使用荧光染料监测Streptococcus pneumoniae中的膜电位变化、膜完整性及细胞内离子浓度

摘要

与真核生物不同，目前关于细菌膜去极化及离子浓度变化的研究较少，这主要是由于细菌体积微小，使得传统的测量方法难以实施。本文详细介绍了利用荧光技术监测重要革兰氏阳性病原菌Streptococcus pneumoniae中此类事件的实验方案。

摘要

膜去极化与离子流是生物系统中被广泛研究的事件，因其能够深刻影响细胞功能，包括能量代谢和信号转导。尽管已有成熟的荧光和电生理方法（包括电极使用和膜片钳技术）用于检测真核细胞中的这些事件，但由于微生物体积微小，且细菌膜外具有更复杂的表面结构对细胞膜形成屏蔽，使得在微生物中检测类似事件的方法开发更具挑战性。在我们对死亡启动过程的研究中 肺炎链球菌 （肺炎链球菌），我们希望阐明膜事件的作用，包括膜电位、膜完整性和细胞内离子浓度的变化。查阅文献后发现，相关研究极为有限。其他研究者曾通过监测放射性同位素的摄取或平衡状态来测量离子流和膜电位，少数研究（主要集中在革兰氏阴性菌）曾成功使用羰花青类（carbocyanine）或氧杂醇类（oxonol）荧光染料检测膜电位，或利用细胞通透性的乙酰氧甲基（AM）酯形式的离子敏感性荧光指示剂染料对细菌进行负载。因此，我们建立并优化了用于革兰氏阳性菌中膜电位、膜破裂及离子转运检测的实验方案 S. pneumoniae 我们开发了使用双氧杂醇染料DiBAC的实验方案₄(3) 以及细胞非渗透性染料碘化丙啶，分别用于检测膜去极化和膜破裂，同时包括优化肺炎链球菌负载Fura-2、PBFI和BCECF的乙酰甲氧基酯（AM酯）染料的方法，以检测细胞内Ca²⁺、K⁺和pH的变化²⁺，K⁺，和 H⁺分别使用荧光检测酶标仪进行检测。这些方案是针对肺炎球菌的首类方法，且其中大多数染料尚未在其他任何细菌物种中使用过。尽管我们的方案已针对 S. pneumoniae我们相信，这些方法应为其他细菌物种的类似研究提供一个极佳的起点。

引言

本实验室从人乳中鉴定出一种名为HAMLET（人α-乳清蛋白肿瘤细胞杀伤复合物，Human Alpha-lactalbumin Made LEthal to Tumor cells）的蛋白-脂质复合物，该复合物可诱导肿瘤细胞发生凋亡，同时也能够杀灭多种细菌^1,2。研究发现，对HAMLET特别敏感的细菌主要是那些靶向呼吸道的物种，其中肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，即肺炎球菌）表现出最强的敏感性，并呈现一种类似凋亡的死亡表型^2,3。在真核细胞（尤其是线粒体）的凋亡过程中，膜去极化及特定离子转运事件已被广泛研究并被认为是关键步骤；放射性标记的TPP⁺离子以及JC-1和TMRE等荧光染料已被用于证实线粒体膜的去极化现象^3-5。因此，我们着手进一步探究HAMLET对肺炎球菌中这些膜相关特征的影响，旨在深入理解细菌中类似凋亡表型的作用机制，并在此过程中发掘新型抗菌疗法或疫苗候选分子的巨大潜力。

在建立机制研究方案的过程中，我们发现，与真核系统中已有详尽描述的方法相比，有关细菌膜电生理学及离子转运机制的已发表研究极为有限^6,7。这主要归因于微生物体积较小及其表面结构特点，尤其是细胞壁的存在，限制了常规真核细胞技术（如膜片钳）对膜的可及性；尽管已有部分研究尝试使用巨型原生质体并取得不同程度的成功^8,9。由于巨型原生....

方案

1. 准备细菌 培养物

1. 实验用培养物的培养
   1. 在37 °C的加热块中解冻一管冻存的S. pneumoniae，将内容物加入含有0.5%酵母提取物（THY）的9 ml新鲜预热的Todd-Hewitt肉汤中，总体积为10 ml，置于玻璃培养管中。
   2. 在37 °C静置培养，直至培养物达到对数中期（Abs_600nm ≈0.5–0.6）。

2. 检测膜去极化与破裂

1. 准备试剂
   1. 用100% DMSO配制50 µM DiBAC₄(3)储备液，用ddH₂O配制2 mg/ml PI储备液。DiBAC₄(3)储备液在-20 °C下至少可稳定保存6个月。PI储备液在4 °C下至少可稳定保存6个月。
   2. 用铝箔包裹储备液，避免光照。
2. 加载细菌
   1. 将1.2.2步骤中的细菌细胞在室温下以2,400 x g离心10分钟收集菌体，弃上清，用10 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬菌体，混匀后再次以2,400 x g离心10分钟，重复此洗涤步骤共两次。

结果

所有实验中，每个孔内均含有一个样本和一组特定条件。因此，每条曲线代表随时间变化的整个细菌群体的荧光强度。结果应易于解读，处理样本与未处理对照样本的荧光信号之间应有明显区别。所观察到的荧光变化的动力学特征及其程度，可为被监测事件的可能机制和影响范围提供信息。

在研究膜电位时，需要将细菌与DiBAC共同孵育约40分钟，以使染料在膜上达到平衡，这一点可由处理前图1A中荧光信号持续下降并随后趋于平稳的现象表明。如图1B所示，PI不需要平衡过程，因其荧光信号在前40分钟孵育期间保持稳定；但PI与DiBAC同时使用有助于在监测膜电位的同时实时观察膜破裂情况。两种染料荧光强度的升高表明细菌发生了去极化和膜破裂。其他能够引起去极化和膜破裂的试剂，如去垢剂（脱氧胆酸钠¹⁸）、解偶联剂或离子载体（CCCP），也可加入以利用该方法演示这些事件。

对于 Fura-2/AM、PBFI/AM 和 BCECF/AM，计算两种荧光信号的比值，该比值的升.......

讨论

尽管细菌体积微小，限制了传统电生理学方法在检测细菌膜电位与膜完整性变化以及胞内离子浓度变化方面的应用，但我们已描述了一种利用荧光染料检测S. pneumoniae中这些事件的方法。我们的实验方案是肺炎链球菌中首次报道的同类方法，也是目前针对细菌物种所建立的极少数方法之一。通过使用荧光检测酶标仪，可在体积仅为200 µl 的细菌样品中，对细菌群体随时间变化的荧光信号进行实时监测。荧光强度的动力学变化可用于定性判断细菌膜电位或膜完整性的改变，以及胞内Ca²⁺、K⁺或H⁺水平的变化情况。从定量角度而言，荧光强度数据还可用于计算相对于对照样本的去极化程度、膜破裂程度、钙离子摄取量、钾离子外流水平或pH值变化，从而为相关作用机制提供关键信息。此外，本方案也可作为加载其他乙酰甲酯（AM）类荧光染料的起始参考，有助于在多种细菌物种中研究其他各类细胞事件。我们已成功将部分本方案应用于Staphylococcus aureus²¹的研究中。

使用 AM 染料时，充分的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Todd-Hewitt 肉汤	Bacto, BD 诊断	249240
酵母提取物	Bacto, BD 诊断	212750
磷酸盐缓冲液 (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (双-(1,3-二丁基巴比妥酸)三甲川氧杂吲哚)	Molecular Probes	B-438
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	P4170	用去离子水配制
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100 倍浓缩液
丙磺舒	Molecular Probes	P36400	向一支 77 mg 的小瓶中加入 1 ml PBS 配制成 100 倍储备液
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	特殊包装 (50 µg 分装)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	特殊包装 (50 µg 分装)
尼日尔菌素	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	一碱式
NaOH	JT Baker	5565-01
K2HPO4	JT Baker	4012-01	二碱式
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	特殊包装 (50 µg 分装)
CCCP	Sigma-Aldrich		质子载体，可导致 H+ 进入细胞质，消散膜电位和 H+ 梯度
培养管	VWR	53283-802	适用于 Spectronic 分光光度计；硼硅酸盐玻璃
分光光度计	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml 塑料锥形管	Corning	430790
透明 96 孔聚苯乙烯微孔板	Fisher Scientific	12-565-501
酶标仪	BioTek	Synergy 2 多功能
Gen5 软件	BioTek	Gen5™ 软件