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方法文章

从新生小鼠中分离保留免疫表型和功能的皮层小胶质细胞

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⸱

DOI：

10.3791/51005

⸱

2014年1月30日

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Georgetown University Medical Center

本文内容

摘要

成功研究小胶质细胞生物学的一个关键在于，从小胶质细胞从中枢神经系统组织中分离的过程中，保持其免疫功能的 ex vivo 状态。通过旋转振荡法分离小胶质细胞，可获得高纯度且具有免疫功能的细胞培养物，这一点在使用促炎刺激物脂多糖（LPS）和 Pam3CSK4（Pam）激活小胶质细胞后，通过荧光成像、免疫细胞化学和 ELISA 检测得以验证。

摘要

从中枢神经系统组织中分离小胶质细胞是一种用于研究小胶质细胞生物学的有力研究工具 离体本方法详细描述了一种通过旋转摇床进行机械振荡，从新生小鼠大脑皮层中分离小胶质细胞的实验流程。该小胶质细胞分离方法可获得高纯度的皮层小胶质细胞，其形态学和功能特征表明其处于正常非病理条件下的静息状态。 体内该方法还能保持小胶质细胞的免疫表型及生化功能，这一点可通过脂多糖（LPS）和Pam刺激后诱导出的形态学改变、NF-κB p65亚基（p65）的核转位以及特征性促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌得以证实。3CSK4 （Pam）挑战。因此，当前的分离方法能够保持静息态和活化态小胶质细胞的免疫表型，为研究小胶质细胞生物学提供了实验手段 离体 条件.

引言

小胶质细胞是中枢神经系统实质中的监视性巨噬细胞，约占成年哺乳动物脑内总细胞群体的12%。小胶质细胞起源于卵黄囊的髓系前体细胞 ，在成年中枢神经系统的不同细胞构筑区域中，其细胞密度和形态存在差异1-5。在健康的成年脑中，小胶质细胞体积较小，呈分支状或极性细胞形态，具有纤细且动态变化的突起。与外周巨噬细胞的形态不同，小胶质细胞在健康脑组织中表现为一种静息状态、低活性的表型，可能看似细胞活动性较低；然而，in vivo 成像研究表明，小胶质细胞的突起会动态地延伸和回缩，以持续监测其微环境，这一行为类似于"取样与巡查"6,7。

小胶质细胞对脑内环境及病理生理变化具有高度敏感性且反应各异，能够从监测状态转变为效应状态——通常分别被称为其静息状态和激活状态。这种激活状态的转变可通过膜结合的模式识别受体（PRRs）介导，例如Toll样受体（TLRs），它们可响应病原体相关分子模式（PAMPs），即细菌和病毒来源的脂蛋白、核酸和碳水化合物8-11。除了PAMPs外，研究还表明PRRs可介导小胶质细胞对无菌性、非病原性分子——即危险/损伤相关分子模式（DAMPs）——的激活反应，这些分子代表了中枢神经系统（CNS）稳态的破坏，例如细胞损伤12-16。一旦被激活，PRRs会启动细胞内信号级联反应，导致小胶质细胞形态和基因表达的改变；具体而言，激活的小胶质细胞呈现阿米巴样表型，将p65 NF-κB亚基（p65）转位至细胞核，并上调促炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β））以及活性氧（ROS）的产生与分泌16-24。尽管这些分泌分子在中枢神经系统固有免疫应答中发挥关键作用，但也被发现会增加神经元的氧化应激，从而在帕金森病和阿尔茨海默病等疾病状态下诱导并加剧神经退行性变25-29。

然而，小胶质细胞在病理状态下的活化机制尚未完全阐明。因此，分离小胶质细胞成为研究这些生物学过程的有力工具，因为许多 在体 体外培养可重现小胶质细胞活化的特征。目前已有多种方法用于分离小胶质细胞，包括对中枢神经系统组织进行酶消化后，通过Percoll梯度离心分离。30,31然而，酶消化可能会通过降低细胞表面抗原的表达而改变细胞的免疫表型32，且每只动物获得的细胞数量低于本文所述方法。具体而言，我们报道每只幼鼠大脑皮层平均获得的小胶质细胞产量为 7.5 x 105 细胞，而以往通过Percoll梯度从整个中枢神经系统分离的方法仅能获得3-5 x 105 细胞30,33,34本方法通过利用小胶质细胞的低黏附特性来分离细胞，避免了消化酶的使用，从而保留了小胶质细胞的免疫表型和功能特性。

在本研究中，我们描述了从新生小鼠杂合子 CX3CR1-GFP（CX3CR1-GFP+/-）以及通过在旋转摇床上进行机械振荡处理C57BL/6小鼠皮层，此为对先前已发表方法的扩展24,35我们利用前一种小鼠品系以便于小胶质细胞的可视化观察，因为这些小鼠在内源性启动子调控下表达GFP Cx3Cr1 位点 - 一种单核细胞特异性启动子36-38该方法可获得高纯度的小胶质细胞培养物，且其免疫表型得以保持 离体 通过形态学变化、p65 的核转位以及在细菌脂多糖（LPS）或 Pam 刺激下 TNF-α 的分泌得以证实3CSK4，分别为 TLR4 和 TLR1/2 激动剂。

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方案

 在开始本方案之前，将出生后第1至第3天（P1-3）的新生小鼠收集到无菌容器中，容器内放置原笼垫料以提供保护和保温。为获得最佳的小胶质细胞得率，需快速高效地完成本方案操作。完整的试剂列表请见表1。

1. 仪器、培养基和培养皿的准备

  1. 配制 10 ml/只 小鼠小胶质细胞完全培养基（MCM；1x Earle's 最小必需培养基 [MEM]，添加：1 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、0.6% v/v D-(+)-葡萄糖、100 μg/ml 青霉素/链霉素（P/S）、4% v/v 胎牛血清（FBS）、6% v/v 马血清），加入每个T-75培养瓶中（每只幼鼠1个培养瓶）；盖紧瓶盖，水平置于培养箱内（37 °C，5% CO₂）2）平衡 1 小时。 在开始解剖之前，必须先将该培养基在烧瓶中平衡.
  2. 制备、分装，并在37 °C水浴中预热 用于解剖的MCM （6 ml/只）以及用于细胞重悬的MCM（2 ml/只），分别置于不同的锥形管中。 制备、分装并 冰上冷却 研磨介质（MM；HBSS 添加：100 μg/ml） P/S，0.01 M HEPES；3 ml/只），以及解剖培养基（DM；MEM 添加 100 μg/ml P/S；每只幼鼠2 ml。
  3. 将以下手术器械浸入70%乙醇中10分钟以灭菌：剪刀#1（1把；用于断头），镊子#1（2把；用于固定鼻部并剥离皮质），剪刀#2（1把；无角度；用于切开头皮），镊子#2（1把；用于去除头皮），镊子#3（1把；用于去除颅骨），镊子#4（2把；用于去除脑膜），剪刀#3（1把；用于剪碎脑组织）。在无菌垫上晾干。
  4. 用70%乙醇擦拭水平气流工作台和解剖显微镜。
  5. 将DM分装至2个无菌的100 毫米培养皿用于采集头部（3 毫升；每3只幼崽使用1个培养皿）和解剖（1 毫升；每只幼崽1个培养皿；解剖前置于冰上预冷）。将 MM 分装至1个无菌的100 用于剪碎脑组织的毫米级培养皿（1 ml；每只幼鼠1个培养皿）。

2. 脑组织解剖

  1. 处死前，用实验室纸巾蘸取70%乙醇轻轻清洁幼鼠的颈部和头部。使用剪刀#1迅速通过去头法处死幼鼠，并将头部收集到预先准备好的培养皿中。在处理下一只动物之前，先完成单只幼鼠的处死和解剖。
  2. 将头部转移至预冷的解剖皿中，在解剖显微镜下用镊子#1夹住鼻部固定头部（也可通过将镊子插入眼眶固定）；使用剪刀#2在头皮上做“Y”形切口：从头部基部开始，斜向眼睛方向剪开。用镊子#3轻轻从切口处向外剥离并移除头皮，暴露颅骨。
  3. 使用镊子#3轻轻去除头部基部的结缔组织。当颅骨基部暴露后，将镊子#3的一侧尖端沿大脑与颅骨之间的间隙（沿大脑半球间裂）小心插入颅腔内，夹住后轻轻向上牵拉，使颅骨裂开。
  4. 使用镊子#1破坏大脑腹侧下方的结缔组织，随后用同一工具将整个大脑取出。通过在大脑腹侧施加向上的力，将大脑从颅腔中抬起取出。
  5. 保持大脑解剖学朝向：背侧朝上，以便在解剖显微镜下观察皮层结构；将镊子尖端插入中脑与皮层交界处以固定大脑位置；使用镊子#4彻底去除大脑表面的皮层脑膜，然后继续去除腹侧脑膜。脑膜必须完全清除后，再用镊子#4将皮层组织从其余脑组织中分离。彻底清除脑膜组织对于提高小胶质细胞的纯度和得率至关重要。

3. 脑组织切碎

  1. 将脑皮层转移至预先准备好的剪碎皿中；在II级生物安全柜内采用无菌技术继续进行剪碎操作。
  2. 使用3号剪刀剪碎脑组织；将剪碎后的组织转移至15 ml 锥形管中；用1 ml MM分别冲洗剪刀和剪碎皿，收集冲洗液并加入含有剪碎组织的15 ml 锥形管中。此冲洗步骤可确保所有残留组织均转移至锥形管，从而最大化小胶质细胞的得率。将组织悬液静置1–2分钟，使剪碎的组织沉降至管底。静置时间不得超过2 min ，因为MM不含必需营养成分。
  3. 使用通用的1,000 μl 微量移液器配标准吸头，小心移除并弃去2 ml 上清液，注意勿扰动已沉降的剪碎组织。
  4. 向剪碎的组织中加入3 ml MCM；使用通用的1,000 μl 微量移液器配标准吸头，用力吹打组织进行 triturate（吹打混悬）。吹打完成后应无可见的固体组织残留。使用同一吸头再加入3 ml MCM，以收集吸头内残留的吹打样品。

4. 培养皮层细胞

  1. 将切碎的组织离心以沉淀细胞（215 × g；5 分钟；室温；使用带摆桶转子的临床离心机）。将离心后的细胞重新移回生物安全柜中，吸除并弃去上清液；轻柔重悬细胞沉淀（每管 2 ml；MCM）；将重悬的细胞悬液加入预先准备好的 T-75 培养瓶中；盖紧瓶盖，将培养瓶水平放置于加湿的常规组织培养孵箱中（37 °C，5% CO₂）2)。将细胞孵育24小时。
  2. 24 小时后，轻轻将培养瓶敲击手掌以松解组织碎片。敲击前后均需检查细胞，确保碎片完全去除。将培养瓶竖直放置；移除并弃去培养基；从培养瓶底部加入新鲜 MCM 培养基（12 ml；37 °C）；盖紧瓶盖，水平放回培养箱中。
  3. 每日检查细胞是否存在污染，并监测其生长状况。
  4. 大约在17至21天 体外 （培养天数），小胶质细胞将可从混合胶质细胞培养物中收获。为确定细胞是否已准备好，需在倒置相差显微镜下观察细胞。 小胶质细胞在汇合度约为40%时即可收获。此时细胞呈小而明亮的球形，以单层形式生长在其他胶质细胞的表面。

5. 从混合胶质细胞培养物中分离小胶质细胞

  1. 为分离小胶质细胞，用力敲击培养瓶的底部。这种震荡有助于利用小胶质细胞低黏附的特性，使其与其他胶质细胞分离。
  2. 用Parafilm密封T-75培养瓶瓶盖，并将混合胶质细胞培养物置于温控非加湿旋转摇床中旋转（200 rpm；37 °C；5 hr）。切勿使细胞摇动超过5小时。5小时后，使用倒置相差显微镜观察，确认小胶质细胞已从培养瓶表面脱落。小胶质细胞呈明亮、圆形、悬浮状态。培养瓶底部会残留一层星形胶质细胞和少突胶质细胞。
  3. 收集含有小胶质细胞的上清液至无菌锥形离心管中，离心收集细胞（215 × g；5 min；摆桶转子）。
  4. 将小胶质细胞沉淀重悬于预热的微胶质细胞生长培养基（MGM；MEM添加：1 mM丙酮酸钠、0.6% v/v葡萄糖、1 mM L-谷氨酰胺、100 μg/ml P/S、5% v/v FBS；约2 ml/瓶），使用血细胞计数板测定细胞浓度，并以每孔1 × 105个细胞接种于24孔板（每孔500 μl；MGM），可接种于塑料表面或无菌玻璃盖玻片上。采用此方法，平均每只新生小鼠皮层可获得7.5 × 105个微胶质细胞。
  5. 接种后24小时 ，移除全部培养基，并更换为新鲜MGM（37 °C），以去除悬浮细胞和碎片。此步骤对细胞存活及维持小胶质细胞静息状态至关重要。细胞在换液后可立即用于实验。

6. 示例处理方法

  1. 将细胞暴露于 10 ng/ml 的 Pam3CSK4 （Pam）、10 ng/ml 脂多糖（LPS）或对照溶剂中；在湿润培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育 2 或 24 小时 。

7. 分析小胶质细胞的功能性 离体 通过免疫荧光成像和免疫细胞化学

  1. 处理后，将细胞培养基收集至微量离心管（1.5 ml）中，使用台式微量离心机离心（2 分钟；900 × g）以澄清培养基。将上清液转移至洁净的微量离心管中；立即进行检测，或于 -20 °C 保存至使用前。使用市售的小鼠 TNF-α ELISA 试剂盒检测细胞培养上清液中的 TNF-α 浓度。
  2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并用含 4%（w/v）多聚甲醛和 4%（w/v）蔗糖的 PBS 溶液（pH 7.4，即 4% PFA）固定细胞（15 分钟；室温）。固定后，在旋转摇床上轻轻振荡，用 PBS 洗涤 5 分钟 。
    1. 免疫荧光/免疫细胞化学。 固定并用 PBS 洗涤后，对小胶质细胞进行免疫细胞化学处理。所有步骤均在轻柔振荡条件下进行。用 PBS/0.1% Triton X-100 对细胞进行通透处理；用 PBS/10% 正常山羊血清封闭细胞 1 小时。在封闭缓冲液中，加入兔抗 NF-κB 抗体（p65 亚基；1/1,250）或兔抗 Iba-1 抗体（1/750），4 °C 过夜孵育 。随后加入荧光标记的山羊抗兔 IgG 二抗（1:1,000），室温孵育 1 小时，以显示抗原-抗体复合物。用 PBS/0.1% Triton X-100 洗涤三次，每次 5 分钟，以去除未结合的二抗。
    2. 用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚/PBS（DAPI；0.1 μg/ml）对细胞进行复染，以显示细胞核。所有来源于 CX3CR1-GFP+/- 小鼠的小胶质细胞均表达 GFP。使用 350 nm 波长滤光片观察 DAPI；488 nm 波长滤光片观察 GFP；594 nm 波长滤光片观察 p65 和 Iba-1 免疫复合物。
  3. 使用水溶性封片液封片，并通过荧光显微镜观察小胶质细胞。

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结果

保留小胶质细胞的免疫表型和功能 离体 在分离过程中，能够利用这些细胞作为小胶质细胞生物学研究模型的关键在于保持其免疫功能的完整性。为了证明采用本方法可成功维持小胶质细胞的免疫功能，我们从出生后3天（P3）的新生小鼠（CX3CR1-GFP）中分离了皮层小胶质细胞。+/-以及C57BL/6) 并用LPS或Pam处理培养物。

如图1A所示，通过旋转振荡搅动分离小胶质细胞，可维持小胶质细胞在正常体内条件下的静息表型。为评估小胶质细胞纯度，对CX3CR1-GFP+/-细胞培养物进行巨噬细胞抗原Iba-1染色，并用DAPI复染以显示细胞核。如图1A和图1B所示，在低倍镜下，采用本方法分离小胶质细胞可获得高纯度的细胞培养物，超过95%的细胞均显示出GFP、Iba-1与DAPI的共定位。

接下来，我们通过使用LPS刺激细胞，以ex vivo方式验...

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讨论

本方案提供了一种从新生小鼠中有效分离皮质小胶质细胞的方法。该方法具有双重优势：1）通过荧光成像、免疫细胞化学和ELISA检测证实，能够保持小胶质细胞的免疫表型和功能特性；2）在分离前允许小胶质细胞与其他胶质细胞（星形胶质细胞和少突胶质细胞）共存并成熟，这可能促进胶质细胞培养成熟期间重要的细胞间相互作用。重要的是，所分离的细胞表现出高存活率和均一性，且功能特性和免疫表型得以保留 离体.

为成功分离出纯度最高且得率最佳的小胶质细胞，需特别注意并认真执行以下几个步骤：1）在整个实验过程中保持无菌且健康的细胞培养环境；2）在显微解剖过程中彻底去除大脑皮层的所有脑膜组织；3）剪碎皮层组织后，正确清洗剪切板和剪刀；4）在开始显微解剖前，将MCM在T-75培养瓶中于培养箱内预平衡；5）分离后24小时 更换培养基。

由于小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，它们对环境刺激具有高度敏感性。因此，避免培养过程中受到病原体污染对于维持静息状态小胶质细胞的免疫表型和功能特性至关重要。每日观察细胞以监测污染情况和生长状态，...

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披露

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

本工作由 NIEHS R01ES014470（KMZ）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
葡萄糖SigmaG8270用MilliQ水配制20%储存液；过滤除菌；4 °C保存；有效期：3-6个月。用于配制MCM和MGM。
丙酮酸钠 100 mM (100x)HycloneSH30239.014 °C保存。用于配制MCM和MGM。
青霉素/链霉素 10,000 单位/ml (100x)Gibco15140-122-20 °C保存。用于配制MCM、MGM、MM和DM。
L-谷氨酰胺 200 mM (100x)Gibco25030-081-20 °C保存。用于配制MCM和MGM。
胎牛血清（限定型）HycloneSH30070.03过滤除菌；-20 °C保存。用于配制MCM和MGM。
最低必需培养基Earle's（MEM）Cellgro15-010-CV不含L-谷氨酰胺。含Earle's盐。用于配制MCM、MGM和DM。
马血清Gibco16050过滤除菌；-20 °C保存。用于配制MCM和MGM。
Hanks'平衡盐溶液（HBSS）Cellgro21-021-CV不含钙和镁。4 °C保存。用于配制MM。
HEPES 1 MGibco15630-0314 °C保存。用于配制MM。
T-75培养瓶Corning430641
4',6-二脒基-2-苯基吲哚双乳酸盐（DAPI）InvitrogenD3571用于细胞核染色。
兔抗Iba1抗体Wako019-19741免疫细胞化学染色Iba1时使用1/750稀释度。 
兔抗NFκB (p65) 抗体Abcam7970免疫细胞化学染色p65时使用1/1,250稀释度。
Alexa Fluor 594 山羊抗兔IgG (H+L)InvitrogenA11012免疫细胞化学中用于抗原-抗体复合物的可视化，使用1/1,000稀释度。
10 ml一次性移液管Fisher Scientific13-678-11E
50 ml一次性离心管Fisher Scientific05-539-8
15 ml一次性离心管Fisher Scientific05-539-12
无菌聚苯乙烯培养皿Fisher Scientific875713100 mm x 15 mm
剪刀：直型Metzenbaum剪（剪刀#1）Roboz SurgicalRS-60101.5英寸；用于去除头部
剪刀：Vannas
（剪刀#2）		Fine Science Tools15000-081英寸；无角度；2.5 mm切割刃；用于切开头皮
剪刀：学生型Vannas剪（剪刀#3）Fine Science Tools91501-091英寸；弯曲型；用于剪碎脑组织
镊子：Dumont #7
（镊子#1）		Fine Science Tools91197-002把；用于固定鼻部并剥离皮质 
镊子：Dumont #2
（镊子#2）		Fine Science Tools11223-201把；用于去除头皮
镊子：Dumont #3
（镊子#3）		Fine Science Tools11231-301把；用于去除颅骨
镊子：Dumont #5a
（镊子#4）		Fine Science Tools11253-211把；用于去除脑膜
专用设备清单
变倍体视解剖显微镜 OlympusSZ4060显微镜置于水平层流柜内
水平层流柜NuaireNU-201-330
生物安全柜Labconco3440001II级
水套式CO2培养箱VWR97025-836设定为37 °C，5% CO2
摆动吊篮Fisher Scientific75006441与摆动转子配合使用
摆动转子Fisher Scientific75006445最大半径：19.2 (cm)
Sorvall Legend RT+ 离心机
（临床离心机）		Fisher Scientific75-004-377配备摆动转子
AccuSpin Micro 17 微型离心机
（台式微型离心机）		Fisher ScientificS98645配备微升转子（24 x 1.5/2.0 ml；货号：75003524）  

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