃盖玻片（500微升/孔; MGM）， 使用此程序的小胶质细胞平均产量为7.5×10 ⁵细胞/小狗皮质。
5. 24小时后镀，取出所有介质，并更换培养基细胞用新鲜的美高梅金殿（37℃）以去除漂浮细胞和碎片。 这一步是至关重要的细胞存活和保持静态的小胶质细胞。细胞投喂后立即可用于实验。

6。例如治疗

1. 暴露的细胞在10纳克帕姆₃ CSK _4（PAM）的/毫升，10纳克/毫升的脂多糖（LPS）或溶媒对照;孵育2或24小时后在加湿培养箱（37℃，5％CO _2）。

7。对于功能性体外通过免疫荧光成像和免疫细胞小胶质细胞分析

1. 在微量离心管（1.5ml）和离心泵处理，收获细胞培养介质后ifuge使用桌面离心（2分钟; 900 XG），以清除介质。将上清转移到一个干净的离心管中，立即检测，或在-20℃储存待用。通过市售鼠TNF-αELISA试剂盒细胞培养上清分析TNF-α的浓度。
2. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，并固定细胞，用4％（重量/体积）低聚甲醛/ 4％（重量/体积）蔗糖/ PBS pH为7.4（4％PFA; 15分钟; RT）。下列固定，用PBS洗涤细胞5分钟轻微振荡轨道摇床。
   1. 免疫/免疫细胞，经过固定，PBS洗涤，工艺小胶质细胞的免疫细胞化学。 开展轻轻摇动所有的步骤 。透化在PBS/0.1％Triton X-100细胞;块单元中一小时PBS/10％正常山羊血清。孵育细胞O / N在4℃下用兔抗NF-κB抗体（P65亚基，1/1，250）或兔抗伊巴-1抗体（1/750）在封闭缓冲液。视觉的IZE抗原:抗体复合物温育后用荧光标记的羊抗兔IgG二抗（1小时，1/1，000）。用PBS/0.1％Triton X-100（3×5分钟）洗涤除去未结合的第二抗体。
   2. 计数器染色的细胞用4'，6 -二脒基-2 -苯基吲哚/ PBS（DAPI; 0.1微克/毫升）。以可视化的细胞核从CX3CR1-GFP ^{+ /}导出所有的小胶质细胞^-小鼠^中表达GFP。利用350nm的波长滤光器，以可视化的DAPI; 488nm的波长滤光器，使GFP可视化;和594 nm的波长滤光器，以可视化p65和IBA-1免疫复合物。
3. 摩盖玻片使用水性安装的解决方案，并使用荧光显微镜可视化小胶质细胞。

结果

保留了小胶质细胞的体外分离过程中的免疫表型和功能是至关重要的，以便能够利用这些细胞作为调查模型胶质生物学。为了说明小胶质immunofunctionality的使用本发明方法的成功保存，我们分离皮质小神经胶质细胞从新生儿P3（CX3CR1-GFP ^{+ / -}小鼠和C57BL / 6）和处理的培养物与任何LPS或帕姆。

如图1A所示 ，通过搅动小胶质细胞的分离通过旋转振动保留了静态表型归因于在正常体内条件下的小胶质细胞。评估胶质纯度，CX3CR1-GFP ^{+ / -}细胞培养物进行染色的巨噬细胞的抗原伊巴-1和计数器以可视化的细胞核用DAPI染色。如通过预先选择的窗口显示在图1A和图1B，根据低倍率，小胶质隔离在高纯度的细胞培养ntly所述方法的结果，如大于95％的细胞显示出GFP，伊巴-1，和DAPI的共定位。

接下来，我们试图通过与LPS挑战的细...

讨论

本程序提供了一种有效的方法皮层小胶质细胞从新生小鼠的隔离。这个过程有:1）保持小胶质细胞免疫表型和功能性两方面的益处，如通过荧光成像，免疫细胞化学和ELISA测定，以及，2）使小胶质细胞在其他神经胶质细胞（星形胶质细胞和oligodentrocytes）的存在之前，成熟隔离，这可能会在培养的神经胶质成熟期间促进重要细胞 - 细胞相互作用。重要的是，分离的细胞具有较高的生存能力和均匀性与保存功能和免疫体外 。

有迹象表明，必须特别注意​​和勤勉尽责地为小胶质细胞具有最高的纯度和收率的成功分离执行几个步骤。这些步骤是:1）在整​​个实验过程保持无菌，健康的文化; 2）从肺心病删除所有脑膜蒂斯斯显微切割过程中，皮质切碎后切碎板和剪刀3）适当的清洗; 4）平衡MCM中的T-75瓶培养箱中显微切割开始前; 5）再投喂24小时后隔离。

由于小胶质细胞是中枢神经系统的驻留免疫细胞，它们是高度敏感环境的侮辱。因此，避免文化污染病原体是保持静止的小胶质细胞的免疫表型和功能属性的关键。日常检查细胞监测污染和增长是不可或缺的避免破...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
葡萄糖	Sigma	G8270	用MilliQ水制备20%的储备溶液;过滤消毒;储存在4°C;C;保质期：3-6个月。用于制造 MCM 和 MGM。
丙酮酸钠 100 mM （100x）	Hyclone	SH30239.01	在 4 &°C 下储存。用于制备 MCM 和 MGM。
青霉素/链霉素 10,000 单位/ml （100x）	Gibco	15140-122	储存温度为 -20 °C。用于制备 MCM、MGM、MM 和 DM。
L-谷氨酰胺 200 mM （100x）	Gibco	25030-081	储存温度为 -20 °C。用于制备 MCM 和 MGM。
牛血清（定义）	Hyclone	SH30070.03	过滤灭菌;储存在 -20 &°C。用于制造 MCM 和 MGM。
的最低必需培养基 Earle's （MEM）	Cellgro	15-010-CV	。含有 Earle's 盐。用于制作 MCM、MGM 和 DM。
马血清	Gibco	16050	过滤器灭菌;储存在 -20 °C 下。用于制造 MCM 和 MGM。
汉克斯平衡盐溶液 （HBSS）	Cellgro	21-021-CV	不含钙和镁。储存在 4 °C。用于制造 MM。
HEPES 1 M	Gibco	15630-031	储存温度为 4 °C。用于制造 MM。
T-75 培养瓶	康宁	430641
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二乳酸酯 （DAPI）	Invitrogen	D3571	用于细胞核染色。
兔抗 Iba1	Wako	019-19741	用于 Iba1 的 ICC 染色。
兔抗 NFκB （p65）	Abcam	7970	用于 p65 的 ICC 染色，稀释度为 1/1,250。
Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG （H+L）	Invitrogen	A11012	以 1/1,000 稀释度用于 ICC 中抗原：抗体复合物的可视化。
10 ml 一次性血清移液管	Fisher Scientific	13-678-11E
50 ml 一次性离心管	Fisher Scientific	05-539-8
15 ml 一次性离心管	Fisher Scientific	05-539-12
无菌聚苯乙烯培养皿	Fisher Scientific	875713	100 mm x 15 mm
剪刀：直 Metzembaum（剪刀 #1）	Roboz Surgical	RS-6010	1; 5英寸;用于移除头部
剪刀：Vannas （剪刀#2）	精细科学工具	15000-08	1;无角度;2.5毫米切割边缘;用于打开头皮
剪刀：学生Vannas（剪刀#3）	精细科学工具	91501-09	1;弯曲;用于切碎脑组织
镊子：杜蒙特#7 （镊子#1）	精细科学工具	91197-00	2;用于固定鼻子和去除皮质
镊子：Dumont #2 （镊子 #2）	精细科学工具	11223-20	1;用于去除头皮
镊子：Dumont #3 （镊子 #3）	精细科学工具	11231-30	1;用于去除颅骨
镊子：Dumont #5a< br/>（镊子 #4）	精细科学工具	11253-21	1;用于去除脑膜
特定设备表
变焦体视解剖显微镜	奥林巴斯	SZ4060	显微镜放置在层流-水平流动柜内
层流-水平流动柜	Nuaire	NU-201-330
生物安全柜	Labconco	3440001	II 类
水套 CO2 培养箱	VWR	97025-836	设置为 37 °C， 5% CO2
水平吊篮	Fisher Scientific	75006441	与水平转子一起使用
	水平转子 Fisher Scientific	75006445	最大半径：19.2 （cm）
Sorvall Legend RT+ 离心机 （临床离心机）	Fisher Scientific	75-004-377	带水平转子
AccuSpin Micro 17 微量离心机 （台式微量离心机）	Fisher Scientific	S98645	带微升转子（24 x 1.5/2.0 ml;猫 #： 75003524）