成功研究小胶质细胞生物学的一个关键在于，从小胶质细胞从中枢神经系统组织中分离的过程中，保持其免疫功能的 ex vivo 状态。通过旋转振荡法分离小胶质细胞，可获得高纯度且具有免疫功能的细胞培养物，这一点在使用促炎刺激物脂多糖（LPS）和 Pam3CSK4（Pam）激活小胶质细胞后，通过荧光成像、免疫细胞化学和 ELISA 检测得以验证。
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摘要
摘要
从中枢神经系统组织中分离小胶质细胞是一种用于研究小胶质细胞生物学的有力研究工具 离体本方法详细描述了一种通过旋转摇床进行机械振荡，从新生小鼠大脑皮层中分离小胶质细胞的实验流程。该小胶质细胞分离方法可获得高纯度的皮层小胶质细胞，其形态学和功能特征表明其处于正常非病理条件下的静息状态。 体内该方法还能保持小胶质细胞的免疫表型及生化功能，这一点可通过脂多糖（LPS）和Pam刺激后诱导出的形态学改变、NF-κB p65亚基（p65）的核转位以及特征性促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌得以证实。3CSK4 （Pam）挑战。因此，当前的分离方法能够保持静息态和活化态小胶质细胞的免疫表型，为研究小胶质细胞生物学提供了实验手段 离体 条件.
引言
小胶质细胞是中枢神经系统实质中的监视性巨噬细胞，约占成年哺乳动物脑内总细胞群体的12%。小胶质细胞起源于卵黄囊的髓系前体细胞 ，在成年中枢神经系统的不同细胞构筑区域中，其细胞密度和形态存在差异1-5。在健康的成年脑中，小胶质细胞体积较小，呈分支状或极性细胞形态，具有纤细且动态变化的突起。与外周巨噬细胞的形态不同，小胶质细胞在健康脑组织中表现为一种静息状态、低活性的表型，可能看似细胞活动性较低；然而，in vivo 成像研究表明，小胶质细胞的突起会动态地延伸和回缩，以持续监测其微环境，这一行为类似于"取样与巡查"6,7。
小胶质细胞对脑内环境及病理生理变化具有高度敏感性且反应各异，能够从监测状态转变为效应状态——通常分别被称为其静息状态和激活状态。这种激活状态的转变可通过膜结合的模式识别受体（PRRs）介导，例如Toll样受体（TLRs），它们可响应病原体相关分子模式（PAMPs），即细菌和病毒来源的脂蛋白、核酸和碳水化合物8-11。除了PAMPs外，研究还表明PRRs可介导小胶质细胞对无菌性、非病原性分子——即危险/损伤相关分子模式（DAMPs）——的激活反应，这些分子代表了中枢神经系统（CNS）稳态的破坏，例如细胞损伤12-16。一旦被激活，PRRs会启动细胞内信号级联反应，导致小胶质细胞形态和基因表达的改变；具体而言，激活的小胶质细胞呈现阿....
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方案
在开始本方案之前，将出生后第1至第3天（P1-3）的新生小鼠收集到无菌容器中，容器内放置原笼垫料以提供保护和保温。为获得最佳的小胶质细胞得率，需快速高效地完成本方案操作。完整的试剂列表请见表1。
1. 仪器、培养基和培养皿的准备
- 配制 10 ml/只 小鼠小胶质细胞完全培养基（MCM；1x Earle's 最小必需培养基 [MEM]，添加：1 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、0.6% v/v D-(+)-葡萄糖、100 μg/ml 青霉素/链霉素（P/S）、4% v/v 胎牛血清（FBS）、6% v/v 马血清），加入每个T-75培养瓶中（每只幼鼠1个培养瓶）；盖紧瓶盖，水平置于培养箱内（37 °C，5% CO₂）2）平衡 1 小时。 在开始解剖之前，必须先将该培养基在烧瓶中平衡.
- 制备、分装，并在37 °C水浴中预热 用于解剖的MCM （6 ml/只）以及用于细胞重悬的MCM（2 ml/只），分别置于不同的锥形管中。 制备、分装并 冰上冷却 研磨介质（MM；HBSS 添加：100 μg/ml） P/S，0.01 M HEPES；3 ml/只），以及解剖培养基（DM；MEM 添加 100 μg/ml P/S；每只幼鼠2 ml。
- 将以....
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结果
保留小胶质细胞的免疫表型和功能 离体 在分离过程中，能够利用这些细胞作为小胶质细胞生物学研究模型的关键在于保持其免疫功能的完整性。为了证明采用本方法可成功维持小胶质细胞的免疫功能，我们从出生后3天（P3）的新生小鼠（CX3CR1-GFP）中分离了皮层小胶质细胞。+/-以及C57BL/6) 并用LPS或Pam处理培养物。
如图1A所示，通过旋转振荡搅动分离小胶质细胞，可维持小胶质细胞在正常体内条件下的静息表型。为评估小胶质细胞纯度，对CX3CR1-GFP+/-细胞培养物进行巨噬细胞抗原Iba-1染色，并用DAPI复染以显示细胞核。如图1A和图1B所示，在低倍镜下，采用本方法分离小胶质细胞可获得高纯度的细胞培养物，超过95%的细胞均显示出GFP、Iba-1与DAPI的共定位。
接下来，我们通过使用LPS刺激细胞，以ex vivo方式验.......
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讨论
本方案提供了一种从新生小鼠中有效分离皮质小胶质细胞的方法。该方法具有双重优势：1）通过荧光成像、免疫细胞化学和ELISA检测证实，能够保持小胶质细胞的免疫表型和功能特性；2）在分离前允许小胶质细胞与其他胶质细胞（星形胶质细胞和少突胶质细胞）共存并成熟，这可能促进胶质细胞培养成熟期间重要的细胞间相互作用。重要的是，所分离的细胞表现出高存活率和均一性，且功能特性和免疫表型得以保留 离体.
为成功分离出纯度最高且得率最佳的小胶质细胞，需特别注意并认真执行以下几个步骤：1）在整个实验过程中保持无菌且健康的细胞培养环境；2）在显微解剖过程中彻底去除大脑皮层的所有脑膜组织；3）剪碎皮层组织后，正确清洗剪切板和剪刀；4）在开始显微解剖前，将MCM在T-75培养瓶中于培养箱内预平衡；5）分离后24小时 更换培养基。
由于小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，它们对环境刺激具有高度敏感性。因此，避免培养过程中受到病原体污染对于维持静息状态小胶质细胞的免疫表型和功能特性至关重要。每日观察细胞以监测污染情况和生长状态，.......
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
本工作由 NIEHS R01ES014470（KMZ）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 葡萄糖 | Sigma | G8270 | 用MilliQ水配制20%储存液；过滤除菌；4 °C保存；有效期：3-6个月。用于配制MCM和MGM。 |
| 丙酮酸钠 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | 4 °C保存。用于配制MCM和MGM。 |
| 青霉素/链霉素 10,000 单位/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | -20 °C保存。用于配制MCM、MGM、MM和DM。 |
| L-谷氨酰胺 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | -20 °C保存。用于配制MCM和MGM。 |
| 胎牛血清（限定型） | Hyclone | SH30070.03 | 过滤除菌；-20 °C保存。用于配制MCM和MGM。 |
| 最低必需培养基Earle's（MEM） | Cellgro | 15-010-CV | 不含L-谷氨酰胺。含Earle's盐。用于配制MCM、MGM和DM。 |
| 马血清 | Gibco | 16050 | 过滤除菌；-20 °C保存。用于配制MCM和MGM。 |
| Hanks'平衡盐溶液（HBSS） | Cellgro | 21-021-CV | 不含钙和镁。4 °C保存。用于配制MM。 |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | 4 °C保存。用于配制MM。 |
| T-75培养瓶 | Corning | 430641 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚双乳酸盐（DAPI） | Invitrogen | D3571 | 用于细胞核染色。 |
| 兔抗Iba1抗体 | Wako | 019-19741 | 免疫细胞化学染色Iba1时使用1/750稀释度。 |
| 兔抗NFκB (p65) 抗体 | Abcam | 7970 | 免疫细胞化学染色p65时使用1/1,250稀释度。 |
| Alexa Fluor 594 山羊抗兔IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | 免疫细胞化学中用于抗原-抗体复合物的可视化，使用1/1,000稀释度。 |
| 10 ml一次性移液管 | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml一次性离心管 | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml一次性离心管 | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| 无菌聚苯乙烯培养皿 | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| 剪刀：直型Metzenbaum剪（剪刀#1） | Roboz Surgical | RS-6010 | 1.5英寸；用于去除头部 |
| 剪刀：Vannas （剪刀#2） | Fine Science Tools | 15000-08 | 1英寸；无角度；2.5 mm切割刃；用于切开头皮 |
| 剪刀：学生型Vannas剪（剪刀#3） | Fine Science Tools | 91501-09 | 1英寸；弯曲型；用于剪碎脑组织 |
| 镊子：Dumont #7 （镊子#1） | Fine Science Tools | 91197-00 | 2把；用于固定鼻部并剥离皮质 |
| 镊子：Dumont #2 （镊子#2） | Fine Science Tools | 11223-20 | 1把；用于去除头皮 |
| 镊子：Dumont #3 （镊子#3） | Fine Science Tools | 11231-30 | 1把；用于去除颅骨 |
| 镊子：Dumont #5a （镊子#4） | Fine Science Tools | 11253-21 | 1把；用于去除脑膜 |
| 专用设备清单 | |||
| 变倍体视解剖显微镜 | Olympus | SZ4060 | 显微镜置于水平层流柜内 |
| 水平层流柜 | Nuaire | NU-201-330 | |
| 生物安全柜 | Labconco | 3440001 | II级 |
| 水套式CO2培养箱 | VWR | 97025-836 | 设定为37 °C，5% CO2 |
| 摆动吊篮 | Fisher Scientific | 75006441 | 与摆动转子配合使用 |
| 摆动转子 | Fisher Scientific | 75006445 | 最大半径：19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ 离心机 （临床离心机） | Fisher Scientific | 75-004-377 | 配备摆动转子 |
| AccuSpin Micro 17 微型离心机 （台式微型离心机） | Fisher Scientific | S98645 | 配备微升转子（24 x 1.5/2.0 ml；货号：75003524） |
参考文献
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adul....
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