使用荧光染料监测Streptococcus pneumoniae中的膜电位变化、膜完整性及细胞内离子浓度

摘要

与真核生物不同，目前关于细菌膜去极化及离子浓度变化的研究较少，这主要是由于细菌体积微小，使得传统的测量方法难以实施。本文详细介绍了利用荧光技术监测重要革兰氏阳性病原菌Streptococcus pneumoniae中此类事件的实验方案。

摘要

膜去极化与离子流是生物系统中被广泛研究的事件，因其能够深刻影响细胞功能，包括能量代谢和信号转导。尽管已有成熟的荧光和电生理方法（包括电极使用和膜片钳技术）用于检测真核细胞中的这些事件，但由于微生物体积微小，且细菌膜外具有更复杂的表面结构对细胞膜形成屏蔽，使得在微生物中检测类似事件的方法开发更具挑战性。在我们对死亡启动过程的研究中 肺炎链球菌 （肺炎链球菌），我们希望阐明膜事件的作用，包括膜电位、膜完整性和细胞内离子浓度的变化。查阅文献后发现，相关研究极为有限。其他研究者曾通过监测放射性同位素的摄取或平衡状态来测量离子流和膜电位，少数研究（主要集中在革兰氏阴性菌）曾成功使用羰花青类（carbocyanine）或氧杂醇类（oxonol）荧光染料检测膜电位，或利用细胞通透性的乙酰氧甲基（AM）酯形式的离子敏感性荧光指示剂染料对细菌进行负载。因此，我们建立并优化了用于革兰氏阳性菌中膜电位、膜破裂及离子转运检测的实验方案 S. pneumoniae 我们开发了使用双氧杂醇染料DiBAC的实验方案₄(3) 以及细胞非渗透性染料碘化丙啶，分别用于检测膜去极化和膜破裂，同时包括优化肺炎链球菌负载Fura-2、PBFI和BCECF的乙酰甲氧基酯（AM酯）染料的方法，以检测细胞内Ca²⁺、K⁺和pH的变化²⁺，K⁺，和 H⁺分别使用荧光检测酶标仪进行检测。这些方案是针对肺炎球菌的首类方法，且其中大多数染料尚未在其他任何细菌物种中使用过。尽管我们的方案已针对 S. pneumoniae我们相信，这些方法应为其他细菌物种的类似研究提供一个极佳的起点。

引言

本实验室从人乳中鉴定出一种名为HAMLET（人α-乳清蛋白肿瘤细胞杀伤复合物，Human Alpha-lactalbumin Made LEthal to Tumor cells）的蛋白-脂质复合物，该复合物可诱导肿瘤细胞发生凋亡，同时也能够杀灭多种细菌^1,2。研究发现，对HAMLET特别敏感的细菌主要是那些靶向呼吸道的物种，其中肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，即肺炎球菌）表现出最强的敏感性，并呈现一种类似凋亡的死亡表型^2,3。在真核细胞（尤其是线粒体）的凋亡过程中，膜去极化及特定离子转运事件已被广泛研究并被认为是关键步骤；放射性标记的TPP⁺离子以及JC-1和TMRE等荧光染料已被用于证实线粒体膜的去极化现象^3-5。因此，我们着手进一步探究HAMLET对肺炎球菌中这些膜相关特征的影响，旨在深入理解细菌中类似凋亡表型的作用机制，并在此过程中发掘新型抗菌疗法或疫苗候选分子的巨大潜力。

在建立机制研究方案的过程中，我们发现，与真核系统中已有详尽描述的方法相比，有关细菌膜电生理学及离子转运机制的已发表研究极为有限^6,7。这主要归因于微生物体积较小及其表面结构特点，尤其是细胞壁的存在，限制了常规真核细胞技术（如膜片钳）对膜的可及性；尽管已有部分研究尝试使用巨型原生质体并取得不同程度的成功^8,9。由于巨型原生质体的操作方法要求细菌处于非自然且无生命的异常状态，对于大多数细菌种类而言既不理想也不具备实用性，因此目前已开展的细菌膜电位研究主要依赖流式细胞术，并使用氰染料和氧醇类荧光染料进行检测^10-16。

我们选择使用荧光检测酶标仪，而非流式细胞术，来检测96孔板中细菌悬液随时间变化的荧光强度。流式细胞术仅能在单一时间点对单个细菌进行荧光信号采集，而本方法使我们能够以更简便、更高效的方式对细菌群体在多个时间点进行处理，并长时间连续监测整个群体的荧光动力学变化，这是流式细胞术难以实现的。在测试了多种膜电位敏感型荧光染料（包括上述用于线粒体检测的染料）后，我们发现使用双苯并恶唑染料DiBAC₄(3)（双-(1,3-二丁基巴比妥酸)三甲川恶唑）在监测极性变化方面取得了最佳的技术效果和操作可行性。

我们还发现，使用碘化丙啶（propidium iodide, PI）同时监测细胞膜完整性的破坏具有重要价值。该染料在结合核酸时会产生荧光，但只有当细菌膜完整性受损时才能进入细胞并结合核酸，因此PI常被用于活-死染色实验中检测死亡细胞。除PI外，SYTOX Green和TO-PRO-1也是作用机制相似的荧光染料，已有少数研究在流式细胞术检测方法中将其用于细菌检测¹⁷。我们选择使用PI，是因为其激发波长允许我们在同一样本中同时监测PI与DiBAC的荧光信号。

在我们的研究中观察到，HAMLET 以及另一种具有杀菌活性的相关蛋白-脂质复合物 ELOA 均可诱导肺炎链球菌细胞膜去极化并导致膜破裂，这表现为两种染料在处理肺炎链球菌后荧光信号均增强^3,18,26。对于这两种复合物，我们均发现 DiBAC₄(3) 的荧光强度增加早于 PI 荧光强度的上升，表明去极化发生在膜破裂之前，因此是这些目标杀菌性蛋白-脂质复合物所特异性诱导的事件。明确这一顺序至关重要，因为膜破裂本身即可引起非特异性的去极化。同时测量并分析 DiBAC₄(3) 与 PI 的荧光动力学，使我们能够探究这两种膜事件之间的关系，这也是采用荧光光度法而非流式细胞术的额外优势。

为了监测细菌离子流，此前已有一些使用放射性同位素的成功案例，包括利用⁴⁵Ca²⁺测定肺炎链球菌的离子摄取量^19,20，我们在最近的研究中也采用了该方法^18,21。然而，使用这些放射性离子存在若干缺点：成本高昂、耗时较长、操作繁琐，并且可能使实验操作人员暴露于危害之中，具体风险取决于所使用的同位素种类。此外，该方法难以实时监测离子浓度的快速动态变化。因此，我们转向了一种替代性检测方法，即采用乙酰氧基甲基（AM）酯形式的离子敏感型荧光指示剂染料。指示剂染料本身带电，难以穿过细胞膜；但当引入疏水性酯基团后，该分子变为电中性，因而能够顺利穿过细菌细胞膜。进入细胞内部后，细菌的酯酶会水解酯基团，使染料在细胞内释放并重新带电，从而显著减缓其外排速度，使染料在细胞内逐渐积累。然而，目前仅在少数细菌物种中报道过此类酯类染料的应用，用于检测细胞内Ca^{2+ 22-24}和H^{+ 16}的变化，且在染料加载、检测方法及实验成功率方面存在较大差异。

希望监测细胞内Ca²⁺水平的变化²⁺ 以及 K⁺ 和 H⁺ 水平在 S. pneumoniae 在使用 HAMLET 及其他化合物处理后，我们成功建立了高效将荧光指示染料载入细菌细胞的实验方案。有效载入细菌需要 probenecid 和 PowerLoad 共同作用：probenecid 通过阻断阴离子转运体以增强染料滞留，PowerLoad 是 Life Technologies 公司的一种专有化合物，可提高载入效率。Fura-2/AM（用于检测 Ca²⁺)，PBFI/AM（用于检测K⁺），以及 BCECF/AM（用于检测 H⁺) 成功导入无荚膜和有荚膜的肺炎链球菌菌株中，从而实现了  添加离子霉素（ionomycin，Ca²⁺）等离子载体后，对产生的荧光模式进行测量²⁺ 解偶联剂），缬氨霉素（K⁺ 解偶联剂）和CCCP（H⁺ 解偶联剂）使用荧光检测酶标仪^18,21.

方案

1. 准备细菌 培养物

1. 实验用培养物的培养
   1. 在37 °C的加热块中解冻一管冻存的S. pneumoniae，将内容物加入含有0.5%酵母提取物（THY）的9 ml新鲜预热的Todd-Hewitt肉汤中，总体积为10 ml，置于玻璃培养管中。
   2. 在37 °C静置培养，直至培养物达到对数中期（Abs_600nm ≈0.5–0.6）。

2. 检测膜去极化与破裂

1. 准备试剂
   1. 用100% DMSO配制50 µM DiBAC₄(3)储备液，用ddH₂O配制2 mg/ml PI储备液。DiBAC₄(3)储备液在-20 °C下至少可稳定保存6个月。PI储备液在4 °C下至少可稳定保存6个月。
   2. 用铝箔包裹储备液，避免光照。
2. 加载细菌
   1. 将1.2.2步骤中的细菌细胞在室温下以2,400 x g离心10分钟收集菌体，弃上清，用10 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬菌体，混匀后再次以2,400 x g离心10分钟，重复此洗涤步骤共两次。
   2. 弃去上清液，将菌体沉淀用PBS重悬至原始体积，使细菌浓度约为每毫升10⁸个菌落形成单位。取1 ml洗涤后的菌液（足够进行5个样品），转移至微量离心管中。
   3. 向上述菌液中加入25 µl 1 M葡萄糖滤菌溶液（用ddH₂O配制，并通过0.45 µm滤器过滤），使终浓度为25 mM葡萄糖，然后在37 °C加热模块中孵育15分钟。注：此步骤可为所有ATP依赖性膜通道及细胞组分提供能量，是否需要此步骤取决于具体实验设计。
   4. 加入5 µl 50 µM DiBAC₄(3)储备液和10 µl 2 mg/ml PI储备液，使终浓度分别为250 nM和20 µg/ml。用移液器反复吹打数次以充分混匀。将200 µl 该细胞悬液加入透明96孔板的每个样品孔中。
3. 检测荧光
   1. 将96孔板放入已预热至37 °C的荧光检测仪中。
   2. 确保仪器中已安装适用于DiBAC₄(3)（激发波长490 nm，发射波长516 nm）和PI（激发波长535 nm，发射波长617 nm）检测的滤光片。
   3. 为允许DiBAC₄(3)在膜上达到平衡并同时监测其过程，设置仪器每隔1分钟采集一次荧光信号，持续约30–40分钟，或直至读数稳定；此阶段作为“预处理”读数。
   4. 取出96孔板，加入选定的实验处理剂，立即放回检测仪中，继续监测DiBAC₄(3)和PI荧光信号，持续至所需时间。若同时处理多个样品，可使用多通道移液器同时向所有孔中加样，以提高一致性。
   5. 将数据导出至数据分析软件（如Microsoft Excel），绘制荧光强度随时间变化的曲线，以评估细胞膜去极化和破裂情况。DiBAC和PI荧光强度的上升表明膜去极化和破裂正在发生。

3. 检测细胞内 Ca²⁺ 或 K⁺ 浓度的变化

1. 配制试剂与上样缓冲液
   1. 配制以下试剂：5 mM 的离子敏感型荧光染料储备液（Fura-2/AM 或 PBFI/AM；将适量 DMSO 加入含有 50 µg 染料的离心管中），“100倍”丙磺舒溶液（将 1 ml PBS 加入含 77 mg 丙磺舒的西林瓶中）。溶解后的染料可于 -20 °C 冻存一次，溶液中可稳定保存 3 个月；丙磺舒溶液在 -20 °C 下可稳定保存 6 个月。
   2. 按以下方法配制 1 ml 的 2倍上样缓冲液：取一个 15 ml 塑料锥形管，先在管底加入 20 µl 100倍 PowerLoad 浓缩液（2–8 °C 下可稳定保存 6 个月），随后直接向 PowerLoad 中加入 2 µl 5 mM 离子敏感型荧光染料。短暂涡旋混匀。接着加入 960 µl PBS，再加入 20 µl 100倍丙磺舒溶液。最后再涡旋混匀一次。用铝箔包裹以避光。
2. 将染料加载至细菌中
   1. 按 2.2.1 步骤所述，离心收集并清洗处于对数中期的细菌培养物。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于 5 ml PBS 中，制成“2倍”细胞悬液。
   2. 取 1 ml 上述 2倍细胞悬液加入 2倍上样缓冲液中。最终体积为 2 ml，其中 PowerLoad 为 1倍、荧光染料终浓度为 5 µM、丙磺舒为 1倍。注：此悬液总体积足以进行 10 个样品的检测，因每个检测孔需加入 200 µl。
   3. 避光条件下于 37 °C 水浴中孵育 75 分钟。注：在无糖酵解底物存在、且含丙磺舒的条件下进行染料加载，以最大限度减少染料外排。
   4. 洗涤 1： 在 2,400 × g 条件下离心 10 分钟以收集细胞，弃去上清液，将细胞重悬于含 1倍丙磺舒的 2 ml PBS 中。洗涤 2、3： 重复步骤 3.2.4 两次。于 37 °C 继续孵育 30 分钟。此步骤 可为细菌酯酶提供足够时间，使其水解细胞内荧光染料的 AM 酯基团。
   5. 洗涤 4：在 2,400 × g 条件下离心 10 分钟以收集细胞，弃去上清液，将细胞重悬于含 1倍丙磺舒的 2 ml PBS 中。注：根据实验需要，可在此步骤中重新加入葡萄糖以恢复细菌能量状态。
3. 荧光检测
   1. 将荧光检测酶标仪预热至 37 °C。
   2. 对每个待测样品，取 200 µl 已加载染料的细胞（来自步骤 3.2.8）加入 96 孔板的孔中。（以下操作应逐孔/逐样品依次完成）。
   3. 为建立某孔的基线读数，将酶标板放入荧光检测酶标仪中，每秒测量一次荧光值，持续 1 分钟（“值 1”为 340 nm 激发 / 510 nm 发射，“值 2”为 380 nm 激发 / 510 nm 发射）。
   4. 取出酶标板，向该孔中加入选定的处理试剂（体积约 5 µl），快速吹打混匀数次，立即放回荧光检测酶标仪中，按所需时长每秒连续读数。（若酶标仪配有自动进样器，也可使用该装置无缝添加处理试剂，无需中断读数或取出酶标板）。
   5. 将读数导出至数据分析软件（如 Microsoft Excel）。通过将“值 1”除以“值 2”计算每个时间点的荧光比值，并将比值绘制成曲线图。

4. 检测细胞内pH值的变化

1. 配制试剂和校准缓冲液
   1. 配制以下试剂：5 mM BCECF/AM 储液（向含有 50 µg 染料的离心管中加入适量 DMSO。该储液在 -20 °C 下可稳定保存 3 个月）；100 倍普鲁本辛溶液（向含有 77 mg 的试剂瓶中加入 1 ml PBS）；1 mM 尼日里菌素乙醇储液（用于平衡细胞内 pH（pH­_i细胞的数量 ­至周围缓冲液的pH值。该储备液在-20 °C下可稳定保存6个月）；0.5 mM的羰基氰化物-3-氯苯腙（CCCP）DMSO储备液（用于解偶联质子驱动力的质子载体。该储备液在-20 °C下可稳定保存6个月）
   2. 配制10 ml以下高钾缓冲液：135 mM KH₂PO₄ / 20 mM NaOH（一元碱）和 110 mM K₂HPO₄ / 20 mM NaOH（二碱基）。使用0.45 µm滤器过滤除菌。（这些缓冲液可保存在4 °C，直至使用）。
   3. 按所需比例混合高钾缓冲液，配制至少5-6种pH值在6.5至8.0范围内的高钾缓冲液。
   4. 按如下步骤制备1 ml 2×上样缓冲液：在15 ml塑料锥形管底部加入40 µl 100倍 PowerLoad，随后加入 20 µl 将5 mM的离子敏感性染料直接加入PowerLoad中，短暂涡旋混匀。加入900 µl PBS 后接 40 µl 加入100倍浓度的丙磺舒，最后涡旋混合一次。用铝箔包裹以避光。
2. 用染料标记细菌
   1. 离心收集8 ml对数中期的细菌培养物，并按2.2.1节所述方法洗涤。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于2 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中，制成“4倍浓度”（4x）的细胞悬液。
   2. 加入 1 ml 的 4x 细胞悬液加入至2x 上样缓冲液。这将提供 2 ml 的终体积，以及 2x 的终浓度 细胞，2x PowerLoad、50 µM 荧光染料和 2x 丙磺舒。
   3. 在30 °C水浴中避光孵育40分钟。注意：在较低温度（30 °C）且无任何糖酵解底物的条件下，将染料加载至细菌细胞内，以尽量减少染料外排。
   4. WASH 1：  通过离心（2,400 × g，10 分钟）沉淀细胞，弃去上清液以去除过量染料，然后将细胞重悬于 4 ml 含 2× 丙磺舒和 1 mM 葡萄糖的 PBS 中（以重新激活细菌）。洗涤 2、3：  重复步骤 4.2.7 两次，最后重悬于 4 ml 中 PBS（用于配制终浓度为1x） 含2倍丙磺舒和10 mM葡萄糖的细胞。
   5. 在37 °C下孵育5分钟。此步骤可使细胞充分活化，并为细菌酯酶提供足够时间，以切除被内化BCECF上的AM酯基团。
3. 建立背景荧光 体内 标准曲线
   1. 将荧光检测板式读数仪预热至 37 °C。
   2. 为确定背景荧光，过滤除菌约 500 µl 去除已加载并激活的细菌悬液（来自步骤 4.2.7）中的细菌，并加入 200 µl 将滤液加入96孔板的孔中。
   3. 将培养板放入荧光检测酶标仪中，测量荧光值（“Value 1”为490 nm激发/530 nm发射，“Value 2”为440 nm激发/530 nm发射），持续1分钟。该背景荧光值应在计算标准曲线和实验样品的比值之前予以扣除。
   4. 为了获得一个 体内 标准曲线，洗涤 500 µl 将步骤4.2.7中已加载并激活的细胞等分试样取一次，重悬于不同pH值（范围为6.5–8.0）的高钾缓冲液中。
   5. 加入20 µM 尼日里菌素（nigericin），使细胞内pH与周围缓冲液的pH达到平衡，37 °C孵育5 min。加入200 µl 将不同细菌/pH缓冲液组合加入96孔板的各孔中。
   6. 将培养板放入荧光检测酶标仪中，测量数分钟以获得每个孔的稳定荧光读数。将读数导出至数据分析软件（如 Microsoft Excel）。
   7. 扣除背景荧光值后，将值1除以值2，计算荧光值的比值。将每种pH缓冲液对应的比值绘制成图，以生成校准曲线。（每次使用新一批加载的细胞时均应生成校准曲线，因为每次细菌加载的荧光染料量可能有所不同。）
4. 测量细胞内pH值的变化
   1. 对于每个所需样品，加入 200 µl 将已加载并激活的细胞（来自步骤4.2.7）加入96孔板的孔中。
   2. 将培养板放入荧光检测酶标仪中，每5秒测量一次样品荧光值，持续5分钟。
   3. 取出培养板，向其中一个孔加入10 µM CCCP（作为降低细胞内pH的阳性对照），向其余孔加入目标实验试剂。为准确比较其随时间变化的效应，应使用多通道移液器同时向各孔加入CCCP和所选试剂。
   4. 立即将培养板放回酶标仪中，继续以每5秒一次的频率测量荧光，持续10分钟。作为额外对照，取出培养板并向所有样品中加入20 µM 尼日里菌素（Nigericin），以平衡pH­_i 细菌的 ­至缓冲液的pH值，并读取5分钟。
   5. 扣除背景荧光值后，计算各样本的荧光比值。通过插值法确定pH_i 校准曲线每次读数的相应值。

结果

在所有实验中，每个孔内均含有一个样本和一组特定条件。因此，每条曲线代表了随时间变化的整个细菌群体的荧光强度。实验结果应易于解读，处理样本与未处理对照样本的荧光信号之间应有明显区别。所观察到的荧光变化的动力学特征及其变化程度，可为正在监测的生物学事件的可能机制和影响范围提供信息。

在研究膜电位时，需要将细菌与DiBAC共同孵育约40分钟，以使染料在膜上达到平衡，这一点可通过处理前图1A中荧光信号持续下降并随后趋于平稳来确认。如图1B所示，PI不需要平衡过程，因其荧光信号在最初40分钟孵育期间保持稳定；但PI与DiBAC同时存在有助于同步监测膜破裂与膜电位变化。两种染料荧光强度的升高表明细菌发生了去极化和膜破裂。其他能够引起去极化和膜破裂的试剂，例如去垢剂（脱氧胆酸钠¹⁸）、解偶联剂或离子载体（CCCP），也可加入以通过该方法演示这些现象。

对于 Fura-2/AM、PBFI/AM 和 BCECF/AM，计算两种荧光信号的比...

讨论

尽管细菌体积微小，限制了传统电生理学方法在检测细菌膜电位与膜完整性变化以及胞内离子浓度变化方面的应用，但我们已描述了一种利用荧光染料检测S. pneumoniae中这些事件的方法。我们的实验方案是肺炎链球菌中首次报道的同类方法，也是目前针对细菌物种所建立的极少数方法之一。通过使用荧光检测酶标仪，可在体积仅为200 µl 的细菌样品中，对细菌群体随时间变化的荧光信号进行实时监测。荧光强度的动力学变化可用于定性判断细菌膜电位或膜完整性的改变，以及胞内Ca²⁺、K⁺或H⁺水平的变化情况。从定量角度而言，荧光强度数据还可用于计算相对于对照样本的去极化程度、膜破裂程度、钙离子摄取量、钾离子外流水平或pH值变化，从而为相关作用机制提供关键信息。此外，本方案也可作为加载其他乙酰甲酯（AM）类荧光染料的起始参考，有助于在多种细菌物种中研究其他各类细胞事件。我们已成功将部分本方案应用于Staphylococcus aureus²¹的研究中。

使用 AM 染料时，充分的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Todd-Hewitt 肉汤	Bacto, BD 诊断	249240
酵母提取物	Bacto, BD 诊断	212750
磷酸盐缓冲液 (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (双-(1,3-二丁基巴比妥酸)三甲川氧杂吲哚)	Molecular Probes	B-438
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	P4170	用去离子水配制
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100 倍浓缩液
丙磺舒	Molecular Probes	P36400	向一支 77 mg 的小瓶中加入 1 ml PBS 配制成 100 倍储备液
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	特殊包装 (50 µg 分装)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	特殊包装 (50 µg 分装)
尼日尔菌素	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	一碱式
NaOH	JT Baker	5565-01
K2HPO4	JT Baker	4012-01	二碱式
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	特殊包装 (50 µg 分装)
CCCP	Sigma-Aldrich		质子载体，可导致 H+ 进入细胞质，消散膜电位和 H+ 梯度
培养管	VWR	53283-802	适用于 Spectronic 分光光度计；硼硅酸盐玻璃
分光光度计	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml 塑料锥形管	Corning	430790
透明 96 孔聚苯乙烯微孔板	Fisher Scientific	12-565-501
酶标仪	BioTek	Synergy 2 多功能
Gen5 软件	BioTek	Gen5™ 软件