我们介绍一种新型聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基-PAAm，可实现细胞外基质蛋白的直接结合，且成本低廉、操作简便。将羟基-PAAm水凝胶与微接触印刷技术结合，可独立调控天然细胞微环境中的多种信号，从而用于研究细胞力学转导。
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摘要
摘要
目前已有充分证据表明，许多细胞功能受到细胞与其细胞外基质（ECM）环境的理化和力学信号相互作用的调控。真核细胞通过细胞表面的机械感受器持续感知其局部微环境，将ECM的物理变化转化为生化信号，并整合这些信号以实现特定的基因表达改变。有趣的是，ECM的理化参数与力学参数可相互耦合，共同调控细胞命运。因此，理解机械转导机制的关键在于解析ECM信号对细胞功能的相对贡献，即实现各种ECM线索的解耦。
本文介绍了一种详细的实验方案，可快速、简便地制备具有生物学相关性的水凝胶，用于独立调控机械转导信号 体外我们通过在聚合过程中引入带有羟基官能团的丙烯酰胺单体，对聚丙烯酰胺水凝胶（PAAm）进行化学修饰，从而克服其固有的非黏附性。由此获得了一种新型PAAm水凝胶，称为羟基化-PAAm（hydroxy-PAAm），可实现任意所需类型细胞外基质（ECM）蛋白的固定化。将羟基化-PAAm水凝胶与微接触印刷技术相结合，能够独立调控单细胞形态、基质刚度、ECM蛋白的种类及其密度。我们提供了一种简单且快速的方法，可在任何生物学实验室中建立，用于研究 体外 细胞机械转导过程。我们通过在内皮细胞上进行实验，验证了这一新型二维平台，实验结果证明了细胞外基质刚度与细胞核之间存在机械耦合。
引言
局部细胞微环境的诸多方面（例如，刚度、孔径大小、蛋白质性质或细胞-配体密度）提供了一组协调的调控信号，控制细胞运动、增殖、分化和基因表达等细胞过程。细胞可感知细胞外环境理化性质的改变，并引发不同的生理后果，包括细胞极性变形、迁移和分化。然而，目前尚不清楚细胞如何将细胞外基质（ECM）的改变转化为细胞内的生化信号。因此，构建可控的 体外 能够重现细胞与其微环境之间相互作用的微环境，用于研究机械转导通路。为解决这一问题，我们近期提出了一种新方法1称为羟基-PAAm水凝胶，可轻松制备二维软基质，从而独立调控重要的机械转导信号：基质刚度、细胞形态与限域性、蛋白质种类以及细胞配体密度。
细胞外基质（ECM）通过形态发生素梯度（化学趋向性）、黏附蛋白梯度（黏附趋向性）以及刚度梯度（硬度趋向性）来调控细胞的各种生物学过程。在过去的几十年中，研究人员开发了多种先进的体外（in vitro）研究平台，用以分离这些细胞外信号，从而解析细胞如何将生化和生物物理特征转化为生理活动2-5。人们已开发出电子束光刻6、光刻技术7、光化学固定化8以及等离子体辅助技术9，以引导活细胞在微图案化基底上的生长。尽管这些技术已取得重要成果，但其中大多数方法难以区分不同信号对细胞行为的独立影响，且需要昂贵的技术设备，仅有少数实验室能够....
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方案
1. 活化玻璃盖玻片表面
- 将玻璃圆形盖玻片（直径 25 mm）放入培养皿中，并涂抹 0.1 M NaOH 溶液处理 5 分钟 （建议在化学通风橱中操作）。
- 去除 NaOH 溶液，加入无菌 ddH2O 完全浸没盖玻片，在无菌培养罩内轻轻振荡孵育 20 分钟 。
- 倒掉无菌 ddH2O，并重复步骤 1.2。
- 用无菌镊子取出盖玻片，转移至新的培养皿中，确保活化面朝上放置。
- 用高纯度氮气持续吹扫，干燥盖玻片。
- 在无菌培养罩内，将一层薄薄的 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯（92%）均匀涂抹于盖玻片的活化表面，反应 1 小时。
- 用无菌 ddH2O 对玻璃盖玻片进行充分洗涤，共洗涤 3 次，然后将其浸入新培养皿的无菌 ddH2O 中。
- 用 Parafilm 封住培养皿，置于摇床上轻柔振荡 10 分钟。
- 用尖头无菌镊子从 ddH2O 中取出盖玻片，转移至新的培养皿中，确保活化面朝上。
- 在室温下干燥避尘处保存，并用铝箔包裹以防止灰尘附着。
2. 羟基-PAAm 水凝胶的制备
- 在1.5 ml 离心管中称取6....
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结果
图1A 展示了丙烯酰胺（AAm）和双丙烯酰胺（bis-AAm）与含有伯羟基的N-羟乙基丙烯酰胺（HEA）单体通过随机自由基共聚反应，形成带有嵌入式羟基的亲水性聚丙烯酰胺网络（羟基化PAAm）。在本实验方案中，需将65 mg的HEA溶解于1 ml HEPES缓冲液中。由于HEA的密度约为1，我们假设最终工作体积为1,065 µl（HEA + HEPES）。如表1所示，将1,065 µl的上述溶液加入400 µl AAm和50 µl bisAAm中，总体积为1,515 µl。因此，需加入3,485 µl的HEPES缓冲液，以将溶液总体积调节至5 ml。如步骤2.6所述，22 mm玻璃盖玻片表面需在紫外/臭氧（UV/Ozone）中活化7分钟，以便在不损伤水凝胶表面的前提下将其去除。事实上，经过UV/Ozone处理后，玻璃表面亲水性增强，因此可通过将整个体系浸入水中实现轻松分离。此外，UV/Ozone处理还可防止与水凝胶表面直接接触的22 mm盖玻片发生化学污染。该技术可获得固定于25 mm直径玻璃盖玻片上的平整圆形聚丙烯酰胺表面（直径22 mm）。
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讨论
现代细胞生物学中的许多体外（in vitro）观察实验通常是在刚性玻璃盖玻片上进行的，这些盖玻片通常涂有一层含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的细胞外基质（ECM）蛋白或合成肽。然而，这类基本培养基质无法重现ECM完整的理化复杂性，因此不能为研究细胞力学转导过程提供准确的模型。为解决这一问题，我们提出一种简单的方法，可在二维水凝胶上以任意数量和种类固定ECM蛋白。该方法可独立调控影响力学转导的关键因素，例如基质刚度、细胞形态与空间限制，以及细胞-配体密度。此外，羟基化聚丙烯酰胺（hydroxy-PAAm）水凝胶克服了现有功能化方法的一个主要局限，即难以固定并控制多种ECM蛋白的空间分布。由于hydroxy-PAAm水凝胶对生物分子具有高亲和力，因此可通过连续微图案化技术，在同一表面上精确调控多种ECM蛋白的空间分布，且该过程不受基质刚度影响，也无需额外设备。
我们提出一种基于在丙烯酰胺水凝胶中引入羟基的新方法，以克服其固有的非黏附特性，同时对成本和专业技术要求极低。与现有的在水凝胶上进行蛋白图案化技术相比，羟基化聚丙烯酰胺（hydroxy-PAAm）方法避.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由比利时国家科学研究中心（F.R.S.-FNRS）通过“MIS 共聚焦显微镜”项目、“研究人员启动基金”（Crédit aux Chercheurs）以及“纳米运动性 FRFC 项目”（编号：2.4622.11）提供资助。T.G. 的博士研究生奖学金由农业与工业研究培训基金会（FRIA）支持。作者衷心感谢 Sylvain Desprez 在力学表征方面的贡献，以及 Géraldine Circelli 在共聚焦成像方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 紫外/臭氧光反应器 | Ultra-Violet Products | 型号 PR-100 | |
| 摇床 | IKAcWerke | 型号 KS 130 Basic | |
| 涡旋振荡器 | Scientific Industries | 型号 Vortex Genie2 | |
| 真空脱气室 | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm 封口膜 | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| 细尖不锈钢镊子 | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| 敷料组织镊 | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| 聚苯乙烯培养皿 | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| 铝箔，厚度 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore 膜滤器（孔径 0.2 µm） | Millipore | GTTP 滤器编号 | |
| 圆形玻璃盖玻片（直径 22 mm） | Neuvitro | GG-22 | |
| 圆形玻璃盖玻片（直径 25 mm） | Neuvitro | GG-25 | |
| 可调体积微量移液器 | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| 蛋白微量离心管 | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| 手术刀柄 | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| 手术刀片 | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| 细胞培养瓶（75 cm2） | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| 超声波清洗槽，实心（不锈钢） | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| 聚二甲基硅氧烷 | Dow Corning | Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒 | |
| 丙烯酰胺（粉末） | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-羟乙基丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| 过硫酸铵（APS） | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯 | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| 人血浆纤连蛋白 | Millipore | FC010 | |
| 来自 EHS 的层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| 双蒸水（ddH2O） | |||
| 内皮细胞生长培养基 | Cells Applications | 211K-500 | |
| 人脐静脉内皮细胞（HUVEC） | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES 缓冲液，1 M 水溶液（H2O） | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| 抗生素-抗真菌剂 | PAA laboratories | P11-002 | |
| 磷酸盐缓冲液 | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 标记鬼笔环肽 | Molecular Probes | A12379 | |
| 小鼠来源的抗连环蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| 山羊抗小鼠抗体-四甲基罗丹明 | Molecular Probes | T-2762 | |
| 抗纤连蛋白抗体（兔源） | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| 链霉亲和素 | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| 抗层粘连蛋白抗体（兔源） | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| 抗兔 IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| 无水乙醇 | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
参考文献
- Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
- Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O.
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重印与许可
