从动物模型中采集乳汁有助于开展多种研究：了解被动免疫机制、鉴定导致垂直传播的病原体，以及通过使用转基因小鼠实现人乳中蛋白质的商业化生产。本文介绍了一种适用于小鼠和 Reeves 水鹿的乳汁采集简易方法。
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本文内容
摘要
摘要
在研究实验室中，动物模型常被用于实现那些在病原体天然宿主中通常被认为不切实际的目标。通过从动物体内采集乳汁，科研人员能够研究繁殖过程中的多个方面，包括垂直传播、被动免疫、乳腺生物学以及泌乳机制。为这些研究获取足够体积的乳汁是一项具有挑战性的任务，尤其是使用小型动物模型时。本文介绍一种经济且简便的小鼠和 Reeves 氏麂乳汁采集方法，该方法无需特殊设备或 extensive 培训。此方法需要两名研究人员协作：一人负责挤奶并固定动物，另一人则使用合适的容器从小型麂或小鼠模型中收集乳汁。对于小鼠模型，还需使用 P-200 移液器及配套的吸头。尽管该方法成本较低且操作相对简单，但研究人员应注意，为获得最佳乳汁采集效果，需对动物实施麻醉。
引言
动物模型能够提供通过体外分析无法获得的疾病病理学信息。in vitro 分析。为了获得最有效的结果，重要的是使用与目标疾病和物种密切相关的动物模型。例如，赤麂（Muntiacus reevesi），一种小型亚洲鹿1,2，以及表达鹿源朊蛋白的转基因小鼠（CerTgPrP）3，是研究鹿科动物的有用动物模型。这两种动物均为全年多次发情，可实现全年繁殖，因此能持续提供与妊娠相关的组织和体液，用于研究鹿科生物学中的特定机制。乳汁研究具有广泛的应用价值，而在动物模型中开展此类研究比在人类中更为简便且成本更低。研究人员可将乳汁和初乳作为潜在的研究来源，用于：1）传染病传播途径的研究；2）母体向子代传递免疫球蛋白，以研究被动免疫的形成过程4；以及 3）乳铁蛋白的研究，该蛋白存在于人乳中，参与被动免疫，目前研究人员正尝试实现其商业化生产5。
从小型动物中收集大量乳汁可能是一项困难的任务。Rogers 提出了一种从大鼠收集乳汁的方法6，随后该方法也被用于小鼠。DePeters 和 Hovey 提出了两种乳汁采集方法：一种是使用连接在巴斯德移液管上的橡胶移液器球手动产生负压；另一种则需要构建一个挤奶装置，并将其连接至真空源（例如水龙头）以采集小鼠乳汁7。本文中，我们提出一种简单且低成本的方法，可用于从小鼠和里夫斯氏麂鹿中采集乳汁，该方法仅需常规实验室设备和基本的技术操作技能。我们的方法能够获得足量的乳汁，适用于多种实验应用。
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方案
1. 小鼠泌乳方案
本方案中所述方法已获得实验动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 将母鼠与仔鼠分离
- 选择待采乳的母鼠。选择产后8-12天、拥有4只或以上仔鼠的母鼠，可获得最大量的乳汁；尽管在产后任何时间点至21天内均可进行采集。
- 在采乳前至少2小时将母鼠与其仔鼠分笼饲养。
注意：若需在特定时间段内对多只母鼠进行采乳，可将分笼的母鼠共同饲养于同一笼具中，但需提供充足的食物和饮水。
2. 催产素、麻醉剂和眼用润滑剂的给药
- 按每公斤体重2 IU的剂量腹腔注射催产素（oxytocin）。催产素是一种作用于哺乳期雌性动物乳腺的激素，可促进乳汁分泌。催产素可从兽医处获取。
- 腹腔注射含有每公斤体重80–100 mg氯胺酮（ketamine）和每公斤体重5–10 mg赛拉嗪（xylazine）的麻醉混合液。例如，可预先配制10 ml的麻醉储备液，适用于体重约30 g的小鼠，其中包含0.1 ml赛拉嗪、8.9 ml H2O和1.0 ml氯胺酮。对该体重范围的小鼠注射0.25 ml麻醉液，可使其镇静约20–30分钟，足以完成乳汁采集。
备注：为确认动物是否已成功麻醉，可将其轻轻置于坚硬表面俯卧位；若其完全麻醉，则不应有足部活动或试图站立的行为。若小鼠初次给药后未达到充分麻醉状态，研究人员可根据小鼠体型及已达到的镇静程度，追加原剂量的¼或½麻醉混合液。但追加剂量可能增加对麻醉产生不良反应的风险，并可能导致麻醉更深或持续时间更长。
注意：若需对多只母鼠进行采乳操作，应错开催产素与麻醉剂的注射时间，因为催产素半衰期较短，且氯胺酮与赛拉嗪的镇静作用时间有限。 - 将少量眼用润滑剂涂抹于每只眼睛的内眼角并均匀展开，以防止小鼠在麻醉期间眼睛干燥。
3. 乳汁采集
乳汁采集最简便的方式是两名研究人员协作完成：一名研究人员固定麻醉后的小鼠并手动挤出乳汁（记为 R1），另一名研究人员负责收集乳汁（记为 R2）。若将小鼠固定在平坦表面上以避免伤害，也可由一人单独完成该操作。
- R2 应配备无菌酒精棉片、P-200 移液枪、每只小鼠使用一个干净的吸头，以及用于盛放乳汁的容器，例如 1.5 ml 离心管或 1.2 ml 冻存管（参见材料表）。
- 当催产素开始发挥作用时，可在小鼠乳腺区域观察到乳汁排出（见图1A）。R1：取出一片无菌酒精棉片，轻轻擦拭小鼠乳腺区域，以在挤奶前清洁该区域。用拇指和食指以向上轻柔按摩和挤压乳腺组织的方式手动挤出乳汁，直至乳头基部出现可见的乳滴。
- 将 P-200 移液枪的按钮按至第一停点，排出吸头内的空气，准备收集乳汁。
- 将吸头置于乳滴顶部，缓慢松开按钮以轻柔地将乳汁吸入吸头中。注意不要将吸头过于靠近乳头或皮肤（见图1B）。无需完全松开按钮，否则会将乳汁吸入吸头顶端，导致粘稠的乳汁难以完全排入收集容器中。
- 用拇指按下移液枪按钮，超过第一停点，将乳汁排入容器中（见图1C）。为便于排出微量液体，可将吸头尖端轻触管壁，避免液体损失。
- 继续手动从每个乳头挤奶，按顺时针或逆时针方向依次进行，避免遗漏任何乳头。若某个乳头产奶量较多，可反复返回对该乳头持续挤奶，此操作既可接受又具实用性。
4. 母体麻醉逆转
- 大多数情况下，在挤奶过程中母鼠通常会开始逐渐苏醒。若未出现此情况，可将母鼠放置于热源下方的间接加热笼中，例如置于加热循环毯下，直至其开始苏醒。
注意：当母鼠开始苏醒时，应密切观察其活动情况，直至其能够自主在笼内走动。 - 一旦母鼠能够在笼内自如活动且无挣扎表现，即可将其放回原先的笼子中与幼崽一同饲养。目前未观察到乳汁采集后对幼崽哺乳能力产生任何不良影响。
2. 麂乳汁采集方案
本方案中所述方法已获得实验动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 将母鹿与其后代分离
- 选择待挤奶的母鹿。 Reeves’ muntjac 鹿通常每胎产一仔2。为使幼仔有机会获取初乳中的必需营养物质，应在分娩后第二天对母鹿进行挤奶8。
注意：幼仔通常会躲藏起来，在挤奶过程中不会出现；无需将母子分离。
2. 催产素、麻醉剂和眼用润滑剂的给药
- 按10 IU/kg剂量肌肉注射（IM）催产素。催产素是一种作用于哺乳期雌性动物乳腺以促进乳汁排出的激素。催产素可向兽医获取。
- 肌肉注射（IM）BAM麻醉剂11，其中包含丁丙诺啡 0.45 mg/kg、阿扎哌隆 0.25 mg/kg、美托咪定 0.07 mg/kg。一次BAM麻醉剂混合物的剂量可使麂子镇静约20-30分钟，足以完成全部乳汁采集。另一种可选麻醉剂为咪达唑仑，剂量为1-2 mg/kg，可使麂子镇静约10-15分钟。虽然该时间足以完成乳汁采集，但此麻醉剂代谢速度较BAM更快，动物可能在较短时间结束时试图逃脱。
注意：对疼痛反应轻微，触碰耳朵时仅有轻微反射，随后R1能够无挣扎地抱住MJ，表明动物已成功麻醉。
注意：若麂子对初始剂量未达到完全麻醉，研究人员可根据动物体型和/或已实现的镇静程度，追加原剂量的¼或½。然而，这可能增加对麻醉产生不良反应的风险，也可能导致麂子麻醉更深和/或麻醉时间更长。 - 在每只眼睛的眼角处涂抹少量润滑剂并均匀涂抹，以防止麂子在麻醉期间眼睛干涩。
3. 乳汁采集
乳汁采集最好由两名研究人员共同完成：一名研究人员将麻醉后的麂置于膝上并手动挤奶（记为 R1），另一名研究人员负责固定麂的头部，使其处于舒适安全的位置，并负责收集乳汁（记为 R2）。
- 根据所使用的麻醉剂，挤奶操作应在以下位置进行：1）在动物圈舍内进行，以便在操作过程中动物苏醒时有安全的环境（咪达唑仑诱导麻醉时）；或 2）在无垫料的前室进行，以保持清洁（BAM诱导麻醉时）。
- R1 和 R2 应准备好经乙醇浸泡的纱布以及若干 15 ml 锥形聚丙烯管，用于收集乳汁。
- 当催产素开始起效时，麂的乳腺区域将出现明显的泌乳现象。R1：使用乙醇浸泡的纱布对戴手套的手部、手指、整个乳房以及每个乳头进行消毒。R2：将麂的头部固定在安全且舒适的位置，以确保呼吸顺畅，并有助于防止瘤胃反流。同时，将收集管靠近正在挤奶的乳头但不要接触，以避免潜在污染。
- 通过拇指和食指以向上轻柔挤压乳腺组织的方式，从一个乳头挤出乳汁，直至乳头充盈，然后轻轻滚动将乳汁挤出并流入 R2 手持的收集管中（见 图 2）。
- 注意：乳汁呈流状排出，因此 R2 必须正确放置收集管，以尽量减少甚至避免乳汁浪费。
- 麂的乳房分为四个象限。R1：持续从每个象限挤奶，直至乳汁不再容易流出。若某一乳头无法挤出乳汁，可先挤其他所有乳头后再返回处理该乳头。若某一乳头产奶量较多，可反复多次返回并持续从中挤奶，这种做法既可接受又具实用性。
4. 母鹿的麻醉逆转
在挤奶过程中，由咪达唑仑诱导的母羊开始苏醒是常见现象。在大多数情况下，母羊会在全部乳汁排出之前试图逃脱。此时可采用轻微的固定措施以提高产奶量；然而，研究人员和母羊的安全与舒适同样重要。
- 对于使用 BAM 麻醉的母鹿，皮下注射阿替美唑（atipamezole），剂量为每毫克美托咪定（medetomidine）对应 2.5 毫克，以实现快速逆转麻醉效果。
注意：无论使用哪种麻醉方式，都必须对母鹿进行密切观察，直至其能够独立行走而无跌倒或绊倒现象，并能安全进食和饮水，避免发生误吸或窒息风险。在采集乳汁后，未观察到对幼鹿哺乳能力产生任何不良影响。
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结果
小鼠
根据我们的实验，从一只实验小鼠中大约可收集到 100–400 μl 的乳汁，具体产量取决于多个变量。这些变量包括：1）用于采集的时间长短，2）给予的催产素剂量，3）母鼠当前哺育的幼崽数量，以及 4）分娩后的天数。我们的研究表明，当母鼠与其幼崽分离至少 2 小时，并且每只小鼠预留至少 45 分钟至 1 小时进行挤奶时，可获得最高产量。在分娩后第 8 至 12 天，使用 2 IU/kg 剂量的催产素可获得最大乳汁体积。我们的结果与其他研究基本一致，即窝仔数与乳汁产量呈正相关9（见图 3）。
麂
尽管从麂子采集的乳汁量每天各不相同，但我们能够根据所使用的麻醉剂及产后时间，每次每只母鹿采集到 5 至 30 ml 的乳汁。2（见表 1）。经咪达唑仑诱导的母鹿麻醉时间较短，仅维持约 10 分钟，因此采...
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讨论
小鼠
在采集小鼠乳汁时，需考虑多个因素，包括：1）预留的采集时间；2）给予的催产素剂量；3）母鼠当前哺育的幼崽数量；以及 4）采集时距离分娩已过去的时间。参考既往研究作为指导，我们旨在优化乳汁产量的采集条件。
既往研究已直接证实产奶量与窝仔数之间存在相关性8。遗憾的是，窝仔数是一个无法控制的变量。然而，分娩后挤奶的时间是可以控制的。根据《实验小鼠》（The Laboratory Mouse）的记载，分娩后第8至10天为乳汁分泌的高峰期9。我们的经验与此说法一致。
研究表明，催产素在产后乳汁分泌中发挥着不可替代的作用10。已有文献报道，为从啮齿类动物收集乳汁，使用的催产素剂量范围为0.1 IU/kg9至4 IU/kg66,7,9。在本研究中，我们首先尝试使用最低推荐剂量，即0.1 IU/kg<...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 #RAI093634A 资助。我们非常感谢 Jenny Powers 博士（兽医学博士，哲学博士）在饲养麂类动物及乳汁采集工作中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料—小鼠 | |||
| 氯胺酮（KetaVed 100 mg/ml）（剂量：80–100 mg/kg） | MWI/Vedco | 011075 | |
| 赛拉嗪（TranquiVed 100 mg/ml）（剂量：5–10 mg/kg） | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| 眼用润滑剂 | MWI/Apexa | 701013 | |
| 催产素（2 IU/kg） | Vet One | 501013 | |
| 材料—麂 | |||
| 咪达唑仑（1–2 mg/kg） | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | 可选：研究人员可单独使用咪达唑仑，或使用BAM组合（咪达唑仑、丁丙诺啡、阿扎哌隆）作为麻醉剂 |
| 酒石酸布托啡诺（Torbugesic）（0.45 mg/kg） | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| 酒石酸阿扎哌隆（0.25 mg/kg） | ZooPharm | ||
| 盐酸美托咪啶（0.07 mg/kg） | ZooPharm | ||
| 盐酸安替帕米唑（Antisedan）（剂量：0.25 mg/kg） | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| 催产素（10 IU/kg） | Vet One | 501013 | |
| 设备—小鼠 | |||
| P-200 移液器 | Gilson | F123601 | |
| 200 μl 移液器吸头 | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml 注射器 | MWI | 005427 | |
| 27 G 针头 | MWI | 002031 | |
| 设备—麂 | |||
| 15 ml 锥形管 | VWR | 21008-918 | |
| 22 G 针头 | MWI | 873 | |
| 3 ml 锁扣式注射器 | MWI | 001377 |
参考文献
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
- Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
- Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
- Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
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